專利名稱：重組腸病毒71型病毒樣顆粒的制備方法
技術領域：
本發明一般涉及人腸道病毒EV71型病毒樣顆粒(VLP)的制備方法。更具體地，本發明涉及密碼子優化后的編碼腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)P1及3⑶蛋白質的 合成多核苷酸，以及使用優化后的合成多核苷酸制備腸道病毒71型病毒樣顆粒的方法。本 發明還涉及含有上述多核苷酸的重組載體和宿主。
背景技術：
手足口病(Hand foot mouth disease,HFMD)是嬰幼兒常見的傳染病，由人腸道病 毒屬的柯薩奇病毒(Coxsackie virus) A組16、4、5、7、9、10型，B組2、5型；埃可病毒(ECHO viruses)和腸道病毒71型(EV 71)感染引起，其中以EV 71及Cox A16型最為常見[1_6]。 EV71感染引起的手足口病大部分病例病情較輕，可治愈，但少數患者可出現心肌炎、無菌性 腦膜炎和肺水腫等并發癥，嚴重時可危及生命[7_11]。截止2008年5月9日止，全國感染手 足口病近215萬例，造成34名患兒死亡，因此，研制EV71預防性疫苗對于控制嬰幼兒手足 口病的流行具有重要意義。腸道病毒71型(EV71)屬小RNA病毒，病毒基因組為約7kb的單鏈RNA，病毒顆粒 直徑約為20-30nm，由VP1、VP2、VP3、VP4四種結構蛋白組成。研究顯示，EV71四種結構蛋 白可自我組裝形成病毒樣顆粒結構(Virus-Like Particle, VLP)，具有與天然病毒顆粒相 似的空間結構。EV71VLP免疫小鼠可產生具有保護效力的中和抗體，可顯著提高攻毒試驗中 實驗動物的存活率[12]，是很有前景的預防嬰幼兒手足口病候選疫苗。
發明內容
本發明的一個目的是提供腸道病毒71型(EV71)病毒樣顆粒(Virus-Like Particle, VLP)制備方法，該方法包括(1)優化腸道病毒71病毒樣顆粒Pl基因及3⑶基因序列；(2)將優化的腸道病毒71病毒樣顆粒Pl基因及3CD基因序列克隆到質粒中；(3)用得到的質粒轉化酵母細胞；(4)從裂解的宿主細胞中分離重組腸道病毒71病毒樣顆粒。根據本發明方法的一個優選實施方案，本發明的方法中所述的酵母細胞選自釀 酒酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母、胞壁克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母或粟酒裂殖 糖酵母。本發明的方法中所述的酵母細胞優選為釀酒酵母。根據本發明方法的一個優選實施方案，本發明的方法中所述的優化是指在不改變 EV71 Pl及3CD氨基酸序列的前提下，將Pl及3CD基因序列的密碼子替換為酵母細胞偏好 (高頻使用)的密碼子，酵母偏好(高頻使用)的密碼子表見表1。本發明的方法中所述的 優化還可以包括所述序列的其他改造以適合在酵母細胞中表達，例如突變不需要的酶切位 點及影響或終止蛋白表達的位點。本發明中使用的術語偏好的密碼子具有本領域公知的含義，也稱為密碼子的偏好性(CodonPreference)，是指某些生物體更偏愛使用某些同義三聯 密碼子(即編碼相同氨基酸的密碼子)。表1酵母中偏好(高頻使用)的密碼子表TTT F 0. 59 TCT S 0. 26 TAT Y 0. 56 TGT C 0. 63TTC F 0. 41 TCC S 0. 16 TAC Y 0. 44 TGC C 0. 37TTA L 0. 28 TCA S 0. 21 TAA X 0. 47 TGA X 0. 31TTG L 0. 28 TCG S 0. 10 TAG X 0. 22 TGG W 1. 00
CTT L 0. 13 CCT P 0. 31 CAT H 0. 64 CGT R 0. 15CTC L 0. 06 CCC P 0. 15 CAC H 0. 36 CGC R 0. 06CTA L 0. 14 CCA P 0. 42 CAA Q 0. 69 CGA R 0. 07CTG L 0. 11 CCG P 0. 12 CAG Q 0. 31 CGG R 0. 04ATT I 0. 47 ACT T 0. 35 AAT N 0. 59 AGT S 0. 16ATC I 0. 26 ACC T 0. 21 AAC N 0. 41 AGC S 0. 11ATA I 0. 27 ACA T 0. 30 AAA K 0. 58 AGA R 0. 48ATG M 1. 00 ACG T 0. 14 AAG K 0. 42 AGG R 0. 21GTT V 0. 39 GCT A 0. 38 GAT D 0. 65 GGT G 0. 47GTC V 0. 21 GCC A 0. 22 GAC D 0. 35 GGC G 0. 19GTA V 0. 21 GCA A 0. 29 GAA E 0. 71 GGA G 0. 22GTG V 0. 19 GCG A 0. 11 GAG E 0. 29 GGG G 0. 12根據本發明方法的一個優選實施方案，本發明的方法中所述的密碼子優化的腸道 病毒71型病毒樣顆粒Pl基因序列和3⑶基因序列優選地分別為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2所示的序列。所使用的序列還包括根據本發明描述的優化方法對Pl及3CD基因序列 進行優化后所得的其他序列。根據本發明方法的一個優選實施方案，本發明的方法中所述的質粒為pESC-URA。根據本發明方法的一個優選實施方案，本發明的方法中所述的質粒為 PESC-P1Y-3CDY。本發明的再一個目的是提供密碼子優化后的編碼腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71) Pl及3⑶蛋白質的Pl基因和3⑶基因序列，其分別為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO: 2所示的序列。為適合在酵母中表達，根據本發明描述的方法對Pl基因和3CD基因進行改 造獲得的其他序列也屬于本發明的范圍。本發明還提供含有SEQ ID NO=I和SEQ ID NO 2所示的序列的載體，該載體優選 為 pESC-URA 或 pESC-PlY-3CDY。本發明還提供含有SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2所示的序列的酵母細胞。所述的 酵母細胞優選自釀酒酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母、胞壁克魯維氏酵母、乳克魯維 氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。所述的酵母細胞更優選為釀酒酵母。本發明的又一個目的是提供病毒樣顆粒(VLP)，而且所得的VLP可以用于基于VLP 的嬰幼兒手足口病預防性疫苗。本發明提供了編碼EV71 Pl和3⑶蛋白質的合成DNA分子。設計合成分子的密碼 子使用酵母細胞優選的密碼子予以提高表達水平。合成分子可以用作VP1、VP2、VP3、VP4四種結構蛋白的來源，所述的蛋白質可以自行裝配成VLP。所述的VLP可以用于基于VLP的疫苗制備并提供針對EV71病毒感染的預防。本發明還涉及并提供了在重組宿主細胞中同時表達EV71P1和3⑶蛋白質的方法， 該方法包括(1)將含有編碼EV71P1和3CD蛋白質的核酸的載體導入酵母宿主細胞。(2) 在允許所述的EV71P1和3CD蛋白質同時表達的條件下培養酵母宿主細胞。本發明的合成基因可以裝配到表達盒中，該表達盒含有經設計以提供在宿主細胞 中有效表達EV71P1和3CD蛋白質的序列，如啟動子和終止序列。在優選實施方案中，啟動子 為釀酒酵母GALl和GALlO啟動子，也可以使用其他公知的酵母啟動子的任何一種，如GAL7、 ADHU ADH3和PGK啟動子，或者其他真核基因啟動子。轉錄的終止子是ADHl和CYCl終止 子。VLP在形態上和真實的病毒類似并且不含有潛在的致病病毒基因組，所以為抗 病毒疫苗的開發提供了理想的備選方案。本發明涉及VP1、VP2、VP3、VP4四種結構蛋白 組成的病毒樣顆粒。VP1、VP2、VP3、VP4四種結構蛋白來源于EV71 Pl和3CD蛋白質在 酵母中的同時表達以及EV71 3⑶蛋白對于EV71 Pl的酶切。在本發明的優選方案中， 在酵母中產生EV71 VLP。酵母選自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、多形漢遜酵 母(Hansenula polymorpha)、巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)、胞壁克魯維氏酵母 (Kluyvermyces fragilis)、乳克魯維氏酵母(Kluyveromyces lactis)和粟酒裂殖糖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)。本發明還涉及EV71病毒樣顆粒在預防EV71和嬰幼兒手足口病的疫苗中的用途。
圖1 =Western Blot鑒定重組EV71衣殼蛋白的表達。(A)蛋白分子量對照(B)轉 染PESC-P1Y-3CDY酵母蛋白提取物。(C)酵母蛋白提取物。(D)轉染PESC-P1W_3CDW酵母 蛋白提取物。圖2 顯示了通過透射電鏡技術顯現的本文中描述的EV71病毒樣顆粒(VLP)的代 表樣品。條形代表lOOnm。
具體實施例方式實施例1 :EV71 Pl及3⑶基因的密碼子優化及全基因合成以下按分步驟詳細描述EV71 Pl及3CD基因的密碼子優化及全基因合成的流程。1、EV71 Pl及3CD基因的密碼子優化在本發明中，設計合成分子的密碼子使用酵母細胞優選的密碼子予以提高在酵母 細胞培養環境中的蛋白質表達水平(如圖1示)。將EV71病毒編碼的Pl和3CD基因序 列在不改變氨基酸序列的前提下轉變成含有如Sharpang Cowe (Synonymous Codon Usage inSaccharomyces cerevisiae. Yeast 7:657-678，(1991))所描述的酵母優選密碼子的優 化序列。最佳密碼子的優選和替換對在特定宿主中高水平表達外源基因具有重要意義。在 酵母中表達EV71病毒樣顆粒的優點在于成本和工藝效能合算，酵母適合于在發酵罐中大 規模生長培養。本發明的EV71 Pl和3⑶基因序列除經過密碼子優化改造外，還需要突變 不需要的酶切位點及影響或終止蛋白表達的位點，本發明優化后的序列不含有酵母識別的內部轉錄終止信號。酵母轉錄終止信號的序列在大量的科學研究中得到了研究和揭示， 例如Zaret et al. J. Mol. Biol. 176 107-135 (1984) ；Guo 禾口 Sherman，Trends Biochem. Sci. 21. 477-481(1986) ；Heidmann et al. Mol. Cell Biol. 14 :4633_4642 (1984)。根據上述 方法，最終獲得按酵母密碼子偏好設計的優化型EV71 Pl及3CD基因，分別命名為EV71 PlY 及3CDY，其序列分別為SEQ ID NO :1和SEQID NO :2所示的序列。野生型EV71 Pl及3CD 基因分別命名為EV71P1W及EV71 3CDW，其序列分別為SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示 的序列。EV71 Pl及3⑶基因編碼的氨基酸序列分別為SEQ IDNO 5和SEQ ID NO 6所示 的序列。2、密碼子優化型及野生型EV71 Pl及3⑶基因的全基因合成使用序列重疊延伸PCR法全基因合成EV71 PlY及EV71 3CDY、EV71 PlW及EV713⑶W基因，具體方法如下根據優化EV71 PlY及EV71 3⑶Y基因序列及EV71 PlW和EV71 3CDW基因序列合成多條IOObp的上下游片段，兩片段間3’端互補重疊15bp，上述上下游片 段互為模板、引物進行PCR擴增，使用凝膠回收試劑盒回收擴增片段，再以此相鄰的回收片 段互為引物、模板進行下一輪PCR擴增，得到拼接序列，再以相鄰拼接序列互為模板、引物 進行PCR拼接，回收拼接序列片段，再依此序列互為模板、引物進行PCR拼接，依此類推最終 合成全長的密碼子優化型EV71 PlY和EV71 3⑶Y和EV71 P1W*EV71 3CDW，經測序鑒定序 列無誤后在EV71 PlY和EV71 PlW基因5’、3’端分別引入不同載體的BamH I及Xho I酶 切位點，在EV71 3⑶Y和EV71 3CDW基因5’、3’端分別引入不同載體的EcoR I及Bgl II 酶切位點。實施例2 攜帶密碼子優化型EV71 Pl及3⑶的DNA編碼序列的酵母表達質粒的 構建1.大腸桿菌DH5 α感受態細胞的制備從37°C培養16 20h的新鮮平板上挑取DH5 α單菌落，接種于5ml不含抗菌素 的LB培養基中，37°C劇烈振蕩培養過夜(12 16h)。次日從上述培養物中吸取0. 5ml按 1 100轉入50ml LB培養基中繼續培養約3h，至菌液的0D600值為3時，在無菌條件下將 細菌轉移到一無菌、用冰預冷的50ml離心管中，冰浴30min。在4°C條件下，4000rpm離心 IOmin,棄上清，將管倒置lmin，使殘留培養液流盡，以IOml用冰預冷的lOOmmol/L CaCl2溶 液重懸細菌沉淀，冰浴30min。4°C，4000rpm離心lOmin，棄上清，每50ml初始培養物用2ml 預冷的含15%甘油的lOOmmol/L CaCl2溶液重懸細菌沉淀，分裝成200 μ 1每管，_80°C保存 備用。2. pESC-URA 質粒的轉化用無菌吸頭分別吸取1 μ g pESC-URA質粒加入200 μ 1DH5 α感受態細胞中，輕輕 旋轉混勻，冰浴30min。將管移入42°C水浴箱中水浴90s，然后將管快速轉移到冰浴中，使細 胞冷卻1 2min。每管加入800 μ 1不含抗生素的LB培養基，將管轉移至37 °C搖床上，溫育 45min (轉速< 150rpm)。取50 μ 1已轉化的感受態細胞，用一無菌的彎頭玻棒輕輕涂到含 相應抗生素的瓊脂平板表面，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37°C培養12 16h。3. pESC-URA質粒的小量制備分別挑取單個pESC-URA質粒轉化菌落接種于5ml含氨芐青霉素的LB培養基中，37°C劇烈振蕩培養過夜。將培養物移入1. 5mlEppendorf管中，12000rpm離心30_60s，倒 去培養液，倒置離心管，使上清流盡，用100 μ 1預冷的溶液I [50mmol/L Glucose, 25mmol/ LTris-HCl (pH 8. 0)，10mmol/L EDTA (pH8. 0)]重懸菌體，劇烈振蕩混勻；加入 200 μ 1 新鮮 配制的溶液II (0. 2mol/L NaOH, 1 % SDS)，溫和混勻，冰浴3min,至液體清亮；加入150 μ 1 預冷的溶液III (100ml中含5mol/L KAc 60ml，冰乙酸11. 5ml，水28. 5ml)溫和混勻，冰浴 10min，12000rpm離心lOmin，小心吸取上清，將上清轉移至另一離心管中，加入2倍體積的 無水乙醇室溫沉淀30min，12000rpm離心lOmin，棄上清，沉淀用70%乙醇洗一次，室溫晾 干后，用 30μ1 含 RNaseA(100y g/ml)的 TE(pH 8.0)溶解沉淀，37 °C 水浴 30 60min 后 置-20°C保存備用。
4.酵母表達質粒pESC-ΡΙΥ的構建使用限制性內切酶BamH I及Xho I消化pESC_URA質粒，然后將所回收片段與同 樣用BamH I及Xho I雙酶切回收的EV71 PlY和EV71P1W基因片段分別與酶切消化的載體 按1 4比例混合，依次加入10 X T4DNA連接酶緩沖液和T4DNA連接酶，反應體積為10 μ 1， 16°C連接過夜，取10μ1連接反應產物轉化大腸桿菌DH5ci感受態細胞。從接種轉化產物 的LB瓊脂平板上挑取若干個單菌落，接種到5ml含相應抗生素的LB培養基中，37°C劇烈振 蕩培養過夜，按前述質粒的快速小量制備方法提取質粒。并用內切酶BamH I及Xho I對質 粒進行酶切鑒定，挑選陽性重組子。命名為pESC-ΡΙΥ和pESC-PlW。5.酵母表達質粒 PESC-P1Y-3CDY 和 pESC_PlW_3CDW 的構建使用限制性內切酶EcoR I及Bgl II消化pESC_URA質粒，然后將所回收片段分別 與同樣用EcoR I及Bgl II雙酶切回收的EV713⑶Y和EV713CDW基因片段按1 4比例混 合，依次加入10XT4DNA連接酶緩沖液和T4DNA連接酶，反應體積為10 μ 1，16°C連接過夜， 取10 μ 1連接反應產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞。從接種轉化產物的LB瓊脂平板 上挑取若干個單菌落，接種到5ml含相應抗生素的LB培養基中，37°C劇烈振蕩培養過夜，按 前述質粒的快速小量制備方法提取質粒。并用內切酶EcoR I及Bgl II對質粒進行酶切鑒 定，挑選陽性重組子。命名為PESC-P1Y-3CDY和pESC-PlW_3CDW。實施例3 重組EV71病毒樣顆粒在酵母細胞中的大量表達及純化1.釀酒酵母感受態細胞的制備釀酒酵母平板中挑取單克隆菌落接種于10ml YPD培養液中，30°C振搖培養16h， 置取合適體積的過夜培養物加入48ml YPD培養液中混勻，終末0D600值為0. 5，30°C振搖 培養Ih后0D600值為0. 7，繼續培養30min后，將培養物轉入50ml無菌的離心管中，室溫 1500rpm離5min，棄上i青，用 10ml Sc EasyComp transformation kit (Invitrogen)中白勺 溶液I重懸沉淀，室溫1500rpm離心5min，小心棄上清，用Iml溶液II重懸沉淀，50 μ 1/管 分裝滅菌的1. 5ml離心管中，置_70°C保存。2.酵母表達質粒PESC-P1Y-3CDY和PESC-P1W_3CDW轉化酵母感受態細胞將4μ 1 PESC-P1Y-3CDY和pESC-PlW_3CDW質粒分別加入酵母感受態細胞中，加入 500 μ 1溶液III，在渦旋振蕩器上劇烈振蕩混勻。將DNA/酵母混合物置30°C水浴中孵育 Ih,每隔15min在渦旋振蕩器上劇烈振蕩混勻。取100 μ 1涂布URA選擇平板，置30°C孵箱 中倒置培養。隨機挑取5個單克隆菌落接種于10ml URA選擇培養液中，30°C振搖培養16h， 使用天根生物公司酵母質粒提取試劑盒提取酵母質粒，PCR法篩選陽性克隆。
3.重組EV71病毒樣顆粒在酵母細胞中的大量表達及純化(1)重組EV71病毒樣顆粒在酵母細胞中的大量表達接種單菌落攜帶 PESC-P1Y-3CDY和pESC_PlW_3CDW質粒的酵母細胞于50mlURA選擇培養液中，30°C振搖培養 16h，取合適體積的過夜培養液接種200ml URA選擇培養液中，30°C振搖培養4h，取合適體 積的培養液接種3L URA誘導培養液(2%半乳糖)，30°C振搖培養48h，離心收集菌體沉淀， PBS緩沖液重懸，APV高壓均質儀破碎3次，4°C 8000g離心15min，收集上清置-70°C保存。(2)重組EV71病毒樣顆粒的純化取酵母破碎上清液置45 %蔗糖墊， 180C IOOOOOg離心4h，PBS緩沖液重懸沉淀，4°C 13000g離心15min，收集上清液置_70°C保 存。實施例4 重組EV71病毒樣顆粒的鑒定及電鏡觀察1. Western Blot鑒定重組EV71衣殼蛋白的表達取20 μ 1純化的EV71病毒樣顆 粒懸液進行10% SDS-PAGE電泳。用識別EV71VP1蛋白的多克隆抗體(abeam公司，產品號 ab26858)為一抗，熒光標記羊抗雞抗體為二抗進行Western Blot分析，結果顯示，檢測到 EV71特異性條帶。2.重組EV71病毒樣顆粒的電鏡觀察取20 μ 1純化的EV71病毒樣顆粒懸液用磷 鎢酸負染，在透射電鏡下觀察病毒樣顆粒的形態。結果顯示，電鏡下可見直徑約30-40nm的 病毒樣顆粒的存在。參考文獻[1]Schmidt NJ, Lennette EH, Ho HH. An apparently new enterovirusisolated from patients with disease of the central nervous system. J InfectDis 1974 ; 129 : 304-9.[2]Chumakov M, Voroshilova M, Shindarov L, Lavrova I, GrachevaL, Koroleva G.Enterovirus 71 isolated from cases of epidemicpoliomyelitis-like disease in Bulgaria. Arch Virol 1979 ；60 :329_40·[3]AbuBakar S, Chee HY, Shafee N, Chua KB, Lam SK. Moleculardetection of enterovirus from an outbreak of hand,foot and mouth diseasein Malaysia in 1991. Scand J Infect Dis 1999 ；31 :331_53L[4]Ho M， Chen ER, Hsu KH, Twu SJ, Chen KT, Tsai S F. Anepidemic of enterovirus 71 infection in Taiwan. Taiwan EnterovirusEpidemic Working Group. New Engl J Med 1999 ；341 :929_35.[5]AbuBakar S, Chee HY, Al Kobaisi MF, Xiaoshan J, Chua KB, Lam SK. Identification of enterovirus 71 isolates from an outbreak ofhand, foot and mouth disease (HFMD) with fatal cases ofencephalomyelitis in Malaysia. Virus Res 1999；61 :l-9.[6]da Silva EE, Winkler MT, Pallansch MA. Role of enterovirus 71 inacute flaccid paralysis after the eradication of poliovirus in Brazil. EmergInfect Dis 1996 ；2 231-3[7] Ng DK, Law AK, Cherk Sff, Mak KL. First fatal case ofenterovirus 71 infection in Hong Kong. Hong Kong Med J 2001 ；7 193-6.
[8] Shieh WJ, Jung SM, Hsueh C， Kuo TT, Mounts A, Parashar U. Pathologic studies of fatal cases in outbreak of hand，foot，and mouthdisease,Taiwan. Emerg Infect Dis 2001 ；7 146-8.[9]McMinn P，Stratov I，Nagarajan L，Davis S. Neurologicalmanifestations of enterovirus 71 infection in children during an outbreakof hand, foot， and mouth disease in Western Australia. Clin Infect Dis2001 ；32 :236_42·[10] Chan LG，Parashar UD，Lye MS，Ong FG，Zaki SR，Alexander JP. Deaths of children during an outbreak of hand，foot，and mouth disease inSarawak,Malaysia clinical and pathological characteristics of the disease. For the Outbreak Study Group. Clin Infect Dis 2000 ；31 :678_83·[11]Wong KT, Lum LC, Lam SK. Enterovirus 71 infection andneurologic complications. New Engl J Med 2000 ；342 356-8.[12]Wu CN，Lin YC，Fann C，Liao NS，Shih SR, Ho MS. Protectionagainst lethal enterovirus 71 infection in newborn mice by passiveimmunization with inactivated virus and subunit VPl vaccine. Vaccine2001 ；20 :895_904·序列表〈110〉北京工業大學〈120〉重組腸病毒71型病毒樣顆粒的制備方法〈130〉<160>6<170>PatentIn version 3.4<210>1<211>2589<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉1atgggatcac aagtttcaac ccagaggtct ggttcacacg aaaactcaaa ctcagccact 60gagggatcta ctattaacta tacaacaatc aactactata aggactcata tgcagcaact 120gctggaaaac agtctttgaa gcaagatcca gacaagttcg ccaaccctgt caaggacatt 180tttaccgaaa tggctgcccc attaaagtct ccatctgccg aagcatgtgg atattcagat 240agggtcgcac aattgacaat tggtaactca accataacaa cccaagaggc agctaacatc 300attgtcggtt acggagaatg gccttcttat tgctctgatt cagacgccac tgctgtagac 360aaacctacaa gacctgacgt atcagtcaat aggttttaca ccttggacac taagttgtgg 420gaaaaatctt ctaagggatg gtactggaag tttcctgatg ttttaaccga aacaggagta 480ttcggacaga atgcccagtt ccattatttg tacagatcag gattttgcat ccacgtacaa 540tgcaatgcct caaaatttca ccagggtgca ttattggtag cagtcttgcc agaatacgtt 600atcggtactg tagcaggtgg aacaggtaca gaagatacac acccaccata caagcaaaca 660cagccaggtg ccgacggatt tgaattacaa catccatacg tcttagatgc tggtatccct 720atatctcagt tgaccgtctg tcctcaccaa tggattaact tgaggactaa caactgcgcc 780
acaataattg tcccttacat caacgcttta ccatttgatt ctgccttgaa tcactgtaac840ttcggattattggtcgtacc aatctcacct ttagactacg atcagggagc cacccctgtt900atcccaataa ccatcacatt agcaccaatg tgctcagaat ttgcaggatt aaggcaagcc960gttactcagg gttttcctac agaattgaaa cctggtacta accaattctt gaccaccgat1020gatggtgtctcagccccaat tttacctaat tttcacccta caccatgcat tcacattcca1080ggtgaggtca gaaacttatt ggaattgtgt caagtcgaga ctatcttgga ggttaacaat1140gtaccaacaa acgcaacctc tttgatggaa agattgaggt tcccagtctc tgctcaggca1200
ggaaagggag agttgtgtgc cgtttttaga gctgaccctg gaagaaacgg accatggcaa1260tctaccttgttgggacagtt gtgcggttac tacactcaat ggtcaggatc attggaagta1320actttcatgtttaccggatc tttcatggct accggaaaga tgttgatcgc atatacacca1380ccaggaggtccattaccaaa ggatagagct actgccatgt taggaactca cgtaatctgg1440gactttggtttacagtcatc agttaccttg gtaatccctt ggatctcaaa cacccattat1500agagcacacgctagagacgg tgtatttgac tattatacca caggtttggt ttctatatgg1560tatcaaactaactacgtcgt cccaatcggt gcccctaaca ctgcttacat tatcgcattg1620gcagccgcccagaaaaactt cacaatgaaa ttatgcaagg acgcctcaga tattttgcag1680actggaataatacaaggtga cagagtcgcc gatgtaatcg agtcttcaat cggagactca1740gtatcaagagcattaacaca cgcattgcca gcaccaacag gacaaaacac acaggtatca1800tctcatagattagatacagg aaaagtacct gcattacaag ctgctgaaat aggagcctca1860tctaatgcttctgatgaatc aatgatagag actagatgcg tcttaaattc tcactcaaca1920gctgaaacaactttggattc ttttttctca agggctggat tggttggaga gatcgatttg1980ccattggagggtactacaaa cccaaacgga tatgcaaact gggacatcga cattactggt2040tatgcacaaatgaggaggaa ggtcgaatta ttcacttata tgaggtttga tgcagagttc2100actttcgtcgcatgtactcc taccggtgaa gttgtcccac agttattaca gtacatgttt2160gttcctccaggtgctcctaa gccagattca agagaatctt tagcttggca aacagctaca2220aatccttctgtcttcgttaa gttatcagac cctcctgccc aggtctcagt ccctttcatg2280tcaccagcctcagcatacca gtggttctat gacggttacc caaccttcgg tgaacataag2340caagaaaaggacttggagta cggtgcttgt ccaaacaaca tgatgggtac attttcagta2400agaacagtcggaacttctaa atcaaaatac cctttggtca taaggatata catgaggatg2460aagcacgttagagcatggat acctaggcca atgagaaatc agaactactt gttcaaagcc2520aatcctaactatgccggaaa ttcaattaag cctactggtg cctctaggac agccatcact2580actttatga2589<210>2<211>1941<212>DNA〈213〉人工序列<400>2atgggaccttctttggactt tgctttatct ttgttgagaa ggaacatcag gcaggtccag60actgatcaag gacattttac aatgttgggt gtcagggata gattggcagt tttaccaaga120cactctcagcctggaaagac catttggatc gaacacaaat tggtcaacgt cttagacgcc180
gtcgaattgg ttgatgagca aggtgtaaac ttggagttga cattgataac cttggatact240aacgaaaaattcagggacat cacaaagttt atcccagaga atatttctac agcttcagat300gccactttggttattaacac cgaacatatg ccatcaatgt ttgtaccagt aggtgacgtc360gttcagtatggattcttgaa cttgtctgga aaacctacac acagaaccat gatgtataac420tttcctaccaaggctggaca gtgcggaggt gttgttactt ctgttggaaa agtcgtaggt480attcatataggaggtaatgg tagacagggt ttctgcgccg gtttgaagag atcatacttc540gcctcagaacagggtgagat ccagtgggta aagcctaaca aggagacagg aaggttgaat600atcaacggtcctacaagaac aaaattggaa ccatctgtct tccatgatat tttcgagggt660tcaaaagagcctgctgtctt acactcaaaa gatccaagat tagaggttga cttcgaacaa720gcattgttttcaaagtacgt tggtaacact ttacatgaac ctgatgagta cattaaggag780gccgctttacactatgctaa ccagttaaaa cagttggaga taaatacctc tcaaatgtct840atggaggaagcatgctatgg aactgaaaac ttagaggcaa ttgacttaca cacttcagct900ggttacccatactctgcttt gggtataaag aaaagagaca tattagatcc tactactagg960gacgtttcaaggatgaagtt ctatatggac aaatacggat tagacttacc ttactctact1020tacgtcaaagacgaattaag gtcaatcgat aaaatcaaaa agggaaaatc taggttaatc1080gaagcatcatctttgaacga ttcagtctat ttgaggatgg ctttcggtca tttgtacgag1140gcatttcatgccaacccagg tacaatcacc ggttcagccg ttggttgtaa cccagataca1200ttttggtctaaattacctat attgttgcct ggatcattat tcgcatttga ttactcagga1260tacgacgcttcattgtcacc tgtctggttc agggcattag agttggtttt gagggaaata1320ggatactcagaagaggctat atcattaatt gagggtataa atcatacaca tcacgtttat1380aggaacaagacctattgtgt attgggagga atgccttctg gatgttcagg aacctctatc1440ttcaattctatgatcaacaa catcataatt agggccttat tgattaagac attcaaaggt1500atcgacttggatgagttgaa catggtcgca tatggagacg acgtattagc atcttatcca1560tttccaatcgactgcttaga attagccaag actggtaagg aatatggttt gaccatgaca1620cctgccgacaaatctccatg ctttaatgag gtcaactggg gaaacgctac attcttaaaa1680agaggtttcttacctgacga gcaatttcct ttcttgatac accctaccat gcctatgaga1740gaaatccatgaatcaattag atggaccaag gacgcaagaa acacccagga tcatgttaga1800tcattgtgtttattagcttg gcataacggt aaacaagaat atgaaaagtt tgtatctact1860attaggtctgtcccagtcgg tagagcctta gcaataccta actacgagaa cttgaggaga1920aattggttggaattgttcta a1941<210>3<211>2589<212>DNA<213>EV71 病毒<400>3atgggttcgcaagtgtctac acagcgctcc ggttctcacg aaaactcaaa ctcagccact60gagggttctaccataaacta caccaccatt aattactaca aagactccta tgctgccaca120gcaggcaaacagagtctcaa gcaggatcca gacaagtttg caaatcctgt taaagacatc180ttcactgaaatggcagcgcc actgaagtcc ccatccgctg aggcatgtgg gtacagtgat240
cgagtggcgcaattaactat tggcaactcc accatcacca cgcaagaagc ggctaacatc300atagtcggttatggtgagtg gccttcctac tgctcagatt ctgacgctac agcagtggat360aaaccaacgcgcccggatgt ttcagtgaac aggttttaca cattggacac taaattgtgg420gagaaatcgtccaagggatg gtactggaag ttcccggatg tgttaactga aactggggtt480tttgggcaaaatgcacaatt ccactacctc taccgatcag ggttctgcat ccacgtgcag540tgcaatgccagtaaattcca ccaaggagca ctcctagtcg ctgtcctacc agagtatgtc600attgggacagtggcaggcgg tacagggacg gaagataccc acccccctta caagcagact660caacccggcgccgatggctt cgagttgcaa cacccgtacg tgcttgatgc tggcatccca720atatcacagttaacagtgtg cccacaccag tggattaatt tgaggaccaa caattgtgct780acaataatagtgccatacat taacgcactg ccttttgatt ctgccttgaa ccattgcaat840tttggcctgttagttgtgcc tattagccca ctagactacg accaaggagc gacgccagta900atccctataactatcacatt ggccccaatg tgttctgaat tcgcaggtct taggcaggca960gtcacgcaaggattccccac cgagctaaaa cctggcacaa atcaattttt aaccaccgat1020gatggcgtttcagcacctat tctaccaaac ttccacccca ccccgtgtat ccacatacct1080ggtgaagttaggaacttgct agagttatgc caggtggaga ccattctgga ggttaacaat1140gtgcccacgaatgccactag cttaatggag agactgcgct tcccggtctc agcacaagca1200gggaaaggtgagctgtgtgc ggtgtttaga gccgatcctg ggcgaaatgg accatggcaa1260tccaccttactgggtcagtt gtgcgggtac tacacccaat ggtcaggatc attggaagtc1320accttcatgtttactggatc cttcatggct accggcaaga tgctcatagc ctatacaccg1380ccaggaggtcctctgcccaa ggaccgggcg accgccatgt tgggcacgca cgtcatctgg1440gattttgggctgcaatcgtc tgtcaccctt gtaataccat ggatcagcaa cactcattat1500agagcacatgcccgagatgg agtgtttgac tactacacca cagggttagt cagtatatgg1560tatcagacaaattacgtggt tccaatcggt gcgcccaaca cagcctatat aatagcacta1620gcggcagcccaaaagaactt cactatgaaa ttgtgcaagg atgctagtga tatcctgcag1680acgggcatcatccagggaga tagggtggca gatgtaattg aaagttccat aggagatagc1740gtgagcagagccctcactca cgctctacca gcacccacag gccagaacac acaggtgagc1800agtcatcgactggatacagg caaggttcca gcactccaag ctgctgaaat tggagcatca1860tcaaatgctagtgacgagag catgattgag acacgctgtg ttcttaactc gcacagtaca1920gctgagaccactcttgatag tttcttcagc agggcgggat tagttggaga gatagatctc1980cctcttgagggcacaactaa cccaaatggt tatgccaact gggacataga tataacaggt2040tacgcgcaaatgcgtagaaa ggtagagcta ttcacctaca tgcgctttga tgcagagttc2100acttttgttgcgtgcacacc caccggggaa gttgtcccac aattgctcca atatatgttt2160gtgccacctggagcccctaa gccagattct agggaatccc ttgcatggca aaccgccact2220aacccctcagtttttgtcaa gctgtcagac cctccagcgc aggtttcagt gccattcatg2280tcacctgcgagtgcttacca atggttttat gacggatatc ccacattcgg agaacacaaa2340caggagaaagatcttgaata cggggcatgt cctaataaca tgatgggcac gttctcagtg2400cggactgtggggacctccaa gtccaagtac cctttagtgg ttaggattta catgagaatg2460aagcacgtcagggcgtggat acctcgcccg atgcgtaacc agaactacct attcaaagcc2520
aacccaaattatgctggcaa ctccattaag ccaactggtg ccagtcgcac agcgatcacc2580
actctttga2589<210>4<211>1941<212>DNA<213>EV71 病毒<400>4atgggcccga gccttgactt tgctctctcc ctactgagaa ggaacatcag gcaagtccaa60acagaccagg ggcatttcac catgttgggt gttagggatc gcttagcagt cctcccacgc120cactcacaacctggcaaaac tatttggatt gagcacaaac tcgtgaacgt ccttgatgca180gttgaactgg tggatgagca aggagtcaac ctggaattaa ccctcatcac tcttgacacc240aacgaaaagtttagggatat caccaaattc atcccagaaa atattagcac tgctagtgat300gccaccctag tgatcaacac ggagcacatg ccatcaatgt ttgtcccggt gggtgacgtt360gtgcagtatg gctttttgaa tctcagtggt aagcctaccc atcgcaccat gatgtacaac420tttcctacta aagcaggaca gtgtggagga gtggtgacat ctgttgggaa ggttgtcggt480attcacattg gtggcaatgg cagacaaggt ttttgcgcag gcctcaaaag gagttacttt540gctagtgaacaaggagagat ccagtgggtt aagcccaata aagaaactgg aagactcaac600atcaatggaccaacccgcac caagttagaa cctagtgtat tccatgacat cttcgaggga660agtaaagaaccagctgtctt gcacagtaaa gacccccgac ttgaggtaga ttttgaacag720gccctgttctctaagtatgt gggaaacaca ctacatgagc ctgacgagta cattaaagag780gcagctcttcattatgcaaa ccaattaaag caactagaaa ttaatacctc tcaaatgagc840atggaggaggcctgctacgg tactgagaat cttgaggcta ttgatcttca cactagtgca900ggttacccctatagtgccct ggggataaag aaaagagaca tcttagaccc taccaccagg960gacgtgagtagaatgaagtt ctacatggac aagtatggtc ttgatcttcc ttactccact1020tatgtcaaggacgagctgcg ctcgattgat aaaatcaaga aagggaagtc ccgcctgatc1080gaggccagtagtctaaatga ttcagtgtac ctcagaatgg ctttcggaca tttgtatgag1140gctttccacgcaaatcctgg gacgataact ggatcagccg tggggtgtaa ccctgacaca1200ttctggagcaagctgccaat tttgctccct ggttcactct ttgcctttga ctactcaggt1260tatgatgccagtcttagccc tgtctggttc agagcattag aattggttct tagggagata1320gggtatagtgaagaggcaat ctcactcatt gagggaatca tcatgtgtat1380cgtaataagacctattgtgt gcttggtggg atgccctcag gctgttcggg aacatccatt1440ttcaactcaatgatcaacaa cattattatc agagcactgc tcataaaaac atttaagggc1500attgatttggatgaactcaa catggtcgct tatggagacg atgtgctcgc tagctatccc1560ttcccaattgattgcttgga actagcaaag actggtaagg agtatggtct gaccatgact1620cctgctgataaatctccttg ctttaatgag gtcaattggg gtaatgcgac cttcctcaaa1680aggggctttttgcccgatga acagtttcca tttttgattc accctactat gccaatgagg1740gagatccatgagtccattcg atggaccaag gacgcacgaa acactcaaga tcatgtgcgg1800tccttgtgcctcctagcatg gcataatggt aagcaagaat atgagaagtt tgtgagcaca1860attaggtctgtcccagtagg aagagcgttg gctatcccaa attatgaaaa tcttagacgc1920
aattggctcgagttatttta a1941
<210>5<211>862<212>PRT<213>EV71 病毒<400>5Met Gly Ser Gln Val Ser Thr Gln Arg Ser Gly Ser His Glu Asn Ser151015Asn Ser Ala Thr Glu Gly Ser Thr lie Asn Tyr Thr Thr lie Asn Tyr202530Tyr Lys Asp Ser Tyr Ala Ala Thr Ala Gly Lys Gln Ser Leu Lys Gln354045Asp Pro Asp Lys Phe Ala Asn Pro Val Lys Asp lie Phe Thr Glu Met505560Ala Ala Pro Leu Lys Ser Pro Ser Ala Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp65707580Arg Val Ala Gln Leu Thr lie Gly Asn Ser Thr lie Thr Thr Gln Glu859095Ala Ala Asn lie lie Val Gly Tyr Gly Glu Trp Pro Ser Tyr Cys Ser100105110Asp Ser Asp Ala Thr Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser115120125Val Asn Arg Phe Tyr Thr Leu Asp Thr Lys Leu Trp Glu Lys Ser Ser130135140Lys Gly Trp Tyr Trp Lys Phe Pro Asp Val Leu Thr Glu Thr Gly Val145150155160Phe Gly Gln Asn Ala Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys165170175lie His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu180185190Val Ala Val Leu Pro Glu Tyr Val lie Gly Thr Val Ala Gly Gly Thr195200205Gly Thr Glu Asp Thr His Pro Pro Tyr Lys Gln Thr Gln Pro Gly Ala210215220Asp Gly Phe Glu Leu Gln His Pro Tyr Val Leu Asp Ala Gly lie Pro225230235240lie Ser Gln Leu Thr Val Cys Pro His Gln Trp lie Asn Leu Arg Thr245250255Asn Asn Cys Ala Thr lie lie Val Pro Tyr lie Asn Ala Leu Pro Phe260265270
Asp Ser Ala Leu Asn His Cys Asn Phe Gly Leu Leu Val Val Pro lie275280285Ser Pro Leu Asp Tyr Asp Gln Gly Ala Thr Pro Val lie Pro lie Thr290295300lie Thr Leu Ala Pro Met Cys Ser Glu Phe Ala Gly Leu Arg Gln Ala305310315320
Val Thr Gln Gly Phe Pro Thr Glu Leu Lys Pro Gly Thr Asn Gln Phe325330335Leu Thr Thr Asp Asp Gly Val Ser Ala Pro lie Leu Pro Asn Phe His340345350Pro Thr Pro Cys lie His lie Pro Gly Glu Val Arg Asn Leu Leu Glu355360365Leu Cys Gln Val Glu Thr lie Leu Glu Val Asn Asn Val Pro Thr Asn370375380Ala Thr Ser Leu Met Glu Arg Leu Arg Phe Pro Val Ser Ala Gln Ala385390395400Gly Lys Gly Glu Leu Cys Ala Val Phe Arg Ala Asp Pro Gly Arg Asn405410415Gly Pro Trp Gln Ser Thr Leu Leu Gly Gln Leu Cys Gly Tyr Tyr Thr420425430Gln Trp Ser Gly Ser Leu Glu Val Thr Phe Met Phe Thr Gly Ser Phe435440445Met Ala Thr Gly Lys Met Leu lie Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Gly Pro450455460Leu Pro Lys Asp Arg Ala Thr Ala Met Leu Gly Thr His Val lie Trp465470475480Asp Phe Gly Leu Gln Ser Ser Val Thr Leu Val lie Pro Trp lie Ser485490495Asn Thr His Tyr Arg Ala His Ala Arg Asp Gly Val Phe Asp Tyr Tyr500505510Thr Thr Gly Leu Val Ser lie Trp Tyr Gln Thr Asn Tyr Val Val Pro515520525lie Gly Ala Pro Asn Thr Ala Tyr lie lie Ala Leu Ala Ala Ala Gln530535540Lys Asn Phe Thr Met Lys Leu Cys Lys Asp Ala Ser Asp lie Leu Gln545550555560Thr Gly lie lie Gln Gly Asp Arg Val Ala Asp Val lie Glu Ser Ser565570575lie Gly Asp Ser Val Ser Arg Ala Leu Thr His Ala Leu Pro Ala Pro
580585590Thr Gly Gln Asn Thr Gln Val Ser Ser His Arg Leu Asp Thr Gly Lys595600605Val Pro Ala Leu Gln Ala Ala Glu lie Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser610615620Asp Glu Ser Met lie Glu Thr Arg Cys Val Leu Asn Ser His Ser Thr625630635640Ala Glu Thr Thr Leu Asp Ser Phe Phe Ser Arg Ala Gly Leu Val Gly645650655Glu lie Asp Leu Pro Leu Glu Gly Thr Thr Asn Pro Asn Gly Tyr Ala660665670Asn Trp Asp lie Asp lie Thr Gly Tyr Ala Gln Met Arg Arg Lys Val675680685Glu Leu Phe Thr Tyr Met Arg Phe Asp Ala Glu Phe Thr Phe Val Ala690695700Cys Thr Pro Thr Gly Glu Val Val Pro Gln Leu Leu Gln Tyr Met Phe705710715720Val Pro Pro Gly Ala Pro Lys Pro Asp Ser Arg Glu Ser Leu Ala Trp725730735Gln Thr Ala Thr Asn Pro Ser Val Phe Val Lys Leu Ser Asp Pro Pro740745750Ala Gln Val Ser Val Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp755760765Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Glu His Lys Gln Glu Lys Asp770775780Leu Glu Tyr Gly Ala Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Val785790795800Arg Thr Val Gly Thr Ser Lys Ser Lys Tyr Pro Leu Val Val Arg lie805810815Tyr Met Arg Met Lys His Val Arg Ala Trp lie Pro Arg Pro Met Arg820825830Asn Gln Asn Tyr Leu Phe Lys Ala Asn Pro Asn Tyr Ala Gly Asn Ser835840845lie Lys Pro Thr Gly Ala Ser Arg Thr Ala lie Thr Thr Leu850855860<210>6<211>646<212>PRT<213>EV71 病毒
<400>6
MetGlyProSerLeuAspPheAlaLeuSerLeuLeuArgArgAsnlie
151015
ArgGinValGinThrAspGinGlyHisPheThrMetLeuGlyValArg
202530
AspArgLeuAlaValLeuProArgHisSerGinProGlyLysThrlie
354045
TrplieGluHisLysLeuValAsnValLeuAspAlaValGluLeuVal
505560
AspGluGinGlyValAsnLeuGluLeuThrLeulieThrLeuAspThr
65707580
AsnGluLysPheArgAsplieThrLysPhelieProGluAsnlieSer
859095
ThrAlaSerAspAlaThrLeuVallieAsnThrGluHisMetProSer
100105110
MetPheValProValGlyAspValValGinTyrGlyPheLeuAsnLeu
115120125
SerGlyLysProThrHisArgThrMetMetTyrAsnPheProThrLys
130135140
AlaGlyGinCysGlyGlyValValThrSerValGlyLysValValGly
145150155160
lieHislieGlyGlyAsnGlyArgGinGlyPheCysAlaGlyLeuLys
165170175
ArgSerTyrPheAlaSerGluGinGlyGlulieGinTrpValLysPro
180185190
AsnLysGluThrGlyArgLeuAsnlieAsnGlyProThrArgThrLys
195200205
LeuGluProSerValPheHisAspliePheGluGlySerLysGluPro
210215220
AlaValLeuHisSerLysAspProArgLeuGluValAspPheGluGin
225230235240
AlaLeuPheSerLysTyrValGlyAsnThrLeuHisGluProAspGlu
245250255
TyrlieLysGluAlaAlaLeuHisTyrAlaAsnGinLeuLysGinLeu
260265270
GlulieAsnThrSerGinMetSerMetGluGluAlaCysTyrGlyThr
275280285
GluAsnLeuGluAlalieAspLeuHisThrSerAlaGlyTyrProTyr
290295300
SerAlaLeuGlylieLysLysArgAsplieLeuAspProThrThrArg
305310315320
AspValSerArgMetLysPheTyrMetAspLysTyrGlyLeuAspLeu
325330335
ProTyrSerThrTyrValLysAspGluLeuArgSerlieAspLyslie
340345350
LysLysGlyLysSerArgLeulieGluAlaSerSerLeuAsnAspSer
355360365
ValTyrLeuArgMetAlaPheGlyHisLeuTyrGluAlaPheHisAla
370375380
AsnProGlyThrlieThrGlySerAlaValGlyCysAsnProAspThr
385390395400
PheTrpSerLysLeuProlieLeuLeuProGlySerLeuPheAlaPhe
405410415
AspTyrSerGlyTyrAspAlaSerLeuSerProValTrpPheArgAla
420425430
LeuGluLeuValLeuArgGlulieGlyTyrSerGluGluAlalieSer
435440445
LeulieGluGlylieAsnHisThrHisHisValTyrArgAsnLysThr
450455460
TyrCysValLeuGlyGlyMetProSerGlyCysSerGlyThrSerlie
465470475480
PheAsnSerMetlieAsnAsnlielielieArgAlaLeuLeulieLys
485490495
ThrPheLysGlylieAspLeuAspGluLeuAsnMetValAlaTyrGly
500505510
AspAspValLeuAlaSerTyrProPheProlieAspCysLeuGluLeu
515520525
AlaLysThrGlyLysGluTyrGlyLeuThrMetThrProAlaAspLys
530535540
SerProCysPheAsnGluValAsnTrpGlyAsnAlaThrPheLeuLys
545550555560
ArgGlyPheLeuProAspGluGinPheProPheLeulieHisProThr
565570575
MetProMetArgGlulieHisGluSerlieArgTrpThrLysAspAla
580585590
ArgAsnThrGinAspHisValArgSerLeuCysLeuLeuAlaTrpHis
595600605
AsnGlyLysGinGluTyrGluLys 18PheValSerThrlieArgSerVal
Pro
625
Asn
610 615620
Val Gly Arg Ala Leu Alalie Pro Asn Tyr Glu Asn Leu Arg Arg
630635 640 Trp Leu Glu Leu Phe 64權利要求
一種腸道病毒71型病毒樣顆粒制備方法，該方法包括(1)優化腸道病毒71型病毒樣顆粒P1基因及3CD基因序列；(2)將優化的腸道病毒71型病毒樣顆粒P1基因及3CD基因序列克隆到質粒中；(3)用得到的質粒轉化酵母細胞；(4)從裂解的宿主細胞中分離重組腸道病毒71型病毒樣顆粒。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述酵母細胞選自釀酒酵母、多形漢遜酵母、巴 斯德畢赤酵母、胞壁克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述酵母細胞為釀酒酵母。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述的優化是指在不改變EV71P1及3CD氨基酸 序列的前提下，將P1及3CD基因序列的密碼子替換為酵母細胞偏好的密碼子。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述的密碼子優化的腸道病毒71型病毒樣顆粒 P1基因序列和3⑶基因序列分別為SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的序列。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述的質粒為pESC-URA。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述的質粒為PESC-P1Y-3CDY。
8.一種如SEQ ID NO 1所示的腸道病毒71型病毒樣顆粒P1基因序列。
9.一種如SEQ ID NO 2所示的3⑶基因序列。
10.一種含有如權利要求8或9所述的基因序列的載體。
11.根據權利要求10所述的載體，其中所述的載體為pESC-URA。
12.—種含有如權利要求8或9所述的基因序列的酵母細胞。
13.根據權利要求12所述的酵母細胞，其中所述的酵母細胞選自釀酒酵母、多形漢遜 酵母、巴斯德畢赤酵母、胞壁克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。
全文摘要
本發明涉及人腸道病毒EV71型病毒樣顆粒的制備方法。本發明通過使用密碼子優化后的編碼腸道病毒71型P1及3CD蛋白質的合成多核苷酸制備腸道病毒71型病毒顆粒。本發明的方法提高了EV71型病毒樣顆粒在異源宿主細胞中的生產效率并具有與天然病毒顆粒相似的空間結構。
文檔編號C12N15/41GK101831410SQ20091007937
公開日2010年9月15日 申請日期2009年3月9日 優先權日2009年3月9日
發明者周玉柏, 曾毅, 李澤琳, 盛望, 蔣維 申請人:北京工業大學