一種動物用長效狂犬病疫苗及其制備方法

專利名稱：：一種動物用長效狂犬病疫苗及其制備方法
技術領域：
：-.本發明屬于動物免疫疫苗制備
技術領域：
，尤其是提供一種動物用長效狂犬病疫苗及其制備方法，利用復制缺陷性逆轉錄病毒為載體，通過改造，克隆進狂犬病病毒糖蛋白基因的表達盒，通過轉染包裝細胞獲得的重組病毒，以該重組病毒溶液免疫動物，可使被免疫動物產生長期免疫保護的新型狂犬病疫苗。技術背景-狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的一種重要人獸共患傳染病，一旦發病，即可導致100%死亡。我國每年因狂犬病死亡的人數在20003000例之間。人狂犬病的發生均由動物咬傷引起，現行的用于動物狂犬病預防的疫苗包括滅活疫苗和弱毒疫苗，滅活疫苗雖然免疫效果較好，但是一般在制備時需要進行濃縮，成本較高，由于免疫期較短，通常每年進行一次加強免疫，這在實際使用中尤其是在廣大的農村地區存在使用不方便等問題；弱毒活疫苗制備容易，但在易感動物體內存在毒力返祖的潛在可能，對于生態環境和人類健康都是嚴重的威脅。近年來，采用基因工程等手段，相繼研制了一系列的狂犬病亞單位疫苗、多肽疫苗、抗獨特性抗體疫苗、重組活載體疫苗和DNA疫苗等。這些疫苗均以狂犬病病毒糖蛋白或其部分為目的抗原，應用時安全，并具有一定的免疫保護效果。但是這些疫苗誘導的抗體免疫應答往往持續時間較短，由于犬具有較長的生命周期，需要進行多次再免疫或加強免疫。
發明內容本發明的目的在于提供一種動物用長效狂犬病疫苗，可以對犬和貓提供長期的狂犬病免疫保護作用，具有免疫時間長的特點。本發明還提供上述動物用長效狂犬病疫苗的制備方法，以逆轉錄病毒為載體，將狂犬病病毒保護性抗原基因克隆到逆轉錄病毒載體的兩個長末端重復序列中間，通過轉染包裝細胞獲得重組病毒，制成疫苗。本發明的長效狂犬病疫苗，可用下述方法得到以復制缺陷型逆轉錄病毒為載體，表達狂犬病病毒糖蛋白基因，通過擴大培養重組病毒制成疫苗。本發明動物用長效狂犬病疫苗的制備方法如下將狂犬病病毒糖蛋白基因表達盒克隆入商品化的復制缺陷型逆轉錄病毒載體，通過商品化的轉染試劑，在敏感細胞中包裝重組病毒，通過轉染細胞的藥物篩選和擴大培養，收集細胞培養物制成疫苗。重組病毒在感染機體后，其基因組會整合到宿主基因組中，在整合甜后均可持續表達狂犬病病毒糖蛋白，從而刺激機體產生長期的狂犬病保護性抗體。本疫苗可用于犬、貓、小鼠多種哺乳動物的狂犬病預防，并能提供長期有效的免疫保護。具體步驟制備方法如下1.狂犬病病毒糖蛋白cDNA的獲得狂犬病病毒糖蛋白cDNA可通過常規的RT-PCR技術，由任一狂犬病病毒株獲得，如狂犬病病毒SRV9株的糖蛋白cDNA全長1575bp，將RT-PCR產物克隆入pMD18-T載體中，進行序列測定。2.狂犬病病毒糖蛋白表達盒的構建以PWI和Wo/I酶切位點，將糖蛋白基因克隆入pVAXl載體，獲得重組質粒pVAX-G，該重組質粒中含有狂犬病病毒糖蛋白的表達盒。3.重組逆轉錄病毒載體的構建將含有狂犬病病毒糖蛋白及CMV啟動子的表達盒通過^W7"I和M/I雙酶切，獲得狂犬病病毒糖蛋白表達盒片段，采用Klenow大片段酶和dNTPs對該片段進行補平。同時，制備質粒pLCNL，以BamHI酶切該質粒，采用Klenow大片段酶和dNTPs對載體部分進行補平。通過T4DNA連接酶連接兩條片段，轉化感受態大腸桿菌JM109，獲得重組質粒pLCN-G。4.狂犬病病毒糖蛋白-重組逆轉錄病毒的獲得以含有10。/。小牛血清的MEM培養基按照常規方法培養PA317細胞。轉染前一天進行傳代，第二天長成單層時進行轉染。轉染步驟取上述的狂犬病病毒糖蛋白-重組逆轉錄病毒重組質粒4微克，溶解在0.5毫升的無血清培養基中，同時取50微升脂質體(Lipofectamine),混入0.5毫升無血清培養基中，將含質粒的培養基和含有脂質體的培養基混合，室溫孵育20分鐘，將轉染混合液加到長滿單層的PA317細胞上。37"感作6小時，棄轉染液，加入含有10n/。小牛血清和適量抗生素的MEM完全培養基，同時加入350-400微克/ml的G418(Geneticin)，37。C維持2周，期間可以根據細胞生長情況適時換液，待形成克隆時，將克隆移至96孔細胞培養板中，長成單層后逐歩5擴大培養至細胞培養瓶中，對部分細胞凍存以保留重組病毒毒種。其他部分用于收集細胞培養上清和細胞裂解液，作為重組疫苗溶液。5.重組疫苗的使用對狂犬病病毒糖蛋白-重組逆轉錄病毒進行擴大培養以后，按每個劑量l-2毫升，肌肉注射或口服免疫犬、貓和小鼠等哺乳動物，只需免疫一次。免疫后采集血清，進行狂犬病中和抗體測定，當中和抗體水平降至0.5IU/ml以下時，再以相同劑量加強免疫一次。該重組疫苗可以誘導機體產生良好的體液免疫應答，抗體陽轉率100%，免疫動物80%以上可以抵抗狂犬病病毒的致死性感染。本發明的積極效果在于以復制缺陷型逆轉錄病毒為載體，該載體在形成病毒感染機體以后可以整合到宿主細胞的染色體內；以表達狂犬病病毒糖蛋白的表達盒作為外源性目的基因，該目的基因表達的蛋白可刺激機體產生針對狂犬病病毒的免疫應答；通過轉化逆轉錄病毒的包裝細胞，可以持續產生重組病毒，以重組病毒免疫動物，可使動物獲得長期的針對狂犬病的免疫保護效果。本重組疫苗適用動物范圍廣泛，使用安全，誘導的免疫有效期持續時間長，是一種長效的預防狂犬病的新型疫苗。圖l.狂犬病病毒糖蛋白基因表達盒的構建(在糖蛋白基因上游具有巨細胞病毒早期啟動子CMV);圖2重組質粒pLNC-G構建流程圖。具體實施例方式下面結合具體的實施例對本發明進一歩說明實施例l狂犬病病毒糖蛋白-重組逆轉錄病毒載體的構建含lacZ基因的pLNCL載體及質粒載體pVAX-G，由本實驗室構建保存；包裝細胞系PA317，大腸桿菌(五.co/Z)JM109，以商品購進，本實驗室保存。重組質粒構建的主要過程為(1)Bmn//I酶切pLNCL后，回收5812bp的線性化片段，Klenow酶補平，而后用堿性磷酸酶(CIAP)對其進行脫磷酸作用，從而得到兩端均為平端的pLNCX空載體。(2)&^//1、MAI和Af/wI三酶并用對pVAX-G進行酶切，回收2326bp片段，同樣用Klenow酶補平，從而得到兩狂犬病病毒SRV9株G蛋白基因的核酸片段。(3)將2326bp含有狂犬病病毒SRV9株G蛋白基因的核酸片段用T4DNALigase連接到pLNCX空載體中，從而得到重組質粒pLNC-G。具體操作與結果(1)酶切與回收①用BamHI酶切pLNCL，酶切體系如下BamHI1^1buffer5^1pLNCL15^1四餾水29…50|ul作用2個小時后，在體系中加入1^1dNTP和0.5plKlenow酶，在37'C水浴中作用30分鐘使其載體兩端補平，之后在75'C水浴中作用20分鐘使其Klenow酶滅活，之后再向體系中加入0.5^1CIAP，在37'C水浴作用30分鐘，對載體進行脫磷酸作用。用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收5812bp的線性化片段。②5^/n、A^I和M/wI三酶并用對其pVAX-G進行酶切。具體體系如下淑IlplM/wI1^1~沼1^1buffer5|ulBSA5^1pVAX-G15pl四餾水_22^15(^1先加入&p/n酶，讓其單獨對體系作用40分鐘后，再加入另外兩個酶對體系在消化兩個小時，使體系充分反應后，在體系中加入dNTP和0.5plKlenow酶，37"作用半個小時，使片段兩端補平，再將體系放入75X:水浴，消化20分鐘。用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收2326bp的線性化片段。(2)連接取純化回收產物，按載體與片段1:3比例連接，連接體系如下T4DNALigasebuffer1^1DNA片段6nlVector2^1T4DNALigase__于16'C低溫連接過夜。(3)轉化無菌條件下取連接產物9pl，加入10(^1JM109感受態細胞中，混合均勻，冰浴放置30分鐘(冰水混合物);42T:、90秒，迅速轉入冰浴維持5分鐘;加400(ilLB培養基，37°。搖床上培養30分鐘，4000r/min離心3分鐘，棄400pl上清，用剩下的100(il培養基重新懸浮沉淀;將菌液均勻涂布于含氨芐青霉素抗性的LB固體培養基待吸收后，將其置于37'C培養箱中培養16h。(4)挑斑隨機挑取生長與LB平板上的8個白色菌落(共8個)，分別接種于含Amp的LB液體培養基中，37'C搖床振蕩過夜。(5)重組質粒pLNC-G的提取小量質粒提取按常規方法進行操作(6)重組質粒pLNC-G的酶切鑒定將陽性重組質粒分別用三組酶作酶切進行鑒定，酶切反應體系如下0.5pl2.￡c。WI0.5nl3.I0.5^1buffer1.5plbuffer1.5nlbuffer1.5|_dBSA1.5iulBSA.5^1BSAi.5nl重組質粒4pl巫組質粒化l歪組質粒4^1四餾水7.5|_il四餾水7.5ul四餾水7.5ul15nl15pl15pl混勻瞬時離心后，于37'C水浴消化lh，反應結束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢査結果。5YwI酶切重組質粒后，將其線性化為8138bp;^W7//I酶切重組質粒后，出現705bp和7433bp兩條片段；五coiI酶切重組質粒后，出現1613bp、1911bp和4614bp三條片段。實施例2重組病毒的包裝用0.20.7g/L不同濃度的G418，測定G418對于包裝細胞系PA317的最小致死劑量。參照Lipofectamine2000的說明書，以脂質體為介質，將重組病毒載體導入包裝細胞系PA317。并以最小致死量的G418進行篩選。(1)PA317對G418最小致死劑量的測定及其結果24孔板接種適量的PA317細胞，待細胞長成75%匯片時，加入含有不同濃度的G418(0.2、0.3、0.35、0.4、0.5、0.6、0.7g/L)選擇培養液，每個梯度設置三個重復，同時設置空白對照。每3天換液一次，1014天根據細胞死亡情況確定G418對于PA3178細胞的最小致死濃度。在第10天觀察發現G418濃度為400|ag/ml壓力下的細胞已剩下極少存活，兩周時間可以完全死亡，而在小于此壓力下的細胞還有極少數存活，但到第14天也均不能形成克隆。(2)脂質體介導的重組逆轉錄病毒載體轉染PA317細胞質粒DNA經苯酚/氯仿反復抽提，OD26Q/OD28Q=1.8,用前過濾除菌。取30ml細胞培養瓶中處于旺盛生長期的PA317細胞傳至12孔板中的兩個孔(一個用做轉染，一個作對照)，37°C，5%C02飽和濕度條件下培養12小時，待細胞長成75%單層時，準備轉染。脂質體/DNA復合物的制備在1.5ml無菌Eppendorf管中配置A液將6plDNA稀釋于200W無血清無雙抗的DMEM營養液中。在青霉素小瓶中配置B液將8^1LipofectamineTM2000稀釋于200pl無血清無雙抗的DMEM營養液中。待A液與B液分別作用5分鐘后，將A液加到含B液的小瓶中，輕微震蕩，充分混勻后，室溫放置30分鐘。在DNA和脂質體作用過程中，將75%單層細胞用無血清無雙抗的DMEM營養液清洗三次，加入lml無血清無雙抗的DMEM營養液。將作用完畢的DNA/Lipofectamine混合物，加入到細胞上清中，輕晃搖勻，37°C，5%C02，飽和濕度培養12小時后，換入5%血清的DMEM營養液。(3)G418抗性細胞的篩選轉染后的PA317細胞在37°C，5%C02飽和濕度培養36h后，將細胞按1:5，分傳至12孔板中，空白對照也同樣按1:5分傳至12孔板中。12h后，待轉染孔細胞貼壁后，加入終濃度400pg/mlG418的DMEM營養液繼續培養。同時空白對照孔也隨機選擇三個空加入同等濃度的含G418的DMEM營養液進行培養，根據轉染后的細胞生長情況，每三天換一次液，隨著時間的延長，死亡細胞增加，大約在第10天，在轉染孔中可見數個細胞克隆形成。實施例3產毒細胞的克隆和重組病毒的擴大培養將96孔板中每孔加入飼養細胞，把長出細胞克隆的12孔板，用記號筆標記克隆的位置，在超凈工作臺上用無菌槍頭挑取細胞克隆，打入96孔板，待細胞貼壁后，將96孔板中的一半液體換為終濃度400Hg/LG418的DMEM營養液，待細胞長多后再將其液體全部換為終濃度400Pg/LG418的DMEM營養液進行培養，長滿后，依次傳入24孔板，6孔板，30ml細胞培養瓶，50ml細胞培養瓶，逐歩擴大培養。擴大培養時，G418的濃度為400l^g/ml，血清添加量為10%。實施例4狂犬病病毒糖蛋白-重組逆轉錄病毒對犬的肌注免疫取10條未免疫的家犬，通過熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)測定每條犬血清中的狂犬病中和抗體，在確定無抗體時，按每條取l毫升重組病毒溶液，肌肉注射免疫。2周后分別采集免疫犬的血清，通過FAVN測定血清中的中和抗體，以OIE的標準血清作為對照。結果，免疫前10條犬的中和抗體均為0。免疫后10條犬的中和抗體水平分別如下:通過FAVN測定的肌肉注射免疫犬的狂犬病中和抗體水平(IU/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>說明重組病毒在免疫犬后，犬獲得了有效的針對狂犬病病毒的保護性免疫。實施例5狂犬病病毒糖蛋白-重組逆轉錄病毒對犬的口服免疫取10條未免疫的家犬，通過熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)測定每條犬血清中的狂犬病中和抗體，在確定無抗體時，按每條取2毫升重組病毒溶液，口服免疫。2周后分別采集免疫犬的血清，通過FAVN測定血清中的中和抗體，以OIE的標準血清作為對照。結果，免疫甜10條犬的中和抗體均為0。免疫后10條犬的中和抗體水平分別如下:通過FAVN測定的口服免疫犬的狂犬病中和抗體水平(IU/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>說明重組病毒在免疫犬后，犬獲得了有效的針對狂犬病病毒的保護性免疫。實施例6狂犬病病毒糖蛋白-重組逆轉錄病毒對貓的肌注免疫取10只未免疫的家貓，通過熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)測定每只貓血清中的狂犬病中和抗體，在確定無抗體時，按每條取l毫升重組病毒溶液，肌肉注射免疫。2周后分別采集免疫貓的血清，通過FAVN測定血清中的中和抗體，以0IE的標準血清作為對照。結果，免疫前10只貓的中和抗體均為0。免疫后中和抗體水平分別如下:通過FAVN測定的肌肉注射免疫貓的狂犬病中和抗體水平(IU/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>說明重組病毒在免疫貓以后，貓獲得了有效的針對狂犬病病毒的保護性免疫。實施例7狂犬病病毒糖蛋白-重組逆轉錄病毒對鼠的肌注免疫取20只未免疫的小鼠(昆明鼠)，通過熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)測定每只鼠血清中的狂犬病中和抗體，在確定無抗體時，按每只鼠取0.2毫升重組病毒溶液，肌肉注射免疫。2周后分別采集免疫鼠的血清，通過FAVN測定血清中的中和抗體，以OIE的標準血清作為對照。結果，免疫前20只鼠的中和抗體均為0。免疫后20只鼠的中和抗體水平分別如下通過FAVN測定的肌肉注射免疫鼠的狂犬病中和抗體水平(IU/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>說明重組病毒在免疫鼠以后，小鼠獲得了有效的針對狂犬病病毒的保護性免疫。權利要求1.一種長效的狂犬病疫苗，可用下述方法得到以復制缺陷型逆轉錄病毒為載體，表達狂犬病病毒糖蛋白基因，通過擴大培養重組病毒制成。2、權利要求1所述疫苗的制備方法，其特征如下將狂犬病病毒糖蛋白基因表達盒克隆入復制缺陷型逆轉錄病毒載體，通過轉染試劑，在敏感細胞中包裝重組病毒，通過轉染細胞的藥物篩選和擴大培養，收集細胞培養物制成疫苗。3、權利要求1所述疫苗的制備方法，包括以下步驟1)狂犬病病毒糖蛋白CDNA的獲得將RT-PCR產物克隆入pMD18-T載體中，進行序列測定，通過RT-PCR技術由狂犬病病毒株獲得狂犬病病毒糖蛋白cDNA;2)狂犬病病毒糖蛋白表達盒的構建以PstI和NotI酶切位點，將糖蛋白基因克隆入pVAXl載體，獲得重組質粒pVAX-G，該重組質粒中含有狂犬病病毒糖蛋白的表達盒；3)重組逆轉錄病毒載體的構建將含有狂犬病病毒糖蛋白及CMV啟動子的表達盒通過MluI和NotI雙酶切，獲得狂犬病病毒糖蛋白表達盒片段，采用Klenow大片段酶和dNTPs對該片段進行補平；同時，制備質粒pLCNL，以BamHI酶切該質粒，采用Klenow大片段酶和dNTPs對載體部分進行補平。通過T4DNA連接酶連接兩條片段，轉化感受態大腸桿菌JM109，獲得重組質粒pLCN-G;4)狂犬病病毒糖蛋白-重組逆轉錄病毒的獲得以含有10。/。小牛血清的MEM培養基按照常規方法培養PA317細胞；轉染前一天進行傳代，第二天長成單層時進行轉染；37。C感作6小時，棄轉染液，加入含有10。/。小牛血清和適量抗生素的MEM完全培養基，同時加入350-400微克/ml的G418(Geneticin)，37。C維持2周，根據細胞生長情況適時換液，待形成克隆時，將克隆移至96孔細胞培養板中，長成單層后逐步擴大培養至細胞培養瓶中，對部分細胞凍存以保留重組病毒毒種；其他部分用于收集細胞培養上清和細胞裂解液，作為重組疫苗溶液。全文摘要本發明涉及一種長效動物用狂犬病疫苗及其制備方法，以復制缺陷型逆轉錄病毒為載體，該載體在形成病毒感染機體以后可以整合到宿主細胞的染色體內；以表達狂犬病病毒糖蛋白的表達盒作為外源性目的基因，該目的基因表達的蛋白可刺激機體產生針對狂犬病病毒的免疫應答；通過轉化逆轉錄病毒的包裝細胞，可以持續產生重組病毒，以重組病毒免疫動物，可使動物獲得長期的針對狂犬病的免疫保護效果。本重組疫苗適用動物范圍廣泛，使用安全，誘導的免疫有效期持續時間長，是一種長效的預防狂犬病的新型疫苗。文檔編號C12N15/867GK101537179SQ20091006650公開日2009年9月23日申請日期2009年2月6日優先權日2009年2月6日發明者曄劉,菲張,張守峰,扈榮良,娜趙申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所