專利名稱：：一種聯合檢測五種烈性病原菌的基因液相芯片及其檢測方法
技術領域：
：本發明涉及一種聯合檢測炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森菌、土拉弗朗西斯菌、布魯菌和類鼻疽伯克霍爾德菌五種烈性病原菌的基因液相芯片的方法，本發明還涉及利用所述的基因液相芯片進行檢測的方法。
背景技術：
：可能用于生物恐怖的烈性病原體有很多種，包括炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森菌、土拉熱弗朗西絲菌、布魯菌、鼻疽伯克霍爾德菌、類鼻疽伯克霍爾德桿菌、出血熱病毒、肉毒毒素和蓖麻毒素等。現有的病原體檢測技術，如生物傳感器或膠體金技術等均見于生物恐怖因子的檢測。這些技術或靈敏或特異，但受限于多重檢測能力，難以對可#是樣本進行多因子篩^^。懸浮芯片(suspensionarray)也稱液相芯片(liquidarray,1iquidchip),結合了PCR技術的靈壽丈度和核酸探測，檢測時間短，通量大，可實現對疑似樣本多靶標的同時篩查。炭疽芽孢桿菌ciHusrac")是人獸共患傳染病-炭疽的病原體，為粗大的革蘭氏陽性桿菌，具有強烈的致病性、傳染性和生存能力。鼠疫耶爾森菌(Kers^iapes"s)是嚴重危害人類健康的烈性傳染病-鼠疫的病原體，革蘭氏陰性卵圓形桿菌，其天然宿主是嚙齒類動物，通過鼠蚤傳播。。土拉弗朗西斯菌(Frai7"'sei7a"7are/isis)是急性傳染病-土拉菌病(兔熱病)的病原體，革蘭氏陰性3泉桿菌，毒性強，傳播快。布魯菌(&uce7!a)是布魯菌病(brucellosic)的病原體，一組微小的球桿狀的革蘭氏陰性菌，自然界中抵抗力較強。類鼻疽伯克霍爾德菌(5lir^o油riapseudo鵬7/ei)是人獸共患病-類鼻疽病的病原體，革蘭陰性桿菌，自然界中抵抗力較強。本發明的炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森菌、土4立弗朗西斯菌、布魯菌和類鼻疽伯克霍爾德菌多重檢測液相芯片，實現重要病原菌的多元化、高通量篩查，對于預防和控制跨境傳播傳染病的傳播、應對生物恐怖、維護國家和人民生命健康安全具有重要的意義。
發明內容本發明涉及一種聯合檢測炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森菌、土拉弗朗西斯菌、布魯菌和類鼻疽伯克霍爾德菌的基因液相芯片及其制備方法，該基因液相芯片可以用于同時檢測炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森菌、土拉弗朗西斯菌、布魯菌和類鼻疽伯克霍爾德菌五種病原體。本發明還涉及利用所迷的基因液相芯片進行檢測的方法。現有的病原體檢測技術受限于多重檢測能力的困境，而許多可疑樣本需要進行多靶標的篩查，本發明的目的是通過提供一種同時檢測五種烈性病原菌液相芯片及其制備方法和應用，為五種烈性病原菌的快速檢測提供一種靈敏、特異、快速、可靠的方法。本發明的工作原理是選擇五種細菌的特異基因片段，il計針對五種細菌的特異性引物；然后設計位于擴增區域內五種細菌的特異性探針，探針偶聯不同編號的編碼微球，制備出可對上述五種細菌同時檢測的液相芯片，在應用時，首先使用上述引物對五種細菌進行多重PCR擴增，然后加入擴增的PCR產物，使微球上的捕獲探針捕獲相應的PCR產物，再與鏈親和素-藻紅蛋白(SA-PE)反應，通過LUMINEX檢測系統(如LUMINEX100，L畫INEX200,Bio-plex,LIQUICHIP等),實現對五種細菌的一次性檢測。本發明的液相芯片包括編碼微球、與編碼微球偶聯的捕獲探針、生物素化的引物、PCR反應體系、鏈親和素一藻紅蛋白(SA-PE)。本發明所述的PCR反應體系包括IOxPCR緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶(Taq酶)、生物素化的引物、去離子水。本發明所用的編碼微球可以來源于L函INEX、BI0-RAD、QIAGEN、GENE等公司，可以選用任意編號作為編碼微球，例如選自上述公司的第044，042,032,025，034,027號微球。本發明的引物可以在本領域技術人員公知的范圍內采用常規生物技術進行篩選、設計或購買，本發明的引物序列可以例如是炭疽芽孢桿菌(Sacinusa/3"racfsj(簡稱炭疽菌)兩對引物，其中一對位于染色體、一對位于質粒，序列如下BA-1-F:5，-TGGACGCATACGAGACATAAT-3'BA-1-R:5，-TGCTTTAGCGGTAGCAGAGG-3，BA-2-F:5，-TTTCATAATCATGGATTTCCCG-3，BA-2-R:5，-TTACCCAACATCATCTTCGCA-3'鼠疫耶爾森菌(rers/dapes"s)(簡稱鼠疫菌)位于染色體YP-F:5，-ACTCAATGTTGTGACGAGGATG-3'YP-R:5，-TTACTTCTAATGCCATCAGGTAGC-3，布魯菌(Sriice』h):Bru-F:5，-TGGCTCGGTTGCCAATATCAA-3'Bru-R:5，-GCGCTTGCCTTTCAGGTCTG-3'土拉弗朗西斯菌(Fra/i"'senaM7are;isis)(簡稱土拉菌)fopAFT-F:5，-GGGCAAATCTAGCAGGTCMG-3,FT-R:5，-GCTGTAGTCGCACCATTATCCT-3，類鼻疽伯克霍爾德菌drWwMeWapset^o,朋nei)(下面簡稱類鼻疽菌)BP-F:5，-CGATCTCGTCAAGGTGTCGG-3'BP-R:5，-ccccagttcatctgatacttgc-3'本發明所述的生物素化是指在引物合成時將引物序列5'端用生物素進行標記。在本發明的PCR體系中，引物對的濃度分別可以是60-150nmol/L。在上述PCR體系中,dNTPs的濃度可以是O.05-0.5nnol/L。在上述PCR體系中，Taq酶濃度可以是l-5U/30jj1。優選的pcr反應體系為30jjl體系1(^pcr緩沖液3jj1;Taq酶2U;2.5mmol/LMg2+;0.2Ilnol/LdNTP引物FT-F、FT-R的濃度分別為60-100nmol/L,;引物BP-F、BP-R的濃度分別為60-lOO細ol/L;引物BA-1-F、BA-1-R、BA-2_F、BA-2-R、YP-F、YP-R的濃度分別為90-110nmol/L;引物Bru-F、Bru-R的濃度分別為100-150mnol/L;DNA模板2jal;ddH20補足至30ju1。PCR反應的條件94°C10分鐘；94°C30s，58°C30秒，72°C30秒，30個循環；72。C延伸7分鐘。上述反應條件為根據ABI9700的擴增儀優化的反應條件，采用其他儀器可根據情況對反應條件進行調整，這是本領域技術人員所公知的。本發明所述的捕獲探針序列如下炭疽菌探針l:5，-GAAGAACGCAGGCTTAGATTGGT-3'炭疽菌探針2:5，-CTCGCTTTCATCGCATTTCTCCC-3，鼠疫菌探針5，-AACAGTAAGCATCCAGTCGTTCATA-3'布魯菌探針5，-TTACGCAGTCAGACGTTGCCTAT-3，土拉菌探針5，-TGCTGGTTTAACATGGTTCTTTGG-3，類鼻疽菌探針5，-AGGTCAATTTCCCGAACAAGACT-3，上面所述探針在合成時5'端都氨基修飾且連上15-2O個T作為間隔，然后偶聯所述的編碼微球本發明涉及一種上述液相芯片的制備方法，該方法包括(1)微球與捕獲探針偶聯(2)分別選取一定編號的編碼微球，例如所述編碼微球選自044,042,032,025，034,027號微球；洗滌，活化；分別對應加入炭疽菌探針1和探針2，鼠疫菌探針，布魯菌探針，土拉菌探針，類鼻疽菌探針；混勻，室溫下孵育3060min;重復l~2次；用PBST(即磷酸鹽-吐溫緩沖液)洗l~2次；用0.1%SDS(即十二烷基磺酸鈉)洗l~2次；微球重懸于TE緩沖液中，計數單位濃度；4t:避光保存。本發明涉及利用上述液相芯片同時準確檢測上述五種生物恐怖菌的檢測方法，該方法包括1、待檢測樣本核酸的提取，2、進行多重PCR反應，其中配制一定組分濃度的、一定體積例如30ia1的PCR反應體系，3、捕獲探針捕獲PCR產物將偶聯有探針的微球與生物素化標記的多重PCR產物混合，在95。C變性5-10分鐘，456(TC雜交1030分鐘，探針即可特異性捕獲對應的PCR產物，然后再加入鏈親和素-藻紅蛋白。在第一步的待檢測樣本核酸的提取中，待檢樣本核酸的提取可以采用酚-氯仿抽提方法，或者使用一般的商品化試劑盒提取，或者采用NaI(即碘化鈉)裂解-玻璃粉吸附法。在上述多重PCR反應中，最優選按照以下濃度配置PCR反應體系，30ial體系1(^PCR緩沖液3(i1;Taq酶2U;2.5醒ol/LMg'+;0.2rbol/LdNTP;FT-F、FT-R各80nmol/L,BP-F、BP-R各80nmol/L，BA-1-F、BA-1-R、BA-2-F、8BA-2-R、YP—F、YP—R各IOOnmol/L,Bru—F、Bru—R各120nmol/L;向PCR管中加入模板2ial，再加ddH2O補足30ja1。反應條件94°CIO分鐘；94°C3Q秒，58°C30秒，72°C30秒，30個循環；72。C延長至7分鐘。在捕獲探針捕獲PCR產物的步驟中，將偶聯有4笨針的微球與生物素化標記的多重PCR產物混合，在95。C變性5~IO分鐘，4560。C雜交1030分鐘，探針即可特異性捕獲對應的PCR產物，然后再加入鏈親和素一藻紅蛋白，帶有熒光的報告分子則與生物素結合，此復合體通過懸浮芯片檢測系統，通過紅、綠兩束激光檢測，紅色激光激發孩i球基質的染料從而對微球編號進行識別，綠色激光對表面結合的熒光染料進行識別，實現捕獲探針捕獲的PCR產物的定量分析。附圖為DNA濃度——編碼微球表面的平均熒光強度(MFI)劑量反應曲線，橫坐標為濃度fg/反應體系，縱坐標為MFI值，其中圖1為土拉弗朗西斯菌DNA濃度一MFI劑量反應曲線；圖2為布魯菌(M5抹)DNA濃度一MFI劑量反應曲線；圖3為炭疽芽孢桿菌探針1檢測的DNA濃度一MFI劑量反應曲線；圖4為炭疽芽孢桿菌探針2檢測的DNA濃度一MFI劑量反應曲線；圖5為類鼻疽伯克霍爾德菌DNA濃度一MFI劑量反應曲線；圖6為鼠疫耶爾森菌(EV76林)DNA濃度一MFI劑量反應曲線。具體實施例方式本發明以檢測五種生物恐怖菌的檢測方法，下面通過具體實施方式對本發明作進一步說明，但本發明不以任何方式受下列實施例的限定。實施例l:采用五種細菌六對引物的多重PCR反應1.樣本中核酸的提取Nal裂解-玻璃粉吸附法提取核酸。2.按以下體系配制多重PCR反應體系，總體積30pl:10xPCRbuffer:3piTaqE:0.4^1dNTPs:0.6)^1BA-1-F,BA-1-R(IOBO:各O.3EEBA-2-F，BA-2-R(10m):各O.3EEYP-F,YP-R(10FM):各O.3niBru-F,Bru-P():各O.36niFT-F，FT-R(IOEM):各O.24IHBP-F,BP-R(1OEM):各O.24rE模板DNA:2EI1ddH20:加至30m3.按以下的反應條件進行PCR反應預變性94°CIG分鐘32個循環94°C30秒58°C30秒72°C40秒延伸72°CIG分鐘反應結束后以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增情況。PCR陰性對照除不加模板而以(1朋20代替外，其余體系相同。實施例2:捕獲探針與微球偶聯1.分別選耳又044，042,032，025,034，027號的編碼《設J求，用》走渦才展蕩器振蕩微球懸液，使微球混合均勻。2.分別取上述微球大約1.25xl0'個，分別轉移至離心管，14000g離心3-5Min，小心吸出上清。3.加入50TI0.lmol/L的2-(n-嗎啉代)乙磺酸溶液，振蕩20-30S,超聲20-30s,使微球重懸。4.用蒸餾水將合成的寡核苦酸探針稀釋到0.lmmol/L。5.將in稀釋的探針加于微球懸浮液中，對應于044,042，032,025，034,027號編碼微球分別加入炭痘菌探針i,探針2,鼠疫菌探針，布魯菌探針，土拉菌探針，類鼻疽菌探針，振蕩混勻。6.加入2.5ni新鮮配制的10mg/mL的EDC溶液至微球與探針混和液中，振蕩混勻。7.用鋁箔包裹離心管避光，漩渦振蕩器上400-600rpm振蕩，室溫孵育30分鐘。8.再次加入新鮮配制的10mg/mLEDC。9.再次在漩渦振蕩器上400-600rpm振蕩，室溫避光孵育30分鐘。10.用0.02°/。PBSTlml洗滌1次，離心14000g3-5分鐘.11.移棄上清，微球重懸于lmlG.r/。SDS中，洗滌，離心。12.移棄上清，微球重懸于100rapH8.0TE中，振蕩懸起混勻，即得到偶聯好的檢測微球。13.用血球計數器計數微球的數量，換算出每種微球的單位濃度。14.把偶聯好的檢測微球放在4。C避光保存，一般每種探針偶聯的微球單獨保存，使用時，根據檢測項目選擇要混合的微球種類。實施例3:用上述五種烈性病原菌的液相芯片檢測待測樣本1.取上述各種偶聯微球各3500個混合，分裝于PCR管中(根據微球計數結果計算相應加入量)2.向各管中加5~17n五種細菌混合模板的PCR產物使其終體積為5oni，吹打混勻。3.95"C變性10分鐘。4.4560。C反應10~30分鐘。5.轉移至96孔濾板抽濾去掉未結合的PCR產物。6.再向各孔加75H14ng/mSA-PE,室溫避光孵育10分鐘，抽濾去掉未結合的SA-PE。7.再向各孔加入75m懸浮液，振蕩使微球重懸。8.反應結束后上機檢測。9.懸浮芯片檢測系統，通過紅、綠兩束激光檢測，紅色激光激發微球基質的染料從而對微球編號進行識別，綠色激光對表面結合的萸光染料進行識別，實現捕獲探針捕獲的PCR產物的定量分析。下表為上迷五種待測病原菌的懸浮芯片檢測結果。ii<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表中Type為樣本類型，B代表陰性對照，C代表已知樣本，X代表未知樣本；BA-l為炭疽芽孢桿菌探針l，BA-2為炭疽芽孢桿菌探針2，BSA為陰性對照，Yp-2為鼠疫耶爾森菌探針，Bru-2為布魯菌探針，Ft-2為土拉弗朗西斯菌探針，Bp-2為類鼻疽伯克霍爾德菌探針，Biotin(045)為生物素陽性對照；Cl、C2、C4為炭疽芽孢桿菌樣本，C6、C7、C8為鼠疫耶爾森菌樣本，C9、C10為布魯菌樣本，Cll為陰性樣本；檢測熒光值大于等于三倍本底焚光值判為陽性，因此已知樣本全部正確識別，未知樣本X1、X2均為炭疽芽孢桿菌強陽性，類鼻疽伯克霍爾德弱陽性。附圖所示為DNA濃度一編碼微球表面的焚光強度劑量反應曲線。從圖中可以看出編碼微球表面焚光強度與加入的模板量在一定的范圍內成正相關，其中橫坐標為多重PCR時管中加入的模板DNA的量，縱坐標代表相應編碼微球表面的熒光強度。可以通過擬合的標準曲線實現對核酸的半定量分析。結論從上述結果可以得出，本發明的懸浮芯片和檢測方法具有以下優越性1.靈敏較之于普通的多重PCR反應，本發明的靈敏度提高從以下兩個方面體現l)檢測儀器存在信號的放大系統；2)PCR產物帶上的生物素與熒光染料藻紅蛋白連接的親和素結合的放大作用。2.特異采用核酸探針技術對標記上生物素的PCR產物進行特異性的識別，而非傳統的電泳方法通過PCR產物片段大小進行識別。3.高通量一次PCR反應一次檢測即可實現對多種目標菌的同時檢測。4.準確高效整合核酸體外擴增、核酸分子雜交、編碼微球、生物素標記、熒光檢測和流式細胞技術于一體，同時實現核酸樣品的檢測、鑒定，使結果準確，工作高效。5.芯片制作方便只用設計好待檢目標菌的引物，優化PCR條件，標記對應的探針于編碼微球，即可組裝成檢測體系。6.多重檢測目標靈活可調可根據不同檢測目標，選擇對應的引物和微球，組成不同目標組合的檢測體系。1權利要求1、一種聯合檢測多種病原體的方法，其特征在于，該方法使用液相芯片，所述芯片包括微球、捕獲探針、生物素化的引物、PCR反應體系、鏈親和素-藻紅蛋白(SA-PE)，所述病原體為炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森菌、土拉弗朗西斯菌、布魯菌和類鼻疽博克霍爾德菌。2、如權利要求l所述的檢測方法，其特征在于，所述的PCR反應體系包括10xPCR緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶、生物素化的引物、去離子水。3、如權利要求l所述的檢測方法，其特征在于，該方法使用的引物序列如下炭疽芽孢桿菌(5ac;'n"saWArac"):兩對引物，其中一對位于染色體一對位于質粒，序列如下BA-1-F:TGGACGCATACGAGACATAATBA-1-R:TGCTTTAGCGGTAGCAGAGGBA-2-F:TTTCATAATCATGGATTTCCCGBA-2-R:TTACCCAACATCATCTTCGCA鼠疫耶爾森菌(Fersi/n'apes"s):位于染色體，序列如下，YP-F:ACTCAATGTTGTGACGAGGATGYP-R:TTACTTCTAATGCCATCAGGTAGC布魯菌(SruceHa):序列如下，Bru-F:TGGCTCGGTTGCCAATATCAABru-R:GCGCTTGCCTTTCAGGTCTG土拉熱弗朗西絲菌(Fra/3"'se7ia"2are/2sis):fopA,序歹'J如下，FT-F:GGGCAAATCTAGCAGGTCAAGFT-R:GCTGTAGTCGCACCATTATCCT類鼻癥十專克霍爾德-菌(5urici]o/cer/apseudoffla77ei):序歹lj:i口下BP-F:CGATCTCGTCAAGGTGTCGGBP—R:CCCCAGTTCATCTGATACTTGC。4、權利要求l所述的檢測方法，其特征在于，該方法中所用的捕獲探針序列如下炭疽菌探針l:GAAGAACGCAGGCTTAGATTGGT炭疽菌探針2:CTCGCTTTCATCGCATTTCTCCC鼠疫菌探針AACAGTAAGCATCCAGTCGTTCATA布魯菌探針TTACGCAGTCAGACGTTGCCTAT土拉菌探針TGCTGGTTTAACATGGTTCTTTGG類鼻疽菌探針AGGTCAATTTCCCGAACAAGACT5、如權利要求1-4任一項所述的檢測方法，其特征在于，該方法包括步驟1、待檢測樣本核酸的提取，2、多重PCR反應，配制一定組分濃度的30ji1PCR反應體系，3、捕獲探針捕獲PCR產物將偶聯有探針的微球與生物素化標記的多重PCR產物混合，在95。C變性5~IO分鐘，45~60°C雜交1030分鐘，探針即可特異性捕獲對應的PCR產物，然后再加入鏈親和素-藻紅蛋白。6、如權利要求l所述的檢測方法，其特征在于，在引物合成時將序列5，端進行生物素標記。7、如權利要求l-4任一項所述的檢測方法，其特征在于，在所述的PCR體系中，引物對的濃度分別為60-150腿ol/L。8、如權利要求7所述的檢測方法，其特征在于，在所述的PCR體系中，dNTPs的濃度為O.05-0.50kU/L。9、如權利要求l-4所述的檢測方法，其特征在于，在所述的PCR體系中，Taq酶濃度為l-5U/30ju1。10、如權利要求5所述的檢測方法，其特征在于，PCR反應體系為30p1體系IO氺PCR緩沖液3|a1;Taq酶2U;2.5麵l/LMg'+;0.20iol/LdNTP引物FT-F、FT-R的濃度分別為60-100nmol/L,;引物BP-F、BP-R的濃度分別為60-100nmol/L;引物BA-卜F、BA-1-R、BA-2-F、BA+R、YP-F、YP-R的濃度分別為90-110nmol/L;引物Bru-F、Bru-R的濃度分別為lOO-150nmol/L;DNA模板2jj1;(1犯20補足30u1。11、如權利要求5所述的檢測方法，其特征在于，所迷PCR反應的條件94°CIO分鐘；94°C30秒，58°C30秒，72°C30秒，30個循環；72。C延伸7分鐘。12、如權利要求1-4任一項所述的檢測方法，其特征在于，PCR反應體系為30jal體系IO葉CR緩沖液3ul;Taq酶2U;2.5mmol/LMg,0.2mK)l/LdNTP引物FT-F、FT-R的濃度分別為60-10Onmol/L,;引物BP-F、BP-R的濃度分別為60—100mnol/L;引物BA-l-F、BA-1-R、BA-2-F、BA-2-R、YP-F、YP-R的濃度分別為90-110nmol/L;引物Bru-F、Bru-R的濃度分別為100—150腿ol/L;DNA模板2ial;ddtW)補足30|i1。13、一種制備權利要求i-4任一項所述的檢測烈性病原體的液相探針的方法，具體為分別選取一定編號的編碼微球；洗滌，活化；分別對應加入炭疽菌探針1和探針2，鼠疫菌探針，布魯菌探針，土拉菌探針，類鼻疽菌探針；混勻，室溫下孵育3060min;重復12次；用PBST(即磷酸鹽-吐溫緩沖液)洗12次；用O.1%SDS(即十二烷基磺酸鈉)洗12次；微球重懸于TE緩沖液中，計數單位濃度；4X:避光保存。全文摘要本發明公開了一種五種烈性病原菌炭疽芽孢桿菌、鼠疫耶爾森菌、布魯菌、土拉弗朗西斯菌、類鼻疽伯克霍爾德菌的快速檢測基因液相芯片。本發明所提供的檢測五種烈性病原菌的液相芯片具有通量大，所需樣本量少，特異性強，靈敏度高，準確高效等優點。文檔編號C12R1/01GK101560557SQ20091007881公開日2009年10月21日申請日期2009年3月4日優先權日2009年3月4日發明者劉衡川,孫肖紅,文海燕,宇楊,靜王,胡孔新申請人:中國檢驗檢疫科學研究院