專利名稱：：重組人干擾素a2b的基因優化及高效表達的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物
技術領域：
，具體地涉及重組人干擾素a2b編碼基因的優化、高效可溶性表達及高活性純化。
背景技術：
：重組人干擾素a2b具有廣譜抗病毒、抗腫瘤、抑制細胞增殖以及提高免疫功能等作用，是治療急慢性病毒性肝炎的首選治療藥物。但是，重組人干擾素a2b存在表達效率不高、且目的蛋白多為包涵體等工業化生產的制約因素。目前工業化生產重組人干擾素a2b的表達量約為20%30%,表達形式為包涵體蛋白，必須經過變性劑溶解包涵體，然后除去變性劑使包涵體蛋白復性等工藝步驟，獲得的蛋白活性低，比活僅為2.0x10sIU/mg。解決該問題的有效途徑之一就是通過基因序列修飾以提高表達水平并增加蛋白的可溶性表達，提高純化后蛋白的活性。
發明內容(一)要解決的技術問題本發明的目的是提供重組人干擾素a2b編碼基因的優化序列，本發明的又一目的是提供一株高效可溶性表達重組人干擾素a2b的大腸埃希氏菌。(二)技術方案本發明提供了一株高效表達可溶性重組人干擾素a2b的大腸埃希氏菌(Esc/zeWc/n'aco/z〕CGMCCNo.2827。該菌株已于2008年12月25日被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC,保藏編號為CGMCCNo.2827。本發明提供了兩條重組人干擾素a2b編碼基因的大腸桿菌密碼子優化序列IFN-a2b及hlFN-a2b，其核酸序列分別如SEQIDNo:l及SEQIDNo:2所示。本發明公開了兩條大腸桿菌密碼子優化序列IFN-a2b及MFN-a2b以及高效表達可溶性重組人干擾素a2b的大腸埃希氏菌(Esc/^Wc/n'aco//)CGMCCNo.2827在工業化生產重組人干擾素a2b中的應用。(三)有益效果本發明提供的高效表達可溶性重組人干擾素a2b的大腸埃希氏菌(&c/zm'c/^co/z〕CGMCCNo.2827，其重組人干擾素a2b基因序列是經由大腸桿菌密碼子優化的序列，目的蛋白的表達量占菌體總蛋白的50%以上，且90%以上以可溶性蛋白的形式存在。蛋白的純化，經過常規離子交換、分子篩等純化步驟，無需變性復性，獲得的蛋白活性高，達到4.Oxl08lU/mg。本發明所述的菌株于2008年12月25曰被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC,保藏編號為CGMCCNo.2827。圖1是重組人干擾素a2b編碼基因的特異性擴增片段凝膠電泳圖，泳道l為大腸桿菌密碼子優化后的IFN-a2b基因擴增結果(520bp),泳道2為大腸桿菌密碼子優化后的WFN-a2b基因擴增結果(520bp),M為DNA分子量標記DL2000;圖2是重組質粒A^M與五coRI雙酶切鑒定圖，泳道1為pET43.1a-IFNa2b(505bp+5612bp)，泳道2為pET43.1a-hlFNa2b(505bp+5612bp)，M為DNA分子量標記DL15000;圖3是重組人干擾素a2b誘導表達后的SDS-PAGE檢測圖，泳道1表示重組質粒pET43.1a-IFNa2b在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中未進行誘導表達的結果，泳道2和3表示重組質粒pET43.1a-IFNa2b在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中的誘導表達結果，泳道4和5表示重組質粒pET43.1a-hlFNa2b在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中的誘導表達結果，泳道6表示重組質粒pET43.1a-hlFNa2b在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中未進行誘導表達的結果，Ml和M2為蛋白分子量標記；4圖4是重組人干擾素a2b蛋白的可溶性表達分析圖，泳道1表示超聲破碎后離心的沉淀物，泳道2表示超聲破碎后離心的上清液，M為蛋白分子量標記；圖5是重組人干擾素a2b蛋白純度檢測分析圖，泳道l、2表示離子交換層析后層析主組分電泳純度，泳道3、4表示分子篩層析純化后主組分電泳純度，M為蛋白分子量標記；具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例1重組人干擾素a2b編碼基因的優化及克隆構建根據人干擾素IFN-a2b公布的氨基酸序列進行基因序列優化設計。IFN-cc2b前體的天然氨基酸序列如下丄環丄Z^LSC腐C^GCDLPOTHSLGS。其中，斜體字部分的17個氨基酸表示信號肽，從第18個氨基酸序列開始為成熟的人干擾素IFN-a2b蛋白。根據《分子克隆(第三版)》的經典操作對重組人干擾素a2b編碼基因按大腸桿菌密碼子偏愛性進行優化，優化設計得到的兩條基因序列分別命名為IFN-a2b及MFN-a2b，其核酸序列分別如SEQIDNo:1及SEQIDNo:2所示。通過引物兩兩搭接的方式進行IFN-a2b基因序列及hlFN-a2b基因序列的合成，設計的引物序列如表l所示表1重組人干擾素a2b編碼基因優化修飾引物設計表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>IFN-a2b-F055，-CCGGTGCTGCATGAGATGATCCAGCAGATTTTCAATCTGTTTAGCACGAA-3，IFN-a2b-F065，-AGATAGCAGCGCCGCCTGGGATGAAACCCTGCTGGATAAATTTTATACC-3'IFN-a2b-F075，-GAACTGTATCAGCAGCTGAACGATCTGGAAGCGTGTGTGATTCAGGGTGT-3，IFN-a2b-F085'-TGGCGTGACGGAGACCCCGCTGATGAAAGAAGATAGCATCCTGGCGGTG-3'IFN-a2b-F095,-CGTAAATATTTCCAGCGCATTACCCTGTACCTGAAAGAAAAGAAATATAG-3'IFN-a2b-F105，-CCCGTGTGCCTGGGAAGTTGTGCGTGCGGAGATTATGCGCAGCTTTAGC-3，IFN-a2b-Fll5，-CTGAGCACCAATCTGCAGGAAAGCCTGCGTAGCAAAGAATAATgaattcc-3'IFN-a2b-R015，-GGAATTCATTATTCTTTGCTACGCA-3'IFN-a2b-R025，-GGCTTTCCTGCAGATTGGTGCTCAGGCTAAAGCTGCGCATAATCTCCGC-3'IFN-a2b-R035，-ACGCACAACTTCCCAGGCACACGGGCTATATTTCTTTTCTTTCAGGTACA-3'IFN-a2b-R045，-GGGTAATGCGCTGGAAATATTTACGCACCGCCAGGATGCTATCTTCTTT-3，IFN-a2b-R055，-CATCAGCGGGGTCTCCGTCACGCCAACACCCTGAATCACACACGCTTCCA-3，IFN-a2b-R065'-GATCGTTCAGCTGCTGATACAGTTCGGTATAAAATTTATCCAGCAGGGT-3，IFN-a2b-R075，-TTCATCCCAGGCGGCGCTGCTATCTTTCGTGCTAAACAGATTGAAAATCT-3，IFN-a2b-R085'-GCTGGATCATCTCATGCAGCACCGGAATGGTTTCCGCTTTCTGAAACTG-3'IFN-a2b-R095'-GTTGCCAAATTCTTCCTGCGGGAAACCAAAATCATGGCGATCTTTCAGGC-3'IFN-a2b-R105，-AGCTAAACAGGCTAATACGGCGCATCTGCGCCAGCAGCATCAGGGTACG-3，IFN-a2b-Rll5'-ACGGCTGCCCAGGCTATGGGTCTGCGGCAGATCGCACATATGGGATCCCG-3，hIFN-a2b-F015,-GGAATTCCATAtgtgtgacctgccgcagacccactctctgggttctcgtcgtaccctga-3'將表1中設計合成的22條引物(IFN-a2b-F01到IFN-a2b-Fll共11條，IFN-a2b-R01到IFN-a2b-Rll共11條)混合后進行PCR預反應，使用TaqDNAPolymerase(Sigma,Cat.No.Dl806)，PCR反應體系如下10xPCRBuffer5単dNTPmix(2.5mMeach)4.0^1上述22條引物(10nM)各1.5(xlTaqDNAPolymerase(5U/nl)l.OplddH207.0nlTotalVolume50.0nl用bio-radPTC-240PCR儀進行反應，PCR循環條件為195。C3min295°C30s365。C30s472°Clmin5Step2~45cycles695°C30s760。C30s6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>以PCR預反應的產物為模板，進行IFN-a2b基因序列及hlFN-a2b基因序列的擴增，使用TaqDNAPolymerase(Sigma,Cat.No.Dl806)，PCR反應體系如下1OxPCRBuffer5.0|xldNTPmix(2.5mMeach)4.0^1IFN隱a2b-F01或WFN-a2b-F01(10pM)2.(^1IFN-a2b-R01(10nM)2.0^1TaqDNAPolymerase(5U/nl)1.OnlddH2036.0nlTotalVolume50.0^1用bio-radPTC-240PCR儀進行反應，PCR循環條件為195°C3min2950C30s360°C30s472°Clmin5Step2~430cycles672°ClOminPCR分別擴增獲得大小約為520bp的特異性擴增產物片段，即大腸桿菌密碼子優化后的IFN-a2b基因和hlFN-a2b基因，如附圖1所示。用QIAquickGelExtractionKits(QIAGEN)分別對PCR產物進行切膠回收純化。純化后的片段用腸I(Takara,CatalogNo.D1161A)和i"coRI(Takara，CatalogNo.D1040A)雙酶切，重組表達載體pET43.la質粒(Novagen，CatalogNo.70939-3)同樣用WeI和I雙酶切，酶切體系如下Totalvolume50.0|a1Totalvolume50.0nl將酶切純化后的片段IFN-a2b或hlFN-a2b與相同酶切的原核表達載體pET43.la用T4DNA連接酶(Takam，CatNo.D2011A)進行連接，連接反應體系如下將上述體系混勻，瞬時離心，16。C連接過夜。連接產物轉化co/z'DH5a感受態細胞(TIANGEN,Cat.No.CB101-02)，涂含lOOmg/LAmp的LB篩選平板，挑取單克隆在培養擴增后用QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGEN，Cat.No.27106)進行抽提，用AfcfeI和I進行雙酶切鑒定，大小正確的重組質粒(酶切大小為505bp+5612bp,如附圖2所示)送人類基因組北方中心(諾賽基因)進行基因序列測定，測序正確的重組質粒命名為pET43.1a-IFNa2b及pET43.1a-hlFNa2b。實施例2重組質粒轉化大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)及重組人干擾素a2b的誘導表達將測序正確的重組質粒pET43.1a-IFNa2b及pET".la-hlFNa^分別轉化大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)(Novagen,CatalogNo.69450)的感受態細胞，涂布含100mg/LAmp的LB篩選平板，表達菌株分別命名為BL21(DE3)10xT4DNAligasebufferIFN-a2b或hlFN-a2bpET43.1aT4DNAligaseddH20_Totalvolume載體酶切體系10xHbuffer5単遜I1.0|il五coRIl.OulpET43.1a15.0nlddH2028単片段酶切體系10xHbuffer敲IIFN-a2b或hIFN-a2bddH20<q<q<q刀<qolLiooooo<r8/pET43.1a-IFNa2b及BL21(DE3)/pET43.1a-h顧a2b。在含100mg/LAmp的LB平皿中挑取表達菌BL21(DE3)/pET43.1a-IFNa2b及BL21(DE3)/pET43.1a-hlFNa2b的單克隆接入5ml含100mg/LAmp的LB液體試管培養基中，37°C、200rpm條件下培養至OD值約為0.8(大約4-5h),加入IPTG(終濃度為lmM)在3(TC、150rpm條件下進行誘導表達。同時設置未加IPTG的對照菌，6小時后，以6000rpm離心3min收獲菌體。用PBS的洗兩遍后加入蛋白上樣緩沖液，沸水洛煮沸5min,12000rpm離心2min后，用上清液進行SDS-PAGE檢測。配制12%的聚丙烯酰胺凝膠，加入上述處理后的樣品，上層膠以8V/cm的電壓，分離膠以15V/cm的電壓進行電泳，至溴酚藍到達分離膠底部時，停止電泳，切下分離膠，考馬斯亮藍染色lh后用脫色液進行脫色，待蛋白條帶清晰后進行拍照。SDS-PAGE檢測結果如附圖3所示未誘導的表達菌(泳道1和泳道6)未能檢測到重組人干擾素a2b蛋白的表達;IPTG誘導表達6h后的BL21(DE3)/pET43.1a-IFNa2b菌體(泳道2和泳道3)中能檢測到重組人干擾素a2b蛋白的表達(表觀分子量約19kD,目的蛋白表達量約占菌體總蛋白的15%);IPTG誘導表達6h后的BL21(DE3)/pET43.1a-hlFNa2b菌體(泳道4和泳道5)中能檢測到重組人干擾素a2b蛋白的高效表達(表觀分子量約19kD,目的蛋白表達量大于菌體總蛋白的50%)本發明所述的菌株BL21(DE3)/pET43.1a-hlFNa2b于2008年12月25日被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC,保藏編號為CGMCCNo.2827。實施例3重組人干擾素a2b蛋白的可溶性表達分析在含100mg/LAmp的LB平皿中挑取表達菌BL21(DE3)/pET43.1a-hlFNa2b的單克隆接入20ml含100mg/LAmp的LB液體三角瓶培養基中，37°C、200rpm條件下培養過夜，以1:200的比例轉接于4L含新鮮9LB液體培養基(100mg/LAmp)的發酵罐中，37。C培養至OD600達0.6時，加IMIPTG至終濃度為lmM進行誘導表達6h，在4。C，6000rpm條件下離心15min收集菌體。用0.9。/。NaCl溶液洗滌菌體，在4。C，6000rpm條件下離心15min收集沉淀。按照lg菌體對應10111188^1"17.2)的比例加入？88緩沖液，充分混句，在冰水洛中，使用600W(超聲頻率)，5s(超聲時間)，15s(間歇時間)進行超聲破菌15min。吸取lml的超聲破碎液于4°C,13000rpm條件下離心5分鐘，吸出上清100pl加入IOOmI的蛋白上樣緩沖液，沉淀用PBS洗滌1次后再用lOOjil的PBS重懸并加入100ial的蛋白上樣緩沖液，沸水洛煮沸5min后，各取15樣品進行SDS-PAGE蛋白電泳以檢測重組人干擾素a2b蛋白的可溶性。SDS-PAGE檢測結果如附圖4所示超聲破碎后的沉淀物(泳道1)和上清(泳道2)中均有重組干擾素a2b蛋白的表達(表觀分子量19kD處)，且在相同上樣體系(15jil)條件下，超聲破碎后上清中重組干擾素a2b蛋白的表達量要高于超聲破碎后的沉淀物。由于上清液(lml)與沉淀物(IOOmI)的體積比為10:1。所以在誘導后的表達菌株中，重組人干擾素a2b蛋白的90%以上以可溶性蛋白的形式存在。實施例4重組人干擾素a2b蛋白的表達純化及活性測定實施例3中菌體超聲破碎后上清液，經離子交換層析、超濾濃縮、分子篩層析純化后，獲得純度99。/。以上重組人干擾素a2b蛋白。電泳純度檢測結果見附圖5。離子交換層析后層析主組分(泳道l、2)，電泳純度98%;分子篩層析純化后(泳道3、4)，電泳純度99%以上。經細胞病變抑制法測活，比活達到4.0x108IU/mg。10序列表序列表<110〉北京凱因科技股份有限公司<120>重組人干擾素a2b的基因優化及高效表達〈130>kawin0812〈160〉2〈170〉Patentlnversion3.2〈210>1<211>520<212>腿<213〉大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)<400>1cgggatcccatatgtgcgatctgccgcagacccatagcctgggcagccgtcgtaccctga60tgctgctggcgcagatgcgccgtattagcctgtttagctgcctgaaagatcgccatgatt120ttggtttcccgcaggaagaatttggcaaccagtttcagaaagcgg犯accattccggtgc180tgcatgagatgatccagcagattttcaatctgtttagcacgaaagatagcagcgccgcct240ggg3tg犯3Ccctgctggataaat111ataCCg犯Ctgt3tcagcagctgaacgatctgg300aagcgtgtgtgattcagggtgttggcgtgacggagaccccgctgatgaaagaagatagca360tcctggcggtgcgtaaatatttccagcgcattaccctgtacctgaaagaaaaga犯tat3420gcccgtgtgcCtgggElElgttgtgcgtgcggagattatgcgcagctttagcctgagcacca480atctgcaggaaagcctgcgt犯tg犯ttcc520<210>2<211>502<212〉腿〈213〉大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)<400〉2atgtgtgacctgccgcagacccactctctgggttctcgtcgtaccctgatgctgctggcg60cagatgcgccgtattagcctgtttagctgcctgaaagatcgccatgattttggtttcccg120caggaagaatttggcaaccagtttcagaaagcggaaaccattccggtgctgcatgagatg180atccagcagattttcaatctgtttagcacga犯gatagcagcgccgcctgggatgaaacc240ctgctggataaattttataccgaactgtatcagcagctgaacgatctggaagcgtgtgtg300attcsgggtgttggcgtgacggagaccccgCtg3tg犯3g犯gatagcatcctggcggtg360cgt犯atatttccagcgcattaccctgtacctg犯aga^agaaatatagcccgtgtgcc420tggg犯gUgtgcgtgcggagattatgcgcagctttagcctctgcaggaa480agcctgcgtagca犯gaataat5021權利要求1、兩條重組人干擾素a2b編碼基因的大腸桿菌密碼子優化序列IFN-a2b及hIFN-a2b，其核酸序列分別如SEQIDNo1及SEQIDNo2所示。2、一株高效表達重組人干擾素a2b的大腸埃希氏菌(Esc/7er/c/2/aco//)CGMCCNo.2827。3、根據權利要求1所述的大腸桿菌密碼子優化序列IFN-a2b及MFN-a2b在工業化生產重組人干擾素a2b中的應用。4、根據權利要求2所述的大腸埃希氏菌在工業化生產重組人干擾素a2b中的應用。全文摘要本發明提供了兩條重組人干擾素a2b編碼基因的優化序列，以及一株高效表達重組人干擾素a2b的大腸埃希氏菌。本發明提供的高效表達重組人干擾素a2b的大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)CGMCCNo.2827，其重組人干擾素a2b基因序列是經由大腸桿菌密碼子優化的序列，目的蛋白的表達量占菌體總蛋白的50％以上，且表達的蛋白更易于純化并具有更高的活性。文檔編號C12P21/02GK101508994SQ20091007777公開日2009年8月19日申請日期2009年2月19日優先權日2009年2月19日發明者春吉,周德勝,張春麗申請人:北京凱因科技股份有限公司