專利名稱：人黑色素皮質激素受體4的制備方法
技術領域：
本發明涉及人黑色素皮質激素受體4的制備方法。
背景技術：
黑色素皮質激素受體4 (Melanocortin 4 Rec印tor， MC4R)，是第一個發現的 與人類顯性遺傳疾病肥胖癥相關的靶位點，它可以與瘦素(L印tin)、神經肽Y (Neurop印tideY， NPY)以及a-黑素細胞刺激
(Alpha-melanocyte-sti咖latinghormone， a-MSH) —起調節體重禾口攝食量。對 于MC4R基因突變在調節人類體重變化中重要性的研究始于1998年。到目前為止，已 有10余個MC4R突變位點被相繼報道(MC4R及其基因突變與肥胖相關性研究進展， 張翼飛綜述，國外醫學遺傳學分冊2003年第26巻第1期)。雖然MC4R是中樞神經系 統中參與調節肥胖癥發生的重要因素，但是由于MC4R是跨膜G蛋白耦聯受體超家族 的成員之一，它的表達和純化非常困難，所以目前關于肥胖癥的藥物設計研發主要 集中在MC4R的選擇性激動劑和抑制劑的藥物研發領域。國內外有許多相關的文獻和 專利報道了該領域最新的進展(黑皮質素受體4激動劑研究進展，孫彭利等；Holder JR， Haskell—Luevano C. Melanocortin ligands: 30 years of structure—activity relationship ( SAR ) studies [ J ]. M ed Res Rev， 2004， 24 (3) : 325 - 356)。 因此，本領域迫切需要一種體外高效表達和純化人MC4R蛋白的方法，以便能夠 大量生產供科學研究和藥物設計所用的MC4R蛋白，以便用于核磁共振實驗來了解 MC4R蛋白的結構，或進行藥理學實驗，促進人們對該受體結構的了解，促進人們對 MC4R的特異性配體與受體相互作用的理解，為藥物設計提供新的線索和思路。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種制備人黑色素皮質激素受體4蛋白的方法。
本發明所提供的制備人黑色素皮質激素受體4蛋白的方法，包括如下步驟將
人黑色素皮質激素受體4蛋白的編碼基因插入pET系列載體的多克隆位點，得到含 有所述編碼基因的重組表達載體，再將所述重組表達載體導入大腸桿菌BL21中， 得到含有所述編碼基因的重組菌，培養所述重組菌，得到人黑色素皮質激素受體4 蛋白。
4所述培養包括如下步驟將所述重組菌先在37"C條件下培養至菌液的OD,值 為0.65，再在12"C條件下培養至菌液的0De。。值為0.95，然后用異丙基-P硫代 半乳糖苷進行誘導培養。
所述培養在振蕩條件下進行，所述振蕩的轉速為225轉/分鐘，旋轉半徑為 26min;所述誘導培養的時間為48-60小時。
所述重組表達載體是通過將所述編碼基因插入載體pET21b的多克隆位點得到 的；所述編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
所述培養用到的培養基的組成為Na2HP04 6 . 0 g/L; KH2P043 . 0 g/L; NaCl 0. 5 g/L;蔗糖4.0 g/L; NH4C1 1.0 g/L; CaCl2 0.0111 g/L; MgS04 0.12 g/L;氨芐 青霉素50 mg/L，其余為水。
本發明方法還包括如下步驟取上述誘導培養后得到的培養液，將所述培養液 中的細胞破碎，棄沉淀取上清液，再進行親和層析過濾，收集洗脫峰，得到人黑色
素皮質激素受體4蛋白；所述親和層析過濾的方法包括如下步驟依次用洗滌緩沖
液l、洗滌緩沖液2和洗脫緩沖液進行洗脫，收集所述洗脫緩沖液洗脫下來的洗脫 峰；
所述冼滌緩沖液l包括0.2% AZ316， 20 mM Tris， 200 raM NaCl， 1. 4mM 巰基乙醇，其余為水；所述洗漆緩沖液l的pH值為8.0;
所述洗滌緩沖液2包括0. 2%AZ316， 30mM咪唑，20 mM Tris， 200 mM NaCl， 1.4mM e-巰基乙醇，其余為水；所述洗滌緩沖液2的pH值為8.0;
所述洗脫緩沖液包括0. 2%AZ316， 250 mM咪唑，20 mM Tris， 200 mMNaCl， 1.4raMP-巰基乙醇，其余為水；所述洗脫緩沖液的pH為8.0;
所述百分含量均為質量百分含量。
在細胞破碎前，向所述培養液中加入細胞破碎液和P-巰基乙醇；所述細胞破 碎液由70mMTris和300mMNaCl組成，余量為水；所述細胞破碎液的pH值為8.0。
細胞破碎的方法為超聲波破碎；所述超聲波破碎的方法為超聲強度為30W， 超聲環境為O'C，總超聲時間為8分鐘，超聲工作方式為每超聲作用5秒鐘間隔7 秒鐘。
在所述超聲破碎后、棄沉淀之前還包括如下步驟向所述培養液中加入溶菌酶、 DNA酶和RNA酶，混勻。
在所述加入溶菌酶、DNA酶和RNA酶后、棄沉淀之前還包括如下步驟向所述
5培養液中加入AZ316和P-巰基乙醇，混勻。
本發明所提供的制備人黑色素皮質激素受體4蛋白的方法，具有表達量高、蛋 白能表達并折疊在細胞膜上的優點，實驗證明，本發明方法的產量可達2.77毫克 MC4R蛋白/升發酵液；而且本發明方法具有操作簡單、成本低廉的特點。因此，本 發明方法適合于工業生產中應用。
圖1為MC4R蛋白洗脫圖譜。
圖2為純化的MC4R蛋白的電泳圖。
具體實施例方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明均為常規方法。
AZ316 (中文名稱是正十六垸基-N， N-二甲基-3-銨-1-丙垸磺酸鹽)，購自 Anatrace公司，產品目錄號為AZ316, AZ316不是物質的名稱)
本發明方法包括如下步驟將人黑色素皮質激素受體4蛋白的編碼基因插入 pET系列載體的多克隆位點，得到含有所述編碼基因的重組表達載體，再將所述重 組表達載體導入大腸桿菌BL21中，得到含有所述編碼基因的重組菌，培養所述重 組菌，得到人黑色素皮質激素受體4蛋白。
其中，所述培養按照如下方法進行將所述重組菌先在37。C條件下培養至菌液 的0D6。。值為0.65，再在12。C條件下培養至菌液的OD6。。值為0.95，然后用異丙基 -P -D-硫代半乳糖苷進行誘導培養。
在所述培養過程中還可以進行振蕩，振蕩的轉速為225轉/分鐘，旋轉半徑為 26ram;誘導培養的時間為48-60小時。
所述重組表達載體是通過將所述編碼基因插入載體pET21b的多克隆位點得到 的；所述編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
所述培養用到的培養基的組成為Na2HP04 6. 0 g/L; KH2P043. 0 g/L; NaCl 0. 5 g/L;蔗糖4.0 g/L; NH4C1 1.0 g/L; CaCl2 0.0111 g/L; MgS04 0.12 g/L;氨芐 青霉素50 mg/L，其余為水。
本發明方法還包括如下純化步驟取上述述誘導培養后得到的培養液，將所述 培養液中的細胞破碎，棄沉淀取上清液，再進行親和層析過濾，收集洗脫峰，得到 人黑色素皮質激素受體4蛋白；所述親和層析過濾的方法包括如下步驟依次用洗 滌緩沖液l、洗滌緩沖液2和洗脫緩沖液進行洗脫，收集所述洗脫緩沖液洗脫下來的洗脫峰；
所述洗滌緩沖液l包括0.2%AZ316， 20 raM Tris， 200 mM NaCl， 1. 4raM P-巰基乙醇，其余為水；所述洗滌緩沖液l的pH值為8.0;
所述洗滌緩沖液2包括0. 2%AZ316， 30mM咪唑，20 mM Tris， 200 roM NaCl, 1.4mM 巰基乙醇，其余為水；所述洗滌緩沖液2的pH值為8.0;
所述洗脫緩沖液包括0.2%AZ316， 200 mM咪唑，20mMTris， 200 mMNaCl， 1.4raMP-巰基乙醇，其余為水；所述洗脫緩沖液的pH為8.0;
所述百分含量均為質量百分含量。
在進行細胞破碎前，向所述培養液中加入細胞破碎液和P-巰基乙醇；所述細 胞破碎液由70函Tris和300 mM NaCl組成，余量為水；所述細胞破碎液的pH值 為8.0。其中，細胞破碎液與所述培養液中菌的配比為20ml細胞破碎液/g濕菌； P -巰基乙醇與所述培養液中菌的配比為3. 5微升P -巰基乙醇/g濕菌。
細胞破碎的方法為超聲波破碎；所述超聲波破碎的方法為超聲強度為30W， 超聲環境為O'C，總超聲時間為8分鐘，超聲工作方式為每超聲作用5秒鐘間隔7秒鐘。
在細胞破碎后、棄沉淀之前向所述培養液中加入溶菌酶、DNA酶和RNA酶，混 勻，使其作用l小時。其中，溶菌酶與菌的配比為400-480U/g濕菌，DNA酶與菌的 配比為500-600 U/g濕菌，RNA酶與菌的配比為24-28 U/g濕菌。
在加入溶菌酶、DNA酶和RNA酶后、棄沉淀之前，再向所述培養液中加入AZ316 和e-巰基乙醇，混勻，使其作用l小時。其中，AZ316與所述菌的配比為0.2g AZ316/g濕菌；6-巰基乙醇與所述菌的配比為4.5微升e-巰基乙醇/g濕菌。
下面以具體的實施例進一步詳細闡述本發明方法。
實施例l、人黑色素皮質激素受體4蛋白(人MC4R蛋白)的表達、純化 一、人MC4R蛋白的表達 1、人MC4R蛋白編碼基因的擴增 設計擴增人MC4R蛋白編碼基因的引物序列，如下
引物1 : 5， -ACCTGCAT ATG GTG AAC TCC ACC CAC CG -3， (橫線部分為限 制性內切酶Nde I的識別序列)
引物2 : 5' -TACGTA CTCGAG ATA TCT GCT AGA CAA GTC ACA AAG-3， (橫線 部分為限制性內切酶Xho I的識別序列)PCR擴增以從Novagen公司購得的質粒為模板，質粒的名稱是pET-21a-d(+)， 在引物1和引物2的引導下，進行PCR擴增。上述擴增條件為先95。C 2分鐘； 再95°C 30秒，57°C 30秒，72 °C 1分10秒，共30個循環；最后72°C IO分鐘。
2、 表達載體的構建
將步驟l獲得的PCR產物用限制性內切酶Ndel和Xhol進行酶切，回收目的 片段，將目的片段與經與用限制性內切酶Nde I和Xho I酶切后的pET21b載體連 接，得到重組表達載體pET21b-MC4R。
取所獲得的連接產物1微升，加入100微升大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中， 輕輕混勻后冰浴2 O分鐘；再在42。C水浴中靜置90秒，熱休克后立即放置在冰上； 2分鐘后加入室溫的LB培養基1毫升，在37t、轉速為200轉/分鐘的搖床上水 平震蕩30分鐘；取100微升轉化物涂于含50微克/毫升氨節青霉素的LB瓊脂培 養板上，37i:培養16小時；挑選陽性克隆，提取質粒，進行測序鑒定，測得重組 質粒中插入的外源基因的序列如序列表中序列l所示，與人MC4R的DNA序列(人 MC4R DNA序列的Genebank號是麗一005912)比較，結果完全一致。
3、 人MC4R蛋白的表達
按照步驟2中所述方法制備和篩選含有重組表達載體pET21b-MC4R的陽性重組 菌，將重組菌置于裝有M9培養基的搖瓶中，在37t:、轉速為225轉/分鐘的搖床 上水平震蕩培養至其OD,值為0. 65;將搖瓶轉移至12t:搖床中，同樣在轉速為225 轉/分鐘(旋轉半徑為26mm)的條件下水平震蕩培養至其OD,升到0. 95，此時用 1.0 mM IPTG進行誘導(IPTG在菌液中的終濃度為1.0 mM)，培養48-60小時，得 到發酵培養液。其中，培養基M9的組成為Na2HP04 [142Da] 6.0g/L; KH2P04[136 Da] 3. 0 g/L; NaCl [58. 5 Da] 0. 5 g/L;蔗糖4. 0 g/L; NH4C1 [53. 49 Da] 1. 0 g/L; CaCl2 [111 Da] 0.0111 g/L; MgS04 [120 Da] 0. 12 g/L;氨節青霉素50 mg/L ;余 量為水。
離心收集菌體，懸浮于細胞破碎液(細胞破碎液的組成為70mMTris， 300 mM NaCl，其余為水；pH8. 0)，凍存于-80 °C。 二、人MC4R蛋白的純化
在4。C下，取15毫升步驟一中3所得到的菌液(約1克濕重細菌)，將其加入 20ml細胞破碎液和3. 5微升P -巰基乙醇中，然后進行超聲波破碎(超聲強度30W; 超聲環境為冰水混合物；總超聲時間為8分鐘，每超聲5秒鐘，間隔7秒鐘)；超
8聲破碎后，向其中加入溶菌酶溶液(lmg/L) 、 DNA酶溶液(50iig/L)和RNA酶溶 液(20y g/L)(溶菌酶與菌的配比為440 U/g濕菌，DM酶與菌的配比為550 U/g 濕菌，RNA酶與菌的配比為26U/g濕菌)，混勻l小時；再向其中加入4ml5。/c)(質 量百分含量)的AZ316 (AZ316與菌的配比是0.2gAZ316/g濕菌)和4. 5微升e -巰基乙醇(P-巰基乙醇與菌的配比是4.5微升e-巰基乙醇/g濕菌)，混勻l小 時；然后在4'C條件下以大約27， 000 g的速度離心15分鐘后，棄去沉淀物，取上 清。
將上述得到的所有上清液進行鎳柱親和層析純化，方法如下將上清液上樣于 lml鎳柱(Qiagen公司產品)，然后依次用25個柱體積的洗滌緩沖液1 、 10個柱 體積的洗滌緩沖液2、 5個柱體積的蛋白洗脫緩沖液進行洗脫，蛋白洗脫緩沖液的 流速為1 ml/分鐘，收集用蛋白洗脫緩沖液洗脫下來的洗脫峰即是純化產物。親和 層析的洗脫圖譜如圖l所示。
洗滌緩沖液l的組成為0.2% (質量百分含量)AZ316， 20 mM Tris， 200 mM NaCl, L4raM P-巰基乙醇，其余為水，pH8.0;
洗滌緩沖液2的組成為0.2% (質量百分含量)AZ316, 30函咪唑，20mMTris， 200 raM NaCl， 1. 4raM 巰基乙醇，其余為水，pH8. 0;
蛋白洗脫緩沖液的組成為0.2% (質量百分含量)AZ316、 250 mM咪唑，20 raM Tris， 200 mM NaCl， 1.4mMP-巰基乙醇，其余為水，pH8. 0。
吸取20微升純化產物加至1.5 ml潔凈的離心管中，向其中加入20微升2X SDS上樣緩沖液混勻，取15微升進行SDS-PAGE電泳。
上述表達和純化的步驟中同時以空載體pET21b作為對照。
電泳結果表明，純化得到的蛋白的分子量與預期的一致，轉入空載體pET21b 的菌中未得到與MC4R分子量相當的蛋白條帶，表明得到的蛋白即是目的人MC4R蛋 白。目的條帶的SDS-PAGE電泳結果如圖2所示(泳道1為人MC4R蛋白的純化產物， 泳道2為蛋白質標記物)。
實驗設3次重復，結果取其平均數。結果表明，3次重復的280納米吸光值的 平均值為0.0217，計算得到每升發酵液產2. 77毫克MC4R蛋白。
每升發酵液中產生的MC4R蛋白的數量是按照如下公式計算得到的
蛋白產量(mg) = (0D28。/0. 183) X蛋白體積(ml) X (15/35) X 2。序列表
<160>1
〈210〉 1
<211> 1023
<212〉 DNA
<213〉人屬人(/fo膨sa/7ie/ 50
<400〉
atggtgaact t3csgsctgc tscg3gc33C gagaatatct tttttc3tct accattgtca attgataatg ctttcaattg atgacagtta ggcattttgt
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CC3CC3CC3C
1023
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 102〇
10
權利要求
1、一種制備人黑色素皮質激素受體4蛋白的方法，包括如下步驟將人黑色素皮質激素受體4蛋白的編碼基因插入pET系列載體的多克隆位點，得到含有所述編碼基因的重組表達載體，再將所述重組表達載體導入大腸桿菌BL21中，得到含有所述編碼基因的重組菌，培養所述重組菌，得到人黑色素皮質激素受體4蛋白。
2、 根據權利要求l所述的方法，其特征在于所述培養包括如下步驟將所述重組菌先在37。C條件下培養至菌液的0D,值為0. 65，再在12。C條件下培養至菌 液的0D,值為0. 95，然后用異丙基-3 -D-硫代半乳糖苷進行誘導培養。
3、 根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述培養在振蕩條件下進行， 所述振蕩的轉速為225轉/分鐘，旋轉半徑為26 mm;所述誘導培養的時間為48-60 小時。
4、 根據權利要求l、 2或3所述的方法，其特征在于所述重組表達載體是通 過將所述編碼基因插入載體pET21b的多克隆位點得到的；所述編碼基因的核苷酸 序列如序列表中序列1所示。
5、 根據權利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于所述培養用到的培養 基的組成為Na2HP04 6 . 0 g/L; K跳3. 0 g/L; NaCl 0. 5 g/L;蔗糖4. 0 g/L; NH4C1 1.0 g/L; CaCl2 0.0111 g/L; MgS04 0.12 g/L;氨芐青霉素50 mg/L，其余為水。
6、 根據權利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于所述方法還包括如下 步驟取權利要求2-5中任一所述方法中所述誘導培養后得到的培養液，將所述培 養液中的細胞破碎，棄沉淀取上清液，再進行親和層析過濾，收集洗脫峰，得到人黑色素皮質激素受體4蛋白；所述親和層析過濾的方法包括如下步驟依次用洗滌緩沖液l、洗滌緩沖液2和洗脫緩沖液進行洗脫，收集所述洗脫緩沖液洗脫下來的 洗脫峰；所述洗滌緩沖液l包括0. 2%AZ316， 20 mM Tris， 200 raM NaCl， 1. 4mM P-巰基乙醇，其余為水；所述洗滌緩沖液l的pH值為8.0;所述洗滌緩沖液2包括0. 2%AZ316， 30raM咪唑，20 mM Tris， 200 mM NaCl， 1.4mM 3-巰基乙醇，其余為水；所述洗滌緩沖液2的pH值為8.0;所述洗脫緩沖液包括0.2%AZ316， 250 mM咪唑，20mMTris， 200 mMNaCl， 1.4mMe-巰基乙醇，其余為水；所述洗脫緩沖液的pH為8.0;所述百分含量均為質量百分含量。
7、 根據權利要求6所述的方法，其特征在于在所述細胞破碎前，向所述培 養液中加入細胞破碎液和P-巰基乙醇；所述細胞破碎液由70函Tris和300 mM NaCl組成，余量為水；所述細胞破碎液的pH值為8.0。
8、 根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于所述細胞破碎的方法為超 聲波破碎；所述超聲波破碎的方法為超聲強度為30W，超聲環境為O'C，總超聲 時間為8分鐘，超聲工作方式為每超聲作用5秒鐘間隔7秒鐘。
9、 根據權利要求6、 7或8所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述超 聲破碎后、棄沉淀之前還包括如下步驟向所述培養液中加入溶菌酶、DNA酶和RNA 酶，混勻。
10、 根據權利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述 加入溶菌酶、DNA酶和RNA酶后、棄沉淀之前還包括如下步驟向所述培養液中加 入AZ316和e-巰基乙醇，混勻。
全文摘要
本發明公開了一種制備人黑色素皮質激素受體4蛋白的方法。本發明所公開的制備人黑色素皮質激素受體4蛋白的方法，包括如下步驟將人黑色素皮質激素受體4蛋白的編碼基因插入pET系列載體的多克隆位點，得到含有所述編碼基因的重組表達載體，再將所述重組表達載體導入大腸桿菌BL21(DE3)中，得到重組菌，培養所述重組菌得到人黑色素皮質激素受體4蛋白。本發明所提供的制備人黑色素皮質激素受體4蛋白的方法，其產量可達2.77毫克MC4R蛋白/升發酵液；而且本發明方法具有操作簡單、成本低廉的特點。因此，本發明方法適合于工業生產中應用。
文檔編號C12N15/70GK101497890SQ200910077910
公開日2009年8月5日 申請日期2009年2月3日 優先權日2009年2月3日
發明者木 余, 劉可為, 田長麟, 賴超華 申請人:中國科學技術大學