通過雙酶水解昆蟲干粉制備蛋白胨的方法

專利名稱：通過雙酶水解昆蟲干粉制備蛋白胨的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種通過雙酶水解昆蟲干粉制備蛋白胨的方法。
背景技術：
蛋白胨是一種外觀呈淡黃色的粉劑，質地細膩，易吸濕，具有特殊的肉香氣息，富 含微生物生長發酵及動物生長發育所需要的多肽、寡肽以及各種氨基酸成分。作為微生物 培養基的主要原料，蛋白胨在醫藥工業、生化制品、抗生素、發酵工業以及微生物學研究等 領域中應用廣泛，需求量大。因含有豐富的氨基酸，尤其是硫氨基酸較高，且含有細菌生長 需要的維生素和其它生長因子，蛋白胨在實驗室用在培養基中進行細菌培養，其在培養基 中的主要作用是為微生物生長提供氮源，一般用量為0. 5% 5%。在飼料行業中，將蛋白 胨用于飼料中可提高飼料的品質，有效改善飼料蛋白不足，降低飼料生產成本，提高飼料的 利用效率。一般用于蛋白胨生產的蛋白包括動物蛋白(酪蛋白、肉類)和植物蛋白(豆類) 兩種，不同蛋白來源的蛋白胨可以滿足不同的生物體所需要的特定氨基酸和多肽。目前市 場上銷售的蛋白胨有鮮魚蛋白胨、牛骨蛋白胨、牛肉蛋白胨、大豆蛋白胨等，尚未見有昆蟲 源的蛋白胨。目前，我國已出現昆蟲養殖以及昆蟲產品開發的熱潮，農戶養殖或者工廠化昆蟲 養殖規模空前壯大，其中以蠅蛆和黃粉蟲的養殖熱為代表。家蠅(Musca domestica)，屬雙翅目昆蟲，繁殖能力強，發育歷期短，對環境適應 強，具有較強的轉化能力。目前國內家蠅的規模化生產技術已見成熟與完善，但蠅蛆產品開 發層次較低，主要是將蠅蛆直接作為動物飼料加以利用，產品附加值較低。經試驗粗略計 算，干蛆粗蛋白含量約60%，據研究蠅蛆含有豐富的營養成分，蠅蛆原物質和粗制的蠅蛆干 粉粗蛋白含量分別高達15%和60%以上，且氨基酸含量全面，必需氨基酸配比合理。蠅蛆 養殖具有繁殖快，生產周期短，生產轉化效率高，成本低，飼料來源廣泛等顯著優點，尤其是 可以利用各種工農業有機廢棄物，可以緩解環境污染，蠅蛆養殖的廢棄物還可開發成促進 作物生長的復合肥及抗蟲抗病能力的殺蟲劑或抗病制劑。黃粉蟲(Tenebrio molitor)，又名黃粉甲，因營養豐富又稱面包蟲，原產于美洲。 其幼蟲、蛹和成蟲都含有豐富的蛋白質和多種氨基酸，具有高蛋白、低脂肪的特點，富含磷、 鉀、鐵、鈉、鋁等多種微量元素和維生素。黃粉蟲能利用和轉化以農作物秸稈為主的農業有 機廢棄物，成為人類可利用的高蛋白、低脂肪、多氨基酸的營養來源，同時還解決了大量秸 稈資源浪費與污染環境的問題。黃粉蟲幼蟲含蛋白高達50% 60%，氨基酸種類齊全，氨 基酸比例均衡。黃粉蟲食性雜，飼料來源廣、廉價，以麥麩為主，兼食各種雜糧、油料和糧油 加工的副產品，各類蔬菜和果皮。抗病力強、生長周期短，易于養殖，生產無污染，生產成本 低，投資小，隨時隨地可養殖，國內黃粉蟲養殖戶數量眾多，黃粉蟲產量高。此外，黃粉蟲糞 便經化驗含氮3. 37%、磷1. 04%、鉀1. 04%，同時含有豐富的鋅、錳、硼、鐵、鎂、鈣、銅七種 微量元素。施用以蟲糞沙為主要原料的高效生物有機肥不僅能增肥土壤，增加農作物產量，提高農產品品質，還能降低農業生產成本，改善土壤結構，改善農業生態環境，可促進種植 業的可持續發展。蛋白胨的制備常采用酸水解、堿水解和酶水解等方法。采用酸水解動植物蛋白時， 鹽酸在高溫下與油脂分解后的產物反應會生成有害甚至有毒的化學物質。水解后的產物一 般顏色較深，需要進行脫色處理。工業上一般采用成本較低、濃度約30%的氫氧化鈉溶液作 為中和劑，中和產生大量的鹽分，脫鹽工作大大增加了生產成本。而且中和作用使水解液的 溫度、PH值升高，促進了類黑素的生成以及蛋氨酸分解為二甲基硫醚的反應，使中和時水解 液色澤變深，水解液的異味增強，增加脫臭難度。油脂的分解產物脂肪酸在中和時同氫氧化 鈉反應，生成脂肪酸鈉，造成產品熒光效應，降低品質。堿水解同樣存在脫鹽、脫色以及產品 熒光效應等問題。堿水解過程中多數氨基酸會遭到不同程度的破壞，酸水解中色氨酸全部 被酸破壞，絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸等也有一小部分被分解，而酶水解不破壞氨基酸，因其 操作簡便、成品質量穩定、品質優良而逐漸取代了酸堿等化學法。但僅使用一種酶進行水解 動植物蛋白往往水解不夠徹底，需幾種酶協同作用才能使蛋白質水解較為完全，使用單一 酶水解動植物蛋白生產蛋白胨存在水解收率較低的局限。

發明內容
在本發明中，所使用的術語“酶底比”，是指單位質量蠅蛆干粉[g]的酶用量[U]。本發明的目的在于，提供一種通過雙酶水解昆蟲干粉制備蛋白胨的方法。本發明的另一個目的在于，提供上述方法所制備的昆蟲干粉蛋白胨及其用途。本發明的又一個目的在于，提供一種昆蟲干粉的新用途。本發明的目的是采用以下技術方案來實現的。一方面，本發明提供一種通過雙酶 水解昆蟲干粉制備蛋白胨的方法，該方法的酶解條件如下溫度為10 85°C、時間為2 10小時、酶底比為100 1000u/g和PH 1. 0 11. 0 ；優選地，所述酶解條件如下溫度為 30 55°C、時間為4 8小時和酶底比為300 800u/g ；更優選地，所述酶選自木瓜蛋白 酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶中的任意兩種。優選地，所述方法還包括升溫滅酶的步驟；更優選地，所述升溫滅酶的條件如下 溫度為80 100°C、時間為15 45分鐘和pH 5. 5 7. 8。優選地，所述方法還包括過濾除雜、干燥及滅菌的步驟；更優選地，所述干燥的條 件如下溫度為80 100°C、時間為2 4小時。優選地，所述方法還包括在酶解前的對昆蟲干粉進行脫脂的步驟；更優選地，所述 脫脂包括在120 135°C下，用石油醚浸提25 45分鐘，淋洗30 60分鐘，干燥回收， 即得脫脂粉。優選地，所述昆蟲粉選自蠅蛆干粉和黃粉蟲干粉。在一個優選的實施方案中，所述蠅蛆干粉的酶解條件如下酶選自木瓜蛋白酶、堿 性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶中的任意兩種，溫度為40 55°C，時間為4 8小時，酶 底比為400 800u/g和pH 8. 0 9. 0 ；優選地，所述蠅蛆干粉的酶解條件為采用木瓜蛋白 酶和堿性蛋白酶，溫度為55°C、時間為4小時、酶底比為400u/g和pH 8. 0。在一個優選的實施方案中，所述黃粉蟲干粉的酶解條件如下酶選自木瓜蛋白酶、 胃蛋白酶、酸性蛋白酶和胰蛋白酶中的任意兩種，溫度為30 45°C，時間為4 8小時，酶
4底比為300 700u/g和pH 1. 5 2. 5 ；優選地，所述黃粉蟲干粉的酶解條件為采用胃蛋白 酶和酸性蛋白酶，溫度為40°C，時間為6小時，酶底比為300u/g和pH 2. 0。另一方面，本發明提供了上述方法制備的昆蟲干粉蛋白胨。本發明還提供了上述 昆蟲干粉蛋白胨在制備微生物培養基或飼料中的用途。又一方面，本發明還提供了昆蟲干粉在制備蛋白胨中的用途。優選地，所述昆蟲干粉包括不同來源的蛋白含量高、氨基酸全面、配比合理，同時 富含多種微量元素和維生素的昆蟲干粉，優選選自蠅蛆干粉和黃粉蟲干粉。綜上所述，本發明的方法是采用以下技術方案來實施的。先將昆蟲干粉脫脂，使用 索氏浸提系統，在120 135°C條件下，用石油醚浸提25 45分鐘，淋洗30 60分鐘，預 干燥10 25分鐘，干燥回收25 45分鐘。脫脂結束后，樣品置通風櫥內充分干燥，即得脫 脂粉。經實驗證實，如不脫脂，會發生嚴重的皂化反應等不良反應，嚴重降低產品品質。隨 后，分別對脫脂粉進行不同酶、底物濃度及酶底比的單因素實驗。在單因素實驗的基礎上， 選取兩種反應條件較為接近、蛋白胨收率較高的酶，對溫度、PH值、酶底比和時間這四個主 要影響因素采用正交試驗，進行優化酶解工藝條件，以期得到較高的收率，考察指標為昆蟲 干粉水解后的收率。昆蟲干粉中按照一定的酶底比加入一定量兩種蛋白酶，然后加入一定 體積的蒸餾水攪勻，調節料液PH值，在一定溫度下保溫水解一段時間。酶解實驗結束后，調 節PH并升溫至80 100°C，保溫15 45分鐘，過濾除雜，噴霧干燥。然后置于80 100°C 烘2 4小時，密封，干熱或濕熱滅菌，得到昆蟲蛋白胨粉。根據正交試驗結果，確定優化后 的酶解條件，并進行酶解實驗驗證。由此可見，本發明具有以下優點和效果1)原料來源廣泛，生產成本低。蠅蛆養殖與黃粉蟲養殖是當前的熱點，養殖技術已 經非常成熟，農戶養殖或者工廠化養殖頗具規模。因此，采用蠅蛆干粉、黃粉蟲干粉等生產 蛋白胨，不僅原料來源廣泛，生產成本低，而且具有一定的社會生態效益。其中，養殖蠅蛆進 行蛋白胨開發，可以配合昆蟲病毒生物殺蟲劑產業化工作同時進行，解決病毒生產中廢飼 料的再利用問題。目前，已有采用人工飼料進行大批量生產棉鈴蟲、甜菜夜蛾、斜紋夜蛾、小 菜蛾等宿主昆蟲，用于擴增生產相應的病毒生物殺蟲劑，會產生大量的廢棄昆蟲人工飼料 需要處理，這些廢棄人工飼料主要由農副產品組成，營養豐富，組分中不含對健康有害的物 質，直接丟棄則導致資源浪費和環境污染。利用蠅蛆生活力強、轉化效率高的優勢，使用廢 飼料養殖蠅蛆，將獲得的蠅蛆進行深加工，可以得到高附加值的產品，經蠅蛆利用過的廢飼 料沒有異味，質地疏松，是適合養花、種菜的優質有機肥，還可加工成復合肥，從而形成高效 率的資源充分利用的產業鏈。2)本發明在單因素的基礎上對酶解工藝過程進行正交試驗，優化酶解工藝條件， 為提高產品收率、降低生產成本提供可靠的理論依據。由于采用優化后的工藝條件進行雙 酶水解昆蟲干粉，因此產品質量高，收率高。3)本發明酶解工藝過程所需設備簡單，易于操作。而且采用昆蟲干粉生產蛋白胨， 原料易得，來源廣泛，成本低。4)本發明生產的蛋白胨可用作微生物培養基，提供氮源，也可添加至飼料中，改善 飼料品質。因此，本發明選用來源廣泛、生產成本低廉的蠅蛆干粉和黃粉蟲干粉作為原料，在單一酶的單因素實驗基礎上，選取兩種酶進行正交實驗，對酶解昆蟲干粉生產蛋白胨的工 藝流程進行優化，研究出新的蛋白胨生產工藝，適用于發酵、生物制藥工業等所用蛋白胨的 生產。本發明降低了生產成本，提高了產品品質和產品收率，為蛋白胨的生產提供理論參考。


以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中圖1為本發明以蠅蛆干粉為原料酶解制備蛋白胨正交試驗的綜合方差分析。圖2為本發明以黃粉蟲干粉為原料酶解制備蛋白胨正交試驗的綜合方差分析。
具體實施例方式實施例1 以蠅蛆干粉為原料酶解制備蛋白胨的方法首先將一定細度的蠅蛆干粉脫脂，即使用索氏浸提系統，在125°C下用石油醚浸提 30分鐘，淋洗40分鐘，預干燥10分鐘，干燥30分鐘，然后置通風櫥內充分干燥，得脫脂蠅蛆 粉。稱取脫脂蠅蛆粉2g，加入水后，在水溫45°C下，分別加入不同種類的酶進行反應，用4M HCl或3M NaOH溶液調節pH，在一定溫度下保溫反應4小時，每處理3次重復，分別按照不 同的底物濃度(即蠅蛆干粉[g]與水[ml]的配比分別為1 10，1 20,1 30，1 40 和1 50)、酶底比(即單位質量蠅蛆干粉[g]的酶用量[u]分別為200u/g,400u/g,600u/ g，800u/g和1000u/g)、不同酶種類(木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性 蛋白酶和胰蛋白酶)進行單因素實驗。考慮到生產成本，結果表明，較為合適的底物濃度為 蠅蛆干粉與水的比例為1 20時，較為合適的酶為木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和堿 性蛋白酶，較為合適的酶底比為200 800u/g。本實施例中選取木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶 進行正交試驗，選取二酶較為適宜的條件進行正交試驗，優化反應條件。正交實驗測定各因 素及水平見表1。采用SPSS軟件將測定因素及水平進行組合，然后依據各組合條件進行試驗，酶解 結束后，調節料液PH 7. 5，然后升溫至10(TC，保溫30分鐘，冷卻后過濾，噴霧干燥，滅菌得 蠅蛆蛋白胨粉。對正交試驗結果進行統計分析，結果見圖1，其中同一曲線上相同字母表示 差異不顯著，不同字母表示差異顯著(P < 0. 05)。表1蠅蛆蛋白胨制備的正交實驗測定因素與水平
權利要求
一種通過雙酶水解昆蟲干粉制備蛋白胨的方法，其特征在于，該方法的酶解條件如下溫度為10～85℃、時間為2～10小時、酶底比為100～1000u/g和pH 1.0～11.0；優選地，所述酶選自木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶中的任意兩種。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括升溫滅酶的步驟；優選 地，所述升溫滅酶的條件如下溫度為80 100°C、時間為15 45分鐘和pH 5. 5 7. 8。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法還包括過濾除雜、干燥及滅 菌的步驟；優選地，所述干燥的條件如下溫度為80 100°C和時間為2 4小時。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在酶解前的 對昆蟲干粉進行脫脂的步驟；優選地，所述脫脂包括在120 135°C下，用石油醚浸提25 45分鐘，淋洗30 60分鐘，干燥回收，即得脫脂粉。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其特征在于，所述昆蟲粉選自蠅蛆干粉和 黃粉蟲干粉。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述蠅蛆干粉的酶解條件如下酶選自 木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶中的任意兩種，溫度為45 55°C，時間為 4 8小時，酶底比為400 800u/g和pH8. 0 9. 0 ；優選地，所述蠅蛆干粉的酶解條件為 采用木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶，溫度為55°C、時間為4小時、酶底比為400u/g和pH 8. 0。
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述黃粉蟲干粉的酶解條件如下酶選 自木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶和胰蛋白酶中的任意兩種，溫度為30 45°C，時間為 4 8小時，酶底比為300 700u/g和pHl. 5 2. 5 ；優選地，所述黃粉蟲干粉的酶解條件 為采用胃蛋白酶和酸性蛋白酶，溫度為40°C，時間為6小時，酶底比為300u/g和pH 2. 0。
8.權利要求1至5中任一項所述方法制備的昆蟲干粉蛋白胨。
9.權利要求8所述的昆蟲干粉蛋白胨在制備微生物培養基或飼料中的用途。
10.昆蟲干粉在制備蛋白胨中的用途，優選地，所述昆蟲干粉選自蠅蛆干粉和黃粉蟲干粉。
全文摘要
本發明提供一種通過雙酶水解昆蟲干粉制備蛋白胨的方法，適用于發酵、生物制藥工業等所用蛋白胨的生產。本發明所提供方法的酶解條件如下溫度為10～85℃、時間為2～10小時、酶底比為100～1000u/g和pH1.0～11.0。本發明的方法將昆蟲干粉脫脂后，按照不同的底物濃度、酶底比、不同種類的酶首先進行單因素實驗，在單因素實驗結果的基礎上，選取兩種酶進行正交試驗，優化酶解工藝條件，得到高品質的昆蟲蛋白胨粉。本發明所提供的方法工藝設備簡單，操作簡便，產品收率高，產品品質好，生產成本低。
文檔編號C12P21/06GK101988081SQ20091009037
公開日2011年3月23日 申請日期2009年8月6日 優先權日2009年8月6日
發明者伍一軍, 張寰, 張愛君, 李瑄, 杜賀, 楊青, 王紅托, 秦啟聯, 苗麟 申請人:中國科學院動物研究所