專利名稱：：用于小麥白粉病抗病基因PmHNK輔助選擇的分子標記及其用法的制作方法
技術領域：
：本發明涉及小麥抗白粉病新基因尸/z必W分子標記育種的方法，屬分子遺傳學領域，特別涉及利用小麥白粉病抗病新基因,yzzW緊密連鎖的分子標記迸行分子標記輔助育種以提高小麥抗白粉病育種的效率中的應用。二、技術背景小麥白粉病是由小麥白粉病菌[Blumeriagraminis(DC)Speerf.印.Tritici，簡稱為Bgt]所引起的一種氣傳性真菌病害，為世界各主要麥區的主要病害之一，且發病范圍日益擴大，危害程度不斷加重，可引起13.434%的產量損失。選育和使用高效抗病品種被認為是最經濟、安全、有效的解決辦法。根據"基因對基因"假說，任何抗病基因都會出現克服其抗性的毒性小種，反之亦然，二者呈共進化的關系，即一個新的抗病基因在經過一段時間的應用后，就會有針對它的毒性小種出現，使其逐漸喪失抗病性，從而給小麥生產造成嚴重損失。因此，發掘新的白粉病抗源已成為目前小麥抗白粉病育種的一項非常急迫的任務。到目前為止，國際小麥基因命名委員會共正式命名了來自39個位點的55個白粉病抗病基因(&7-戶y^"，其中30個抗病基因已找到連鎖或共分離的分子標記。近年來，分子標記作圖技術發展迅速，眾多的分子標記類型中以SSR(SimpleSequenceR印eat，簡單重復序列，又稱微衛星標記)、AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism,擴增片段長度多態性)以及由RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphisms,限制性片段長度多態性)轉化的STS(SequenceTaggedSite,序列標簽位點)應用最為廣泛。近幾年新發掘的白粉病抗病基因所構建的遺傳圖譜基本都是應用的這三類標記。隨著小麥基因組學研究的蓬勃發展，EST(ExpressedSequenceTag,表達序列標簽)數據庫的信息量呈現出指數級增長，截止2008年11月小麥EST數據庫登錄的EST序列(http:〃雨.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/index.html)已超過1,250，932條，同時EST-SSR因具有成本低、特異性好等優點，已成為SSR標記發展的一個新方向。小麥近緣種屬如一粒小麥、二粒小麥、粗山羊草等已成為白粉病新抗病基因非常重要的來源(/^^-/^^),這些抗病基因多為質量抗性，對當前流行的生理小種有較好的抗性。但這類抗源往往與不利的農藝性狀相連鎖，作為抗源導入栽培品種時，后代需要經過多代回交來打破與不利基因的連鎖，有的甚至經過多代回交以后仍無法打破這種連鎖，這在很大程度上制約了此類抗源在育種中的應用。普通小麥品種周98165對白粉病具有優異的抗性，且自身農藝性狀優良，作為新的白粉病抗源導入小麥品種的難度小，無不利連鎖，所以周98165在育種應用方面具有較大的優勢。
發明內容本發明要解決的技術問題提供用于小麥白粉病抗病基因尸/^vyr輔助選擇的分子標記引物及其用法，并通過該分子標記首次定位了小麥品種周98165中的白粉病抗性新基因A2^^。本發明的技術方案本發明采用的方法是將小麥抗病親本周98165與感病親本中國春(ChineseSpring,CS)雜交、正交、自交、測交，對雙親及其雜交后代進行苗期鑒定，用小麥白粉病菌08B1進行遺傳分析，利用SSR、EST-SSR標記對雙親及抗感池進行篩選和分析，并結合中國春缺-四體材料進行染色體定位。小麥品種周98165對白粉菌高毒力小種08B1抗性良好，其抗病性受1對顯性核基因控制，將該基因暫命名為尸〃湖《。篩選了與/fe^V,緊密連鎖的2個微衛星標記，在遺傳圖譜上的順序為xgwm299、xwmc291、/M5W。與尸/a^VJ遺傳距離分別為5.3cM和3.8cM，并將尸yz必W定位于3BL染色體上。本發明的用于小麥白粉病抗病基因尸i^必W輔助選擇的分子標記中擴增該分子標記的引物具有如下所示的核苷酸序列標記xgwm299:4PI:5'-ACTACTTAGGCCTCCCGCC-3，，P2:5'-TGACCCACTTGCMTTCATC-3，；或者標記xwmc291:PI:5'-TACCACGGGAAAGGAAACATCT-3，，P2:5，-CACGTTGAAACACGGTGACTAT-3，。所述標記xgwm299與小麥白粉病抗性基因尸77z/y7Vf的遺傳距離為5.3cM，標記xwmc291與尸/a/W,的遺傳距離為3.8cM。所述的分子標記用于SSR標記篩選時的反應程序為(1)PCR反應體系為10yL，含10Xbuffer1uL、15咖ol/LMgCl21yL、2mmol/LdNTP1uL、20ng/uL分子標記引物luL、1UTaq酶、去離子水3.875uL、20ng/uL基因組DNA2uL;(2)擴增程序為94°C預變性3min;94。C變性lmin，55。C或6(TC退火1min，72。C延伸2min，40個循環;72。C延伸10min;(3)擴增產物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠或8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色后觀察照相。所述的分子標記引物為xgwra299時，退火溫度為55°C;分子標記引物為xwmc291時，退火溫度為60°C。本發明的分子標記在小麥白粉病分子標記輔助育種中的應用。本發明的有益效果本發明所提供的普通小麥周98165中的抗白粉病基因尸7Z皿的分子標記方法，具有以下優點1、本發明利用分子標記確定小麥品種周98165所攜帶的尸/z必WT基因為一新的白粉病抗病基因，并首次定位了該基因，標記xgwra299與該基因的遺傳距離為5.3cM，標記xwmc291與該基因的遺傳距離為3.8cM,上述兩個標記均與T^Z^W基因緊密連鎖，皆可用于該基因的分子標記輔助育種。2、利用本發明的白粉病分子標記輔助育種選擇目標明確，可節約成本。傳統的白粉病抗病育種首先要利用優異白粉病抗源為親本進行雜交，然后對后代群體進行白粉病抗病性接種鑒定，該方法易受環境氣候影響，選擇準確性較低。因此傳統抗病育種不但費時、費工，而且效率低、成本高。利用本發明的分子標記與白粉病抗性新基因戶mi^V《緊密連鎖的特點，在苗期就可快速、高通量地鑒定出含有白粉病抗性新基因i^/iAK的分離群體和高代品系，在降低了成本的同時還可大幅度地提高選擇效率。3、本發明利用經典遺傳學、中國春缺體-四體定位和分子標記方法，對小麥品種周98165攜帶的白粉病抗性新基因進行遺傳分析，明確其遺傳規律，對抗病基因進行定位、開發與其緊密連鎖的分子標記，為將來通過染色體步移的途徑對尸m/ZiV《進行圖位克隆成為可能，為白粉病抗病育種提供新的抗源和技術基礎。四圖1:SSR標記Xwmc291在雙親、抗感池、2761-5和中國春缺體-四體系間的擴增結果。圖中，Ml:DNAmarker;1:抗病池；2:感病池；3:抗病親本周98165;4:感病親本中國春；5:N3AT3B;6:N3AT3D;7:N3BT3A;8:N3BT3D;9:N3DT3A;10:N3DT3B。圖2:抗白粉基因尸/zz/^V,的微衛星標記連鎖遺傳圖譜。圖3:抗白粉基因尸/Z必Wf的微衛星標記連鎖圖譜。圖中，Ml:100bpDNALader;1:周22;2:中國春；3:2761-5(Pml3);箭頭表示多態性片段。五具體實施例方式以下結合實施例詳細說明本發明。一、材料與方法(一)供試小麥材料周98165與中國春(CS)的正交和反交h代、F2代、F2:3、Bd代群體，以及中國春及其缺體-四體系(nullisomic-tetrasomiclines):N3AT3B、N3AT3D、N3BT3A、N3BT3D、N3DT3A和N3DT3B，抗病對照材料Aramda(/to必)、Kavkaz(尸/H勸、2761-5(尸/z")、京05-3672-1(尸/zi7)、齒牙糙(尸/z^力、京05-3539-1,周98165的三個親本材料為周麥12、周麥13和豫麥49。(二)分析方法1.苗期白粉病抗病性分析抗病性鑒定采用人工接種方法，當供試小麥幼苗長至三葉期時用抖粉法接種后置于隔離的接種間內(溫度15-20。C/晝、10-15。C/夜，光照14-16h/h.d-1，光強10000lx，相對濕度:80%)潛育發病，待感病對照中國春充分發病后(7-10d)，按盛寶欽6級分類法劃分抗病分級即0，0;，1，2，3，4，其中O為免疫(植物無病斑，無侵染癥狀)，0;為近免疫(有枯斑，不產生孢子堆)，l為高抗(病斑小，倒四葉菌絲小而少，菌絲層稀薄，可見綠色葉面，偶見較大病斑，但仍透綠，產孢量極少)，2為中抗(倒三葉、倒二葉感病，葉片病斑直徑小于lmm，下部葉片菌絲少而薄)，3為中感(旗葉感病，葉片病斑多，但病斑不連片，直徑大于lmm，下部葉片菌絲大而厚)，4為高感(穗部或旗葉感病，葉片病斑直徑一般大于lmm，菌絲層厚，產孢量大，病斑連片)。對F2后代用卡方檢驗進行分離比適合度測驗，確定品種所含的抗病基因數目及互作方式。2.DNA提取和抗感池構建小麥基因組DNA的提取采用CTAB法。采用分離體分組混合分析法(BulkedSegregationAnalysis)進行篩選與戶w7/A^基因連鎖的分子標記，即在周98165與中國春(CS)的雜交F2分離群體中隨機選取10株極端抗病植株和10株極端感病植株，分別提取DNA，各自取等量DNA混合建立抗病池和感病池。利用SSR標記對抗池、感池和雙親(周98165和中國春)進行分析。3.SSR引物的分析本研究所使用的分子標記通過以下途徑獲取(1)根據國際小麥SSR協作組最新公布的小麥遺傳連鎖圖譜(http://wheat,pw.usda.gov/cgi-bin/swish/search.cgi)，選取分布于小麥21條染色體組的分子標記進行遺傳分析，分子標記引物序列來自國際小麥SSR協作組公布的536對小麥WMC引物(http:〃wheat,pw.usda.gov/ggpages/SSR/WMC);(2)本實驗室根據NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation,美國國家生物技術信息中心)公布的小麥EST序列信息自行設計合成的EST-SSR引物。PCR反應在德國Biometra公司TlThermocycler上進行。反應體系為10uL(含10XbufferluL,15,1/LMgC121uL，2,1/LdNTP1yL，20ng/uL弓l物luL，1UTaq酶，去離子水3.875yL，20ng/uL基因組DNA2uL)。擴增程序為94。C變性3min;94。C變性lmin,50°C、55。C或60。C復性lmin，72。C延伸2min，40個循環；72'C延伸10min。擴增產物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠或8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，經硝酸銀染色后觀察照相。4.遺傳距離估算和連鎖分析和白粉病抗病基因的染色體定位用國際動植物分子標記開發研究通用的Mapmarker3.Ob軟件計算標記與抗白粉病基因間的遺傳距離(L0D》3.0)。用通用的專業軟件Mapdra繪制該基因的遺傳連鎖圖譜。根據SSR擴增結果，找到在雙親、抗病池和感病池間具有多態性的引物，通過F2群體對多態性引物進行驗證，利用該引物的定位信息對抗病基因進行定位，并利用一套中國春的缺體四體(第三同源群)對定位結果進行進一步的驗證。然后，結合Sourdille等報道的小麥微衛星引物的物理圖譜，對該抗病基因的精細定位進行進一步的分析。二、結果與分析(一)抗性鑒定和遺傳分析用河南省的高毒力小麥白粉病菌生理小種LY2-1、ZZ1-1、08Bl對供試材料接菌，苗期接種結果表明，周98165對3個小種均表現近免疫或高抗，與京05-3672-1(/^^)和京05-3539-1的抗病表現一致；感病品種中國春對以上3個小種均表現為高感，侵染型為4型；齒牙糙(尸邁i^)對ZZl-l抗病，而感染LY2-1和08B1;2761-50°//lJ)則對3個小種全部感病。試驗結果表明抗病基因尸;zz^W與尸/Bi7、/fe加對三個菌系抗性水平表現一致，而與/^艱病表現有差異。見表l。表1周98165單小種抗病鑒定結果抗病鑒定材料<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表中R表示抗病；S表示感病。周98165接種菌系08B1后表現為近免疫，侵染型為O;，感病親本中國春接種08Bl后表現為高感，侵染型為4型，對FhF2、F2:3和Bd接種進行遺傳分析，0-2為抗病，3-4為感病。結果見表2，表明20株正交F,和25株反交F,全部抗病，15株Bd有9株抗病、7株感病，x2檢驗符合l:l的分離比，在周98165與中國春的F2正交群體(278株)中，其中抗病219株、感病59株，經x2檢驗符合1對顯性基因控制的3R:1S的分離比例(x2={3:l}=0.8653，p>0.25)。對周98165與中國春雜交的193個F2:3家系同樣接種了菌系08B1，結果顯示45個家系有抗性且不發生抗性分離，101個F2:3家系發生抗性分離，48個家系表現感病不分離，〃檢驗結果(x2={l:2:l}=1.91，df=2，p=0.38)表明其符合l:2:l的顯性單基因分離比。這些結果表明周98165對08B1的白粉病抗性是由1對顯性基因所控制，將該基因暫命名為AzMWf。表208B1對周98165的白粉病抗病遺傳分析結果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表中，R表示45個純合抗病系和101個發生分離的F2:3家系中的抗性株，S表示48個純合感病系和101個發生分離的F2:3家系中的感病株。*表示顯著水平為0.05時的f值。(二)P/Z必WT基因連鎖標記的篩選與染色體定位如材料與方法中所述，本實驗室根據國際小麥SSR協作組公布的SSR分子標記和自行設計的EST-SSR分子標記合成了均勻分布于小麥21條染色體的210對引物，在抗病親本周98165、感病親本中國春、抗性池和感病池間進行PCR擴增、篩選，發現有兩對SSR引物在抗、感池和雙親間擴增出多態性，比對這兩對引物的遺傳圖譜，發現其均位于染色體3B的長臂。在這兩對引物遺傳圖譜的周圍選取26對SSR引物進行擴增，又發現3對引物也在雙親及抗感池間存在多態性。經過對F2分離群體的電泳分析，從中選取xwmc291、xgwm299兩個可靠性、穩定性最好的引物作為白粉病抗病新基因戶mW《的選擇標記，見附圖1。(三)遺傳連鎖性分析為檢測目的基因位點與所獲得標記位點的遺傳連鎖性，將R后代278個單株分別提取基因組DNA。利用這些連鎖標記進一步對這278個單株進行分析，以確定抗白粉病基因/^WJ與標記位點之間的連鎖關系。用M即marker3.0b軟件對抗白粉病基因尸^zWI與SSR位點進行連鎖分析(L0D》3.0)，結果顯示標記Xwmc291、Xgwm299和抗白粉病基因尸/a^^遺傳距離分別為3.8cM和5.3cM，見附圖2。三、結論本發明利用3個河南省當前小麥白粉病流行小種評價了周98165的抗病性，證實其對多個白粉菌小種有很強的抗性。利用經典遺傳學分析，發現周98165對08B1的抗病性是由1對顯性核基因所控制，用SSR標記將其定位于染色體3BL上，并有3B的缺體-四體進行了驗證。到目前為止，定位于3BL上的已正式命名的白粉病抗病基因只有一個即尸歷"。尸/zM是由C.Ceoloni等(Hereditas，1992，116:239-245)在小麥近緣屬高大山羊草"e^77ops70/^7'ssi歷a)中發現并轉入普通小麥的，共有3BL.3SS-3S、3DL.3SS-3S兩種轉入類型。在試驗中用與尸/zz^7T基因連鎖的兩個標記對2761-5(尸歷7》進行擴增，結果顯示尸歷"與2個標記皆不連鎖，表明/fe"與尸/z必V^基因不在同一位點，是2個不同的白粉病抗病基因，即Az/^^為一新的白粉病抗病基因。另外在白粉病抗病鑒定方面，/fe^W與尸/zL^也有明顯不同，/^在接種LY2-1、ZZ1-1和08B13個白粉病生理小種后，侵染型分別為4、4和3,而同樣條件下Az^^侵染型分別為0;、1和0;，二者的抗病性有明顯的不同。因此可以判定尸/a/W與/^"不是同一或等位基因，同時由于目前定位于3BL上的白粉病抗病基因只有尸WJ，因此可以確定周98165所攜帶戶y必V^為一新的白粉病抗病基因。為了進一步證實試驗結果，利用/fe/J的標記對周98165與2761-5(尸歷")進行了分子鑒定(見附圖3)，結果表明周98165不含有抗白粉病基因i^WA即P/zz^Wr和/^A不是同一基因。由于周98165自身農藝性狀比較優異，也尚未看到該抗病基因與不利的基因連鎖，因此尸^^及該基因的載體周98165具有較好的育種利用價值。權利要求1.一種用于小麥白粉病抗病基因PmHNK輔助選擇的分子標記，其特征在于擴增該分子標記的引物具有如下所示的核苷酸序列標記xgwm299P15’-ACTACTTAGGCCTCCCGCC-3’，P25’-TGACCCACTTGCAATTCATC-3’；或者標記xwmc291P15’-TACCACGGGAAAGGAAACATCT-3’，P25’-CACGTTGAAACACGGTGACTAT-3’。2.根據權利要求1所述的分子標記，其特征在于所述標記xgwm299與小麥白粉病抗性基因尸/必V^的遺傳距離為5.3cM，標記xwmc291與尸/n^T的遺傳距離為3.8cM。3.—種權利要求1所述的用于小麥白粉病抗病基因尸/a^W輔助選擇的分子標記的用法，其特征在于將所述的分子標記用于SSR標記篩選時的反應程序為(1)PCR反應體系為10yL，含10Xbuffer1uL、15腿ol/LMgCl21uL、2腿ol/LdNTP1uL、20ng/yL分子標記引物luL、1UTaq酶、去離子水3.875uL、20ng/uL基因組DNA2uL;(2)擴增程序為94°C預變性3min;94。C變性lmin，55r或6(TC退火lmin，72。C延伸2min，40個循環;72。C延伸10min;(3)擴增產物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠或8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色后觀察照相。4.根據權利要求1所述的分子標記，其特征在于所述的分子標記引物為xgwm299時，退火溫度為55°C;分子標記引物為xwmc291時，退火溫度為6(TC。5.權利要求1或2所述的分子標記在小麥白粉病分子標記輔助育種中的應用。全文摘要本發明涉及利用小麥白粉病抗病新基因PmHNK緊密連鎖的分子標記進行輔助育種以提高小麥抗白粉病育種的效率中的應用。本發明的分子標記中擴增該分子標記為xgwm299、標記xwmc291，xgwm299與基因PmHNK的遺傳距離為5.3cm，標記xwmc291與PmHNK的遺傳距離為3.8cm。將所述的分子標記用于SSR標記篩選，通過PCR反應進行擴增，擴增產物聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色后觀察照相。本發明首次定位了PmHNK基因，兩個標記均與PmHNK基因緊密連鎖，可用于該基因的分子標記輔助育種。利用本發明的白粉病分子標記輔助育種選擇目標明確，節約成本，還可大幅度地提高選擇效率，為將來通過染色體步移的途徑對PmHNK進行圖位克隆成為可能，為白粉病抗病育種提供新的抗源和技術基礎。文檔編號C12Q1/68GK101532054SQ20091006432公開日2009年9月16日申請日期2009年3月4日優先權日2009年3月4日發明者張建周,李春鑫,琳胡,許為鋼申請人:河南省農業科學院