專利名稱：：用于轉基因單子葉植物安全性控制的基因刪除系統的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種解決轉基因單子葉植物生物安全性的高效基因刪除系統，具體地說，涉及基于來源于酵母的FLP/i^r和細菌噬菌體的Cre//0xP位點特異性重組酶(Sitespecificrecombinase)系統。本發明還涉及含有該基因刪除系統的植物表達載體。
背景技術：
：植物轉基因技術目前已經成為世界上增加作物產量、改善作物品質的一個重要手段。盡管轉基因植物己經給人類帶來了巨大的利益，，但由于該技術開發和利用的時間很短，人類對其生物安全性認識很有限，在科學界和社會公眾中，很多人對植物轉基因技術的安全性心存顧慮，認為目前人類還不能對轉基因技術潛在危險性做出正確的評價。特別是2001年David和Ignacio在《Nature》上發表論文指出，轉基因玉米可以通過花粉將外源基因轉移到其近緣物種，在全世界范圍內掀起了一場關于轉基因植物是否安全的爭論。為了消除公眾對轉基因植物生物安全性的擔憂，近年來，一些生物技術如共轉化技術(Xoman;7:"a/，尸/"Wj;7卯6，70:M5-〃《)、位點特異性重組酶技術(丄yz"汰，U.da/，P/a"/Ce〃iep.2M3，"925—932)等已經先后應用于轉基因植物生物安全性的控制中。但迄今報道的這些技術存在以下的缺點-①目前這些技術主要關心的是將轉基因植物中的報告基因(如GUS基因或GFP基因)或抗性標記基因(如NPTII基因或^r基因等)去除，而對其它改良作物品質、增加作物產量以及提高作物抗性等外源目的基因，在完成其功能后，并沒有從轉基因植物中刪除，這些外源基因依然可能逃逸到自然界中，對生態環境和人類健康構成威脅，公眾對轉基因植物及其食品安全性的擔憂也仍將存在。②上述技術刪除轉基因植物中外源基因的效率都比較低，只能在一定程度上刪除轉基因植物中的外源基因，無法滿足轉基因作物田間大面積釋放后高效刪除轉基因的要求，不能徹底解決轉基因植物中的生物安全性問題。③另外，這些技術往往需要通過雜交途徑或二次轉化等方法，才能實現對轉基因植物中外源基因的刪除，獲得無外源基因的植株，該過程周期太長，可操作性差。因此，現有的基因刪除技術均不能滿足轉基因植物安全性控制的需要。比較而言，在這些技術中，來源于微生物的位點特異性重組酶系統在植物中的應用最為廣泛，其刪除效率也相對較高。目前，已經在植物上得到較多應用的位點特異性重組酶系統包括1)來源于細菌噬菌體Pl(BaC^7'C;p/^gePl)的Cre〃ox尸系統(Ofe〃，《/da/'Mo/."卯，"3,3(^-37&)。2)來自于酵母(&cc/wram少cwce"v/w'ae)2p質粒的FLP/i^r系統(Z/cy"AA/:^a/.Mo/.7卯《242:653-657.)。所有重組酶系統完成重組過程所需元件僅僅包括重組酶(Recombinase)和該重組酶能特異識別的位點(Recognitionsite),其工作原理也十分簡單，過程為重組酶識別并結合轉基因植物基因組中對應的特異性識別位點，形成所謂的Holliday結構，來自于重組酶C-端酪氨酸殘基的羥基基團產生親核攻擊，破壞識別位點里不對稱8bp序列兩端的磷酸鍵，然后，參與重組反應的重組酶蛋白4個單體發生脂基轉移反應，基因組DNA分別解鏈，再重新連接，完成重組過程(f^0^"ov，Ze^/，M/c/e/cJc^si仏7999，27:W0"何A)。當一對同向識別位點位于目的基因的兩端時，其相應的重組酶將刪除識別位點之間的所有外源基因和一個識別位點，最后在基因組中只留下一個識別位點，這就是基因刪除(Geneexcision)。利用重組酶Cre〃oxP系統對抗生素標記基因進行刪除主要有幾種方式，最早主要采用雜交的方式是，將重組酶基因導入到含識別位點和抗生素標記基因的轉基因植物中去，從而刪除標記基因。1991年，Dale等報道將標記基因iV尸ni置于兩個/ox尸位點之間，通過表達Cre重組酶基因，可將標記基因A^71I從轉基因植物基因組中切除。后來Russdl等(1992)和Srivastava等(1999)都有成功的報道。這個方法需要在受體基因組內引入重組酶基因，剔除標記基因后還必須經過雜交和有性世代的遺傳分離，去除重組酶基因，因此操作復雜，實驗需要的時間很長。作為改進，重組酶基因Cre、識別位點/ox戶以及標記基因放在同一表達載體上，Cre基因的表達受組織特異性啟動子或化學誘導型啟動子的控制，標記基因就可以在轉基因植物生長的任何組織或任何階段被刪除。Zuo等(2001)采用化學誘導啟動子獲得了一個Cre〃m:戶自動刪除系統，同樣，Hof傳(2001)以及Zhang等(2003)利用熱激蛋白啟動子啟動Cre基因的表達，分別在擬南芥和玉米愈傷組織中也自動刪除了標記基因。與雜交系統相比，自動刪除系統有以下幾個明顯的優點(1)Cre基因的表達在轉基因植物的To代就可以表達，簡化了操作程序，節約了時間。(2)自動刪除系統中Cre基因只在需要的時候才表達，且表達的時間很短，避免了Cre基因長時間大量表達對植物造成的傷害。(3)這是目前唯一能在無性繁殖植物品種中刪除標記基因的刪除系統。Mlynarova和Nap在2003年報道了一個將Cre〃ox尸自動刪除和二次轉化相結合的新的刪除系統，在這個系統中，Cre基因的表達量受到了限帝lJ。他們轉化煙草后發現，少量的Cre基因表達足以滿足刪除標記基因的需要，而且相對于組成型表達，其刪除效率更高。FLP/7^r系統首先被Lyznik等在1993年應用到玉米和水稻的瞬時表達系統中，在他們的實驗里，其中一個工程載體包含有"/^4基因，但它的啟動子和編碼序列之間有一段1.31kb的DNA片段將其隔開，使該基因不表達，在這個片段兩端分別有一個/^r識別位點，當FLP重組酶作用于兩個同向識別位點后，將把這個片段切除掉，GUS報告基因就可以表達。另一個工程載體則只包含有啟動子或W^々w/"w啟動子和FLP重組酶。當FLP基因在啟動子啟動下，兩個載體通過共轉化方式倒入到原生質體中，GUS蛋白的活性恢復了陽性對照的10%。當FLP基因如果被C/6/^^/M啟動子作用時，GUS基因的活性可以達到60%~90%。另外，當識別位點Fir中的重復序列為3個(48bp)時，GUS基因的表達可以達到25e/。50。/c)，但如果FRT中的重復序列僅為兩個(37bp)時，GUS基因的活性反而更高(60%~90%)。1994年，Lloyed和Davies將FLP/FRT位點特異性重組酶系統穩定轉化到煙草中去。表達FLP重組酶的植物與帶有Fir識別位點的植株雜交，在^代中，重組酶的刪除效率為70%。在玉米細胞的穩定遺傳轉化中，Lyznik等(1996)發現通過二次轉化將FLP基因和Fir識別位點共同轉入植物，得到的愈傷組織中，4個中只有1個有GUS基因的表達，說明這種轉化方法中重組的效率更低。Luo等(2000)采用雜交的方法，將FLP重組酶基因導入到擬南芥中，獲得了很高的刪除效率。目前，已有的位點特異性重組酶系統存在著以下明顯的缺點一是在這些系統中，重組酶基因一般都通過再轉化或雜交的方法導入植物，這就帶來了問題，當重組酶基因完成其功能，將需要刪除的片段去除后，重組酶基因本身也是多余的，需要將其從轉基因植物中刪除掉，當然，通過后代遺傳分離的方式，得到沒有重組酶基因的植株也是可能的，但這樣就很費時間，而且對于轉基因植物材料是以無性生殖的植物品種那就很難了。對于Cre〃orP系統，為了克服這個缺點，Gleave等通過Cre基因在煙草中瞬時的表達，已經得到了無Cre基因的轉基因植株。在這篇報道中，作者在沒有抗生素篩選的情況下，從773株再生苗中，得到了兩株含有/ox戶位點，但沒有Cre基因的轉基因植株。雖然這個方法確實可以在沒有雜交和后代分離的情況下，得到了無重組酶基因的轉基因植株，但由于這種方法效率低，而且需要做二次轉化，大大限制了該方法在實際生產中的應用。另一個潛在的問題是，我們目前還不十分清楚重組酶基因在轉基因植物的大量表達，到底對植株有多大不利的影響。比如目前可以肯定的是Cre基因在馬鈴薯和矮牽牛中表達能夠顯著地抑制其生長，最近在煙草中也有類似的報道(Cop;wo/"，"a/，戶/朋fMo/.說o/.2003,5A'2d5—279.)。f旦目前我們還不知道，這種影響是因為Cre蛋白大量存在所產生的毒害作用引起的呢？還是由于其在基因水平上所造成的影響。如果是前者，隨著Cre基因的不表達或弱表達，這種毒害就會隨之消失；但如果是后者，這種影響可能就更長久一些。更為關鍵的是，現有的位點特異性重組酶系統，主要考慮的是如何刪除將轉基因植物中的標記基因、報告基因，對于目的基因和重組酶基因本身，并沒有被刪除，而且這些重組酶系統刪除外源基因的效率均不夠高，很難滿足在田間大規模釋放的轉基因作物中，完全刪除外源基因，這大大限制了位點特異性重組酶系統在實際生產上的應用。針對位點特異性重組酶系統在轉基因植物中的這些問題，一個新的基因刪除系統"Gene-deletor"被構建(羅克明，2004,博士論文；丄wo"a/.,P/朋f說'otec/2./，07，5:263-374)。與己報道的基因刪除系統相比，"Gene-deletor"具有以下優點①高效；植物轉基因試驗結果表明，采用傳統的FLP/FRT系統，平均刪除效率僅為32%，所有分析的轉基因植株中未發現100%的刪除效果。而在含有"Gene-deletor"系統的轉基因煙草中，外源基因的平均刪除效率提高到了79%,更重要的是，部分轉基因植株中的刪除效率達到了100%。②準確；我們選擇適合的組織特異性啟動子控制重組酶基因(Cre或FLP)的表達，使外源目的基因能在轉基因植物的營養體(根、莖、葉)中正常表達，實現其生物功能(如抗蟲、抗除草劑等)。但在我們不希望外源基因存留的器官中(如花粉或種子)，外源基因則被自動刪除掉。③徹底；"Gene-deletor"系統能將包括重組酶自身在內的所有外源基因從植物的花粉和種子中完全刪除。這就可能實現在轉基因植物中獲得非轉基因花粉和種子的愿望，從而大大降低了外源基因存留在食品中的潛在風險，消除人們對轉基因植物生物安全性的擔憂。但在前面報道中，"Gene-deletor"系統的重組酶基因由花粉特異性啟動子BGP(XM，Dav/as，>S./!，Xw""，及K，(9'5n'ew，J.S57w沐McfeiT"ox，兄及//ap/o/(iJraZWo^^to6acco.Afo/.GW2ef.7993，259,5S-d5)控制，該啟動子來源于雙子葉植物油菜，其表達僅限于油菜的成熟花粉中，在單子葉植物中不能表達，故前面的"Gene-deletor"系統只能用于雙子葉植物中，在單子葉植物中刪除效率如何未見報道。
發明內容鑒于以上情況，為了將基因刪除系統應用于單子葉植物中，解決其生物安全性問題，實現通過單子葉轉基因植物獲得非轉基因產品的目的，本發明以"Gene-deletor"技術為基礎，希望構建新的高效基因刪除系統"Mono-gene-ddetor"，以滿足刪除單子葉轉基因植物花粉中外源基因的需要。本發明的一個目的在于提供一種用于轉基因單子葉植物安全性控制的高效基因刪除系統，其含有融合的位點特異性重組酶系統Cre〃似P和FLP/Fir，該系統能夠在轉基因單子葉植物發育的特定發育階段將其特定組織或器官中的外源基因徹底刪除。本發明的再一個目的在于提供一種含有上述基因刪除系統的植物表達載體，其將上述基因刪除系統與單子葉植物的組織特異性啟動子基因連接構建成植物表達載體，可在特定的植物器官中刪除外源基因。本發明的又一個目的在于提供一種制備安全轉基因單子葉植物的方法。根據本發明的一方面，一種用于轉基因單子葉植物安全性控制的基因刪除系統包括兩個同向的融合特異性識別位點/oxP-i^r,在兩個特異性識別位點之間包含一段多克隆位點序列，所述多克隆位點用于插入各種需要導入植物中的目的基因序列，例如報告基因、篩選基因以及需轉化入植物內的外源基因。在本發明的一個具體實施方案中，構建了融合基因Ubi-GUS::NPTII-Nos，并將該融合基因片斷插入到/ox/>-Fir-Mcs-/oxi>-Fir片段awow戶/a加歷otec/2.乂W07,5.63-374)的多克隆位點中，獲得pLF-Ubi-GN。在構建的融合基因中，GUS作為報告基因，NPTII作為篩選基因。根據本發明的另一方面，為了控制重組酶基因在特定單子葉植物器官中的表達，從而可以有目的地從特定的植物組織器官中刪除外源基因，本發明提供了含有本發明基因刪除系統的植物表達載體。通過將植物特定器官的組織特異性啟動子序列插入本發明的基因刪除系統中構建成本發明的植物表達載體，這些組織特異性啟動子包括但不限于花粉特異性啟動子，還包括根特異性啟動子、葉特異性啟動子等等其他植物特異性啟動子。而為了控制重組酶基因在單子葉植物花粉中特異表達，需要選取合適的單子葉植物花粉特異性啟動子。已經發現的單子葉植物啟動子有以下一些，如來源于單子葉植物玉米的MADS-box轉錄因子MADS2基因啟動子(Sc/^e^^ZmM4D5"2y^>rJw決er朋(i尸o〃ewMa組加'ow/"MaizeJcc訓w/afesJ/optomSo(i^y4"Aeri3/""/Vz戸'o/.，似，7M(^U0砂-7079)，盡管該啟動子可以成熟的玉米花粉中高效表達，但也可以在花粉囊和花粉中表達，而且在根中也有少量表達，故不能采用。另外，來源于玉米的白色花粉査爾酮合成酶基因(whpl)啟動子(GMSa^::accwmJado"ma/zew'/fe.2<9似)，在玉米花粉中大量表達，ii對該啟動子組織表達的詳細分析未見報道。通過(http:Vwww.dna.affrc.go.jp/PLACE/)對其分析發現，該啟動子確實可以在花粉中表達，但同時也可能在根和葉子中表達，因此，在缺乏實驗證據的情況下，不能選取該啟動子。而來自玉米的花粉特異性啟動子ZM13最先被HamiltonD.A.等(5fec.P/"加i^/ra<i./9砂，2，205-2")分離，隨后通過瞬時表達的方法被證實該啟動子在花粉中特異表達(/^脂7towpo〃ew-^speci^c/rowo&r^^Ywwaize^v3ww.ewf/raws^r附a/z'owassays.Afo/所o/,79"，1277-WS)。但該啟動子在單子葉轉基因植物中穩定表達的情況如何一直未見報道。根據前面的報道，利用植物啟動子元件分析軟件PLACE對ZM13啟動子進行分析，發現了大量的花粉組織特異性表達元件GTGANTG10和POLLEN1LELAT52，由此推測ZM13啟動子將在單子葉植物花粉中特異性表達。因此，采用玉米花粉特異性啟動子ZM13控制"Gene-deletor"系統中重組酶FLP基因表達。同時采用來源于玉米的組成性啟動子Ubi啟動子驅動GUS和NPTII融合基因的表達，所有外源基因(包括重組酶FLP基因，GUS報告基因和NPTII抗性)置于兩個融合識別位點loxP-FRT之間。通過改造，希望該系統能夠在轉基因單子葉植物中高效刪除外源基因。在本發明的一個具體實施方案中，通過PCR方法從玉米基因組中克隆了ZM13啟動子，插入到FLP-Nos片段前，得到ZM13-FLP-Nos，再將該片斷引入質粒載體pLF-Ubi-GN上人工合成序列的多克隆位點中，獲得最終的植物表達載體，將其命名為pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN。將pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN載體通過基因槍轟擊玉米愈傷組織，獲得轉基因玉米。將花粉特異性啟動子ZM13與FLP基因融合，可以控制基因刪除系統在轉基因植物的花粉中特異表達，以刪除轉基因植物花粉中所有的外源基因。在本發明的另一個具體實施方案中，制備安全的轉基因植物的方法，包括將本發明的基因刪除系統、組織特異性啟動子與外源基因構建成植物表達載體轉化植物而獲得安全的轉基因玉米。采用GUS組織染色、PCR鑒定和Southern雜交等手段對本發明的轉基因植株進行檢測，確定轉基因植物外源基因的拷貝數。此外，分別對轉基因pLF-ZM13-FLP-GN植物的不同組織進行GUS染色，發現在轉基因植株的根、莖、葉中，轉基因能夠正常表達，說明重組酶基因FLP在花粉特異性啟動子驅動下沒有在營養器官中表達，外源基因的表達沒有受到影響。通過對轉基因玉米花粉的GUS基因進行檢測，在轉基因pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN玉米花粉中，GUS組織染色后的結果說明，外源基因被完全刪除。通過對pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN基因刪除系統在轉基因玉米花粉中的刪除效率進行了統計，統計結果顯示刪除效率都達到了99.9%。因此，本發明成功地構建了單子葉植物基因刪除系統和包含該刪除系統的植物表達載體，該刪除系統大大高于現有基因刪除系統的刪除效率。為了更好地理解本發明的本質，下面結合附圖，通過對本發明較佳實施方式的描述，詳細說明但不限制本發明。圖1為PCR擴增玉米花粉特異性啟動子ZM13的電泳圖譜；其中，泳道1為花粉特異性啟動子ZM13;泳道2為陰性對照，水作為模板;圖2為PCR擴增Ubi啟動子的電泳圖譜；其中，泳道l為組成性啟動子Ubi;泳道2為陰性對照，水作為模板；圖3為GUS基因和NPTII-Nos基因片段的電泳圖譜;其中，泳道1為GUS基因；泳道2為NPTII-Nos基因片段；圖4為pLF-Ubi-GN質粒結構圖5為pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN質粒結構圖6為PCR驗證轉基因pLF-Ubi-GN和pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN植物的結果；其中，A:MM，DNA分子Marker;泳道1為陰性對照；泳道9為陽性對照；泳道28分別代表GUS染色結果呈陽性的轉基因pLF-Ubi-GN植物植株的PCR檢測結果；B:MM，DNA分子Marker;泳道9為陰性對照；泳道1為陽性對照；泳道28分別為GUS染色結果呈陽性的轉基因pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN植株的PCR檢測結果。圖7為Southern雜交驗證轉基因植株結果；其中，l為野生型植株，作為陰性對照；2、3、4分別為轉基因pLF-Ubi-GN植物植株2、3、6的基因組DNA被^m"I酶切后的電泳圖譜；5、6、7、8為轉基因pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN植株2、5、9禾n11。結果顯示，轉基因pLF-Ubi-GN植株2為多拷貝T-DNA片斷插入，植株3、6為單拷貝；轉基因pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN植株5和11為2個拷貝T-DNA片斷插入，植株2、ll為單拷貝。DNA探針為GUS基因的酶切片段；圖8為GUS基因在轉基因pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN玉米不同組織中的表達情況；其中，(A)葉片(橫切)；(B)莖(橫切)；(C)根；圖9為轉基因pLF-Ubi-GN和pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN玉米T。代花粉GUS染色后的顯微觀察結果；其中，A，為轉基因pLF-Ubi-GN玉米未成熟花粉；B，為轉基因pLF-Ubi-GN玉米成熟花粉；C，為轉基因pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN玉米未成熟花粉；D，為轉基因pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN玉米成熟花粉；圖10為PCR擴增轉基因pLF-Ubi-GN和pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN的TQ代植物刪除前后花粉中外源DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳結果。具體實施例方式本發明所用的試驗材料如無特別說明均為市售購買產品。實施例1植物表達載體的構建1、玉米花粉特異性啟動子ZM13的克隆根據Hamilton等(//a/m7towda/,5fec.P/mrfi^/rad79<S9，2，，S-"2)的報道分別合成兩對引物，上游引物為5'>GCGGTACCCCACTTCGCGGATTCCAC<3'(ATp"I)，下游引物為5'>GTCTGCAGTATGGTACCAACGGCGGCCC〈3'(戶Wl)，從玉米(Z朋基因組中，PCR擴增出花粉特異性啟動子ZM13。反應成分基因組DNA(25ng/|dL)2微升dNTP(各10mM)2微升氯化鎂(5mM)+10倍緩沖液2微升上游引物、下游引物(各100iLiM)2微升PlatimumPfxDNA聚合酶2UDNA聚合酶10倍緩沖液5微升總反應體積50微升反應參數95°C，5分鐘。94°C，l分鐘，57°C,1分鐘，72°C，1分鐘，35個循環。72°C延伸10min。擴增后凝膠電泳的結果見圖1，PCR產物經小量膠回收試劑盒純化后，以Xp"I/戶Wl雙酶切，然后克隆于pBlue-FLP-Nos(O'Gorw"",51.efa/,5We"ce，/997，7257:"57-"35)。用Kp"I/尸M雙酶切鑒定，獲得的陽性克隆再測序(PE公司，377測序儀；上海生工生物工程技術服務有限公司)驗證，測序正確的質粒命名為pBlue-ZM13-FLP-Nos。2、組成型啟動子Ubi的克隆根據Vickers等(Wc&randa/.，尸/a"fCe〃及ep.22:"5-"0)的報道，分別合成兩對引物，上游引物為5'〉CCCTCGAGTGCAGCGTGACCCGGTCGTGCC〈3'dol)，下游引物為5'>CCGGATCCCACCAAACAACAGGGTGAGC<3'(SamHI)，從玉米(Zea歷aj^)基因組中，PCR擴增出組成性啟動子Ubi。反應成分除了模板DNA為玉米DNA夕卜，其他都相同于擴增ZM13啟動子的成分。反應參數95°C，5分鐘。94°C，l分鐘，58°C，1分鐘，72°C，2分鐘，35個循環。72°C延伸10min。擴增后凝膠電泳的結果見圖2，PCR產物經小量膠回收試劑盒純化后，以J^oI/^2mHI雙酶切，然后克隆于pBluescriptIIKS(+)。用^oI/5amHI雙酶切鑒定，獲得的陽性克隆再測序(PE公司，377測序儀；上海生工生物工程技術服務有限公司)驗證，測序正確的質粒命名為pBlue-Ubi。3、Ubi-GUS::NPTII-Nos融合基因的獲得參照Fabijanski等專利(Fa^arayb',&F，7o6eW，丄.^/，『(9W5卯S6朋dGewB朋A;爿ccmw'o"iVo.M26402:005..:/^77//船/0".200"，構建GUS基因和NPTII基因的融合基因。具體過程為首先根據Chen等的報道(C/ze"，&a/，Mo/.5red2003,77,"3)，分別合成兩對引物，上游引物為5'>GGTCTAGAATGATTGAACAAGATGGATTG〈3'(含j^al)，下游引物為5'>GGGTCGACAGACTCCCCGATCTAGTAACATAGTA<3'(含和6bcl)。采用上述引物，以pBI121質粒DNA為模板，用高保真的PlatimumPfkDNA聚合酶(Invitrogen，USA)進行PCR擴增。反應成分除了模板DNA為質粒pBI121夕卜，其他都相同于擴增Ubi啟動子的成分。反應參數95°C，5分鐘。94°C，l分鐘，57°C，1分鐘，72。C，1.5分鐘，20個循環。72。C延伸10min。擴增后凝膠電泳的結果見圖3，PCR產物經小量膠回收試劑盒純化后，將NPTII-nos片段通過^^I/SacI酶切位點裝入到pBluescriptIIKS(+)上，用^"K^cI雙酶切鑒定，獲得的陽性克隆再測序驗證，測序正確的克隆命名為pBlue-NPTII-Nos。采用上述同樣的方法，通過PCR擴增的方式獲得GUS基因片段，根據Chen等的報道合成以下引物，上游引物為5'>GGTCTAGAATGTTACGTGGTGTAGAAACC<3'(j^al)，下游引物為5'>GGGGATCCTCATTGTTTGCCTCCCTGCT<3'(5amHI)。采用上述弓l物，以pBI121質粒DNA為模板，用高保真的PufDNA聚合酶(Invitrogen，USA)進行PCR擴增。反應成分除了模板DNA為質粒pBI121夕卜，其他都相同于擴增Ubi啟動子的成分。反應參數95°C，5分鐘。94°C，l分鐘，57°C，1分鐘，72°C，1.5分鐘，20個循環。72。C延伸10min。擴增后凝膠電泳的結果見圖3，PCR產物經小量膠回收試劑盒純化后，將GUS片段通過jaal/BamHI酶切位點裝入到pBlue-NPTII-Nos上，用J^al/BamHI雙酶切鑒定，獲得的陽性克隆再測序驗證，測序正確的克隆命名為pBlue-GUS:NPTII隱Nos。最后通過屈oI/BamHI酶切中間載體pBlue-Ubi和pBlue-GUS::NPTII，將組成型啟動子Ubi裝入到pBlue-GUS::NPTII前，用屈oI/Bamffl雙酶切鑒定，獲得的陽性克隆再測序驗證，并命名為pBlue-Ubi-GUS::NPTII。在該融合基因兩端分別含有一個IoI和&/I位點，以便下一步構建。4，植物表達載體的構建用loIASWI雙酶將Ubi-GUS::NPTII融合基因片斷從中間載體pBlue-Ubi-GUS::NPTII上切下，插入植物載體pLF(丄wo^"/.，戶/a"f說o/ec/z./5:263-374)的相應位點，得到載體pLF-Ubi-GN(/ox戶簡寫為L，Fi77簡寫為F，GUS::NPTII簡寫為GN)，質粒結構圖見圖4。用禾卩5*a/I雙酶從中間載體上pBlue-ZM13-FLP-Nos切下ZM13-FLP-Nos基因片段，插入到載體pLF-Ubi-GN上的Ubi-GUS::NPTII融合基因前面的和酶切位點之間，獲得植物表達載體pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN，質粒結構圖見圖5。將各個質粒采用液氮凍融法轉化到根癌農桿菌LBA4404中。實施例2轉基因玉米植株的獲得遺傳轉化玉米的遺傳轉化參見Wang等(http:〃www.agron.iastate.edu/ptf/service/biolisticmaize.aspx)方法。取玉米HiII系(來自A188xB73)的幼胚為外植體，去苞葉后在70%酒精中浸泡2min，然后在0.1%HgCh溶液中消毒20min,用無菌水沖洗3遍后吸干水漬，接種于誘導培養基上。在MS培養基上加入2mg/L2,4-D誘導胚性愈傷組織的產生。取不同生長時期的胚性愈傷組織進行轉化。基因槍型號為BiolisticPDS-1000/HeParticleDeliverySystem(Bio-Rad)。轟擊參數為可裂圓片與載體的距離2.5cm，載體與阻擋網的距離0.8cm，阻擋網與靶細胞的距離6cm,氦氣壓力7.58x103kPa，真空度1137.8kPa，金粉直徑1mm，金粉劑量分別為100mg金粉(167ngDNA)槍和370mg金粉(625ngDNA)/槍，每皿120塊左右愈傷組織。轟擊后的愈傷組織繼代培養1次，再轉入含半致死濃度除草劑的培養基上進行篩選，3周后，選擇生長正常的愈傷組織繼續篩選，連續篩選3代。抗性愈傷組織在含除草劑的分化培養基上再生植株。小苗在生根培養基上根系變發達,34葉期移栽入花盆中。GUS檢領!l:將轉基因植物材料(葉片、莖、根等)切成薄片，放入新鮮配置的X-Gluc染色液(Promega,USA)中，37°C保溫1~12小時。待充分染色后，用75%(v/v)酒精脫色2~3次，至對照材料(野生型植物)呈白色。花粉由于包被角質層和種皮，X-Gluc染色液難以浸透，為了染色充分，通常情況下，加入X-Gluc染液后，先抽真空510分鐘，再按以上程序進行GUS組織染色。PCR檢測提取植物基因組DNA，采用CTAB法，過程如下將液氮速凍后的幼嫩葉片研磨成粉末，轉移至10ml的離心管中，加入65°C預熱的CTAB提取緩沖液(0.1g/ml)，劇烈震蕩混勻。65°C水浴45分鐘，其間顛倒混勻23次。加入與提取緩沖液等體積的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，渦旋混勻3~5分鐘，然后6000轉/分鐘，常溫離心15分鐘，將上清液轉移到一新離心管中。加入2/3倍于上清液體積的異丙醇，充分混勻后室溫放置2小時以上。在離心管中可見白色絮狀沉淀，可用玻璃棒挑出，放入75%(v/v)的酒精漂洗2~3次；也可直接10000轉/分鐘室溫離心10分鐘收集沉淀，用75%(v/v)的酒精洗滌沉淀。空氣干燥后，加入適量的TE溶解沉淀即得到基因組DNA。電泳檢測植物總DNA含量。PCR檢測再生植株中的NPTII抗性基因，合成其兩端引物，上游引物為5'-AGGCTATTCGGCTATGACTGG-3',下游引物5'-TCGGGAGCGGCGATACCGTA-3'。反應成分除了模板DNA為轉基因玉米基因組DNA外，其他都相同于擴增ZM13啟動子的成分。反應參數95°C,5分鐘；94°C，l分鐘，56°C，1分鐘，72°C，1分鐘，40個循環。72°C延伸10min。轉基因pLF-Ubi-GN和pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN玉米PCR檢測的結果見圖6A和圖6B。Southern雜交分析為進一步證明外源基因已經導入轉基因植物中，分別選取3個轉基因pLF-Ubi-GN和4個LF-ZM13-FLP-Ubi-GNT。代植株進行了Southern雜交驗證，同時確定了這幾個植株外源基因插入轉基因玉米基因組中的拷貝數。采用常用的CTAB法提取10嗎植物基因組DNA用限制性內切酶S柳d充分酶切，然后在1.0%(w/v)瓊脂糖凝膠上電泳。再按《分子克隆實驗指南》QW7牟)的高鹽法進行轉膜、預雜交、雜交、洗膜和放射自顯影。將pBI121質粒DNA的GUS片段，用RadPrimerandomprimerlabelingkit(GibcoBRL)標記上同位素ot-32P，獲得DNA探針。轉基因pLF-Ubi-GN和pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN植株Southern雜交結果見圖7。當以GUS片段作為探針時，Southern雜交結果顯示，在轉基因pLF-Ubi-GN植株3(泳道2)中至少還有2個條帶，說明在該植株基因組上，至少有2個拷貝的外源基因插入，在植株4(泳道3)和7(泳道4)中，各有1條帶，說明為單拷貝。而在轉基因pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN植株2(泳道5)和8(泳道7)中有1條帶，均為單拷貝，植株5(泳道6)和12(泳道8)中有2條帶，它們為2個拷貝插入。在野生型植株(泳道l)中，未檢測到任何雜交信號。以上結果與GUS染色和PCR檢測結果相符，說明外源基因確實已經導入到轉基因玉米的基因組中。實施例3轉基因植株中外源基因的表達分析1、轉基因pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN玉米中GUS基因的表達分析選取花粉特異性啟動子ZM13控制位點特異性重組酶FLP基因的表達，理論上，在轉基因pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN植物中，ZM13啟動子控制的重組酶FLP基因應該只在成熟花粉中表達，刪除外源基因。因此，在轉基因植物花粉成熟以前的所有組織中都應該能檢測到GUS報告基因(組成型啟動子Ubi控制)的大量表達。為了檢測啟動子ZM13是否具有組織特異性表達特征，分別選取轉基因pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN玉米植株2中To代植物的根、莖和葉等材料進行GUS組織染色，圖8中顯示的是pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN轉基因植物不同組織的GUS染色結果。表明外源基因能夠在轉基因植物根、莖和葉等材料中正常表達。實施例4轉基因植株花粉中外源基因的刪除分析1、轉基因pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN玉米花粉中外源基因的刪除分析在轉基因pLF-Ubi-GN植物單拷貝植株中，由于沒有位點特異重組酶基因存在，GUS基因的表達在花粉發育早期(圖9-A)很高，GUS組織染色后多數花粉都呈藍色，在花粉發育后期(圖9-B)時，GUS基因的表達量仍然很高。在轉基因pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN玉米植株的T。代花粉中，重組酶FLP基因有花粉特異性啟動子ZM13控制，同時存在融合識別位點/oxP-i^r，盡管在在花粉發育早期(圖9-C)時GUS基因的表達同樣很高，但在花粉發育后期(圖9-D)中沒有觀察到藍色花粉，說明在花粉成熟的中后期，由于花粉特異性啟動子ZM13引導重組酶FLP基因表達，該重組酶能迅速起作用，花粉基因組上的GUS等外源基因完全被刪除，細胞中GUS蛋白被降解，所以在花粉發育晚期GUS組織染色后，沒有檢測到藍色花粉的存在。實施例5轉基因植株花粉中外源基因的刪除效率分析1、轉基因pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN玉米中外源基因的刪除效率分析為了獲得pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN系統在轉基因玉米花粉中刪除外源基因的效率，首先對各個轉基因植株的成熟花粉進行GUS組織染色，在顯微鏡下統計藍白花粉的數量，得到系統在轉基因玉米花粉中的刪除效率，部分統計結果見表1所示。表l.轉基因玉米花粉中的刪除效率統計<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注如果轉基因植株為單拷貝時，花粉中刪除效率％=(白色花粉數-藍色花粉數)/(藍色花粉數+白色花粉數)X100%。如果轉基因植株具有兩個拷貝，則刪除效率％=(3乂白色花粉數-藍色花粉數)/3X(藍色花粉數+白色花粉數)X100%。ND表示該植株中刪除效率未統計。結果顯示，在轉基因pLF-Ubi-GN花粉中，盡管存在融合識別位點，但由于沒有重組酶基因，各個植株中刪除效率都為0。而在轉基因pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN花粉中，植株2和9的花粉計數到3800上，沒有發現藍色幼苗，這些植株都為單拷貝轉基因植物。根據Southern雜交的結果可知，植株5和11為雙拷貝轉基因植株，其刪除效率僅為62.1%和68.9%。2、轉基因pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN玉米在雜交后代中外源基因的刪除效率分析為了獲得pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN系統在轉基因玉米花粉中更準確的刪除效率，分別將轉基因植株(作為父本)與野生型(作為母本)進行雜交，并對雜交后代的幼苗GUS組織染色，通過對藍白幼苗的統計，得到這些系統在轉基因玉米花粉中的刪除效率，部分統計結果見表2所示。表2.轉基因玉米雜交后代中的刪除效率統計<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注如果轉基因植株為單拷貝時，雜交后代刪除效率％=(白色幼苗數-藍色幼苗數)/(藍色幼苗數+白色幼苗數)X100%。如果轉基因植株具有兩個拷貝，則刪除效率％=(3乂白色幼苗數-藍色幼苗數)/3X(藍色幼苗數+白色幼苗數)X100%。ND表示該植株中刪除效率未統計。結果顯示，在轉基因pLF-Ubi-GN(父本)X野生型(母本)雜交后代中，盡管存在融合識別位點，但由于沒有重組酶基因，各個植株中刪除效率都為0。在pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN(父本)X野生型(母本)的雜交后代中，ZM13啟動子引導FLP重組酶基因表達，GUS染色統計的結果顯示，植株2和9的幼苗也計數到1000以上，僅分別發現2株和1株藍色幼苗，刪除效率達到99.8%和99.9%,這些植株都為單拷貝轉基因植物。而植株11為2個拷貝插入，其刪除效率僅為69.8%。刪除效率最低的轉基因植株是植株5，只有62.8%，該結果與表l中轉基因花粉GUS組織染色的統計結果基本一致。實施例6轉基因植物花粉基因組中殘余外源片段的檢測根據圖9和表1、2的結果，在轉基因pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN植株2和9中，外源基因已經從超過99。/。的轉基因植物花粉基因組中被刪除。為了進一步檢測了表達載體pLF-Ubi-GN和pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN的T-DNA是否整合到轉基因植物中，以未刪除前轉基因植物基因組DNA為模板，設計一對引物擴增GUS:NPTII融合基因片斷，PCR擴增，得到圖10A的結果。同時，為確定轉基因pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN植物花粉基因組中外源基因已被刪除掉，在T-DNA兩端邊界序列與foxPFir融合識別位點序列之間設計了一對引物，以轉基因植物To代與野生型雜交后代的基因組DNA為模板，PCR擴增，得到圖10B的結果。從圖10A中可知，如果以轉基因pLF-Ubi-GN和pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN植物T。代開花前基因組DNA作為PCR擴增的模板，均能夠分別得到一條2.8kb的擴增產物，該片斷代表融合基因GUS::NPTII，說明外緣基因已經成功插入植物基因組中。而以轉基因pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN植物與野生型玉米雜交后代基因組DNA作為PCR擴增的模板，由于位點特異性重組酶系統已經刪除了融合識別位點序列之間的Ubi-GUS::NPTII-nos基因、重組酶基因和一個融合識別位點fox戶i^r，所以PCR擴增得到的結果只包括一個融合識別位點序列以及來自于T-DNA片段上的結構序列，大小約為1.1kb(圖10B-5和圖10B-6)。采用同樣的引物，以轉基因pLF-Ubi-GN植物To代開花前基因組DNA作為PCR擴增的模板，均能夠分別得到一條5.6kb的擴增產物，該片斷代表融合基因Ubi-GUS::NPTII-nos基因和一對融合識別位點/ox尸F及r，說明由于轉基因pLF-Ubi-GN植物中沒有重組酶基因存在，外緣基因未被刪除掉。以上結果再次表明，在轉基因pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN植株2和9花粉基因組中，外源功能基因已經被刪除。以上對本發明的詳細描述并不限制本發明，本領域技術人員可根據本發明做出各種改變和變形，這些改變和變形均應屬于本發明所附權利要求的范圍。序列表SEQIDNO.1<110>西南大學<120用于轉基因單子葉植物安全性控制的基因刪除系統<160〉4<170patentInversion3.1<210>1<211>1162<212>DNA<213>玉米(Z朋<220〉<221>promoter<222>(1)...(1162)<223><400>1GGTGAAGCGCCTAAGGTGTAAGCAGGAAAGCTTCGGCAAGACAGCAGCAGTTGAAACCGACTTAAAGATGAAAAGGCTATTTAGACCTCAACAGATTACTATAGGTTTATTATTAAGTGTAAAGGGCATTAATGTAATTTTGCACAGGCTACGTCCCGTGCCTATAAATAGGTGAACAGTATTCCCGTACTGTTCACGCTGACTTGGCATTCGCTTTTTGCGTCACGCTTGTACTGTCATCTCATTCCTATTGAAGGTACACTTGTAATTCAACGATATTTCTGTTTGTACCTAATAATAATATATAATTGTTCATGTTGTCTTTTATATTCTTTATATTTCATCCTTCGTCATTGTTTA7VTGAATTTATGAAGGTACGTCCTTCATAACCTTCGTCCGTAAACCATTATATCCTAAGGGAAATAATGCTTCGAAGGACGAAGGACCTTAACGATTAATATTTTCTATGTTGCCTTGTTCTTAACTCATAGCACTTGAGAACAAGTCTCCAACAGTTTGGTTATTCCTATTCCACGTGGATTAGATGAGATTTAGATAAAATTAGAAATAATTTTGACTTACTAGGGATTTAAACCAACTCAGTCCCGTTCAATCCACATGGATTGAGATTAAAACAACTATTGAGATTTTATTGTATCAACACTCAACACCGATGTGTTTTTATAATACATCTTGCGTGACJVTTTGTCCAAGTACTATGCTAAATATGAGAAGCTGCCATTTAGTGATTCTATATACTATTCACTTATGGATACATTTAACTGATACCGTTTTGTTGAGCGCGTCTTATTTAGTTTTACATAGCAGCATAGAAGATTAGAAGTCGCAAATCCAACTTTTGTGGACCGCTGAAAAACTCAACCAAATTCGACATATTTTTCACCTCCCCATGCCACAAAACTAGGTCAAAACGGCTTTCTGGCCGTCGGCCACTATTTCTACGGGCAGCCAGACAAATCTTCGGGTCTCGCAGATTATTTAAGGACACCACAGGCTGCGT601201802403003604204805406006607207808409009601020TACGAAACCAGGCCAGATTTGCCACCCTCGTCTCACCCTCCCTCCCTCACACAAATAATA1080AGGAAAGGTCCCGCCCTTTTCCTCCGACATCCACAAGGGGGGAGGGGAAAACACGTACAT1140TCACCCGGCGGCAACCATGGTA1162SEQIDNO.2<210〉2<211>1162<212〉DNA<213>玉米(Z朋鵬j^sO<220〉<221〉promoter<222>(O...(1786)<223><400>2ACAACAGGACTCTACAGTTTTATCTTTTTAATAGCTTCACCTATATAAT7VCTTCATCCATTTAATGGTTTTTATAGACTAATTTTTTTAGAATTAAGAAAACTAAAACTCTATTTTAGTTAATAAAATAAAGTGACTAAAAATTAAACAAAAACATTTTTCTTGTTTCGAGTAGATAATGACGGACACCAACCAGCGAACCAGCAGCGTCCATCTCTGTCGCTGCCTCTGGACCCCTCTCCGCTGTCGGCATCCAGAAATTGCGTGGCGGGCCTCCTCCTCCTCTCACGGCACGGCAGCTCTTTCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATACTCGTGTTGTTCGGAGCGCACACACACACAACCTCCGCTTCAAGGTACGCCGCTCGTCCTTCGGCGTTCCGGTCCATGGTTAGGGCCCGGATCCGTGTTTGTGTTAGATCCGTGCTGCTAAGACACGTTCTGMTGCTAACTTGCCAGTGAGCCGTTCCGCAGACGGGATCGATTTCATGTTTGCCCTTTTCCTTTATTTCAATATATGCGTGTGCATGTGTTCTCCTTTOTTTTTGCAA60TTTATTAGTACATCCATTTAGGGTTTAGGG120TACATCTATTTTATTCTJVTTTTAGCCTCTA180TTTTTATTTAATAATTTAGATATAAAATAG240ATACCCTTTAAGAAATTAAAAAAACTAAGG300CCAGCCTGTTAAACGCCGTCGACGAGTCTA360GCGTCGGGCCAAGCGAAGCAGACGGCACGG420GAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTTGCTC480AGCGGCAGACGTGAGCCGGCACGGCAGGCG540ACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCCTTCG600GACACCCCCTCCACACCCTCTTTCCCCAAC660ACCAGATCTCCCCCAAATCCACCCGTCGGC720CCCCCCCCCCCCCTCTCTACCTTCTCTAGA780TAGTTCTACTTCTGTTCATGTTTGTGTTAG840GCGTTCGTACACGGATGCGACCTGTACGTC900TTTCTCTTTGGGGAATCCTGGGATGGCTCT960ATTTTTTTTGTTTCGTTGCATAGGGTTTGG1020CGTGCACTTGTTTGTCGGGTCATCTTTTCA1080TGCTTTTTTTTGTCTTGGTTGTGATGATGTGTAGAATTCTGTTTCAAACTACCTGGTGGACATACATATTCATAGTTACGAATTGAAGATATACATGTTGATGCGGGTTTTACTGATGCAGTGATGATGTGGTGTGGTTGGGCGGTCGTTTTCAAACTACCTGGTGTATTTMTAATTTTTAGTTACGAGTTTAAGATGGATGGAAATATGGTTTTACTGATGCATATACATGATGGCATGAGTACCTATCTATTATAATAAACAAGTATTGGATGATGGCATATGCAGCAGCTATATGTTTTATTTGCTTGG*TACTGTTTCTTTTGTCGGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCTAAAGCAAGGTCTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGA1140TTTATTAATTTTGGATCTGTATGTGTGTGC1200GATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGT1260TATACAGAGATGCTTTTTGTTCGCTTGGTT1320CATTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATACTGT1380GGAACTGTATGTGTGTGTCATACATCTTCA1440CGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGTG1500ATGCAGCATCTATTCATATGCTCTAACCTT1560GTTTTATAATTATTTTGATCTTGATATACT1620GGMTTTTTTAGCCCTGCCTTCATACGCTA1680ATGCTCACCCTGTTGTTTGGTGTTACTTCT1740GCAAGAGCAATAAACA1786SEQIDNO.3<210>3<211>1812〈212>DNA<213>大腸桿菌(Esc/;e"'c/'aco//)<220><221>DNA<222>(1)...(1812)<223><400>3ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAACCMetLeuArgProValGluThrProThr15AGTCTGGATCGCGMAACTGTGGAATTSerLeuAspArgGluAsnCysGlylie2530CGGGCAATTGCTGTGCCAGGCAGTTTTArgAlalieAlaValProGlySerPheCGTGAAATCAAAAAACTCGACGGCCTGTGGGCATTC63ArgGlulieLysLysLeuAspGlyLeuTrpAlaPhe101520GATCAGCGTTGGTGGGAAAGCGCGTTACMGMAGC126AspGinArgT:rpTrpGluSerAlaLeuGinGluSer3540MCGATCAGTTCGCCGATGCAGATATTCGTAATTAT189AsnAspGinPheAlaAspAlaAsplieArgAsnTyr45505560GCGGGCAACGTCTGGTATCAGCGCGAAGTCTTTATACCGAAAGGTTGGGCAGGCCAGCGTATC252AlaGlyAsnValTrpTyrGinArgGluValPhelieProLysGlyTrpAlaGlyGinArglie65707580GTGCTGCGTTTCGATGCGGTCACTCATTACGGCAAAGTGTGGGTCAATAATCAGGAAGTGATG315ValLeuArgPheAspAlaValThrHisTyrGlyLysValTrpValAsnAsnGinGluValMet859095100105GAGCATCAGGGCGGCTATACGCCATTTGAAGCCGATGTCACGCCGTATGTTATTGCCGGGAAA378GluHisGinGlyGlyTyrThrProPheGluAlaAspValThrProTyrVallieAlaGlyLys110115120125AGTGTACGTATCACCGTTTGTGTGAACMCGAACTGAACTGGCAGACTATCCCGCCGGGAATG441SerValArglieThrValCysValAsnAsnGluLeuAsnTrpGinThrlieProProGlyMet130135140145GTGATTACCGACGAAAACGGCAAGAAAAAGCAGTCTTACTTCCATGATTTCTTTAACTATGCC504VallieThrAspGluAsnGlyLysLysLysGinSerTyrPheHisAspPhePheAsnTyrAla150155160165GGAATCCATCGCAGCGTAATGCTCTACACCACGCCGAACACCTGGGTGGACGATATCACCGTG567GlylieHisArgSerValMetLeuTyrThrThrProAsnThrTrpValAspAsplieThrVal170175180185GTGACGCATGTCGCGCMGACTGTMCCACGCGTCTGTTGACTGGCAGGTGGTGGCCAATGGT630ValThrHisValAlaG丄nAspCysAsnHisAlaSerValAspTrpGinValValAlaAsnGly190195200205210GATGTCAGCGTTGAACTGCGTGATGCGGATCAACAGGTGGTTGCAACTGGACAAGGCACTAGC693AspValSerValGluLeuArgAspAlaAspGinGinValValAlaThrGlyGinGlyThrSer215220225230GGGACTTTGCMGTGGTGAATCCGCACCTCTGGCMCCGGGTGAAGGTTATCTCTATGAACTG756GlyThrLeuGinValValAsnProHisLeuTrpGinProGlyGluGlyTyrLeuTyrGluLeu235240245250TGCGTCACAGCCAAAAGCCAGACAGAGTGTGATATCTACCCGCTTCGCGTCGGCATCCGGTCA819CysValThrAlaLysSerGinThrGluCysAsplieTyrProArgValGlylieArgSer255260265270GTGGCAGTGAAGGGCGAACAGTTCCTGATTAACCACAAACCGTTCTACTTTACTGGCTTTGGT882ValAlaValLysGlyGluGinPheLeulieAsnHisLysProPheTyrPheThrGlyPheGly275280285290CGTCATGAAGATGCGGACTTGCGTGGCMAGGATTCGATAACGTGCTGATGGTGCACGACCAC945ArgHisGluAspAlaAspLeuArgGlyLysGlyPheAspAsnValLeuMetValHisAspHis295300305310315GCATTAATGGACTGGATTGGGGCCMCTCCTACCGTACCTCGCATTACCCTTACGCTGAAGAG1008AlaLeuMetAspTrplieGlyAlaAsnSerTyrArgThrSerHisTyrProTyrAlaGluGlu320325325330ATGCTCGACTGGGCAGATGAACATGGCATCGTGGTGATTGATGAAACTGCTGCTGTCGGCTTT1071MetLeuAspTrpAlaAspGluHisGlylieValValI]eA印GluThrAlaAlaValGlyPhe335340345350AACCTCTCTTTAGGCATTGGTTTCGAAGCGGGCAACAAGCCGMAGAACTGTACAGCGAAGAG1134AsnLeuSerLeuGlylieGlyPheGluAlaGlyAsnLysProLysGluLeuTyrSerGluGlu355360365370GCAGTCAACGGGGAAACTCAGCAAGCGCACTTACAGGCGATTAAAGAGCTGATAGCGCGTGAC1197AlaValAsnGlyGluThrGinGinAlaHisLeuGinAlalieLysGluLeulieAlaArgAsp375380385390AAAAACCACCCAAGCGTGGTGATGTGGAGTATTGCCAACGMCCGGATACCCGTCCGCAAGGT1260LysAsnHisProSerValValMetTrpSerlieAlaAsnGluProAspThrArgProGinGly395400405410415GCACGGGMTATTTCGCGCCACTGGCGGAAGCAACGCGTAAACTCGACCCGACGCGTCCGATC1323AlaArgGluTyrPheAlaProLeuAlaGluAlaThrArgLysLeuAspProThrArgProlie420425430435ACCTGCGTCAATGTAATGTTCTGCGACGCTCACACCGATACCATCAGCGATCTCTTTGATGTG1386ThrCysValAsnValMetPheCysAspAlaHisThrAspThrlieSerAspLeuPheAspVal440445450455CTGTGCCTGMCCGTTATTACGGATGGTATGTCCMAGCGGCGATTTGGAAACGGCAGAGAAG1449LeuCysLeuAsnArgTyrTyrGlyTrpTyrValGinSerGlyAspLeuGluThrAlaGluLys460465470475GTACTGGAAAAAGMCTTCTGGCCTGGCAGGAGAAACTGCATCAGCCGATTATCATCACCGAA1512ValLeuGluLysGluLeuLeuAlaTrpGinGluLysLeuHisGinProlielielieThrGlu■180485490495TACGGCGTGGATACGTTAGCCGGGCTGCACTCAATGTACACCGACATGTGGAGTGMGAGTAT1575TyrGlyValAspThrLeuAlaGlyLeuHisSerMetTyrThrAspMetTrpSerGluGluTyr500505510515520CAGTGTGCATGGCTGGATATGTATCACCGCGTCTTTGATCGCGTCAGCGCCGTCGTCGGTGAA1638GinCysAlaTrpLeuAspMetTyrHisArgValPheAspArgValSerAlaValValGlyGlu525530535540CAGGTATGGAATTTCGCCGATTTTGCGACCTCGCMGGCATATTGCGCGTTGGCGGTAACAAG1701GinValTrpAsnPheAlaAspPheAlaThrSerGinGlylieLeuArgValGlyGlyAsnLys545550555560AAAGGGATCTTCACTCGCGACCGCAAACCGMGTCGGCGGCTTTTCTGCTGCAAMACGCTGG1764LysGlyliePheThrArgAspArgLysProLysSerAlaAlaPheLeuLeuGinLysAfgTrp565570575580ACTGGCATGAACTTCGGTGMAAACCGCAGCAGGGAGGCAAACAATGA1812ThrGlyMetAsnPheGlyGluLysProGinGinGlyGlyLysGin氺585590595SEQIDNO.4<210>4<211>1440<212>DNA<213>大腸桿菌(￡sc/7er/c/'aco〃)<221>DNA<222>(1)...(1440)<223><400>4ATCATTGAACMGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGC63MetlieGluGinAspGlyLeuHisAlaGlySerProAlaAlaTrpValGluArgLeuPheGly15101520TATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAG126TyrAspTrpAlaGinGinThrlieGly2530GGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCMGACCGlyArgProValLeuPheValLysThr4550GCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGAlaAlaArgLeuSerTrpLeuAlaThr6570ACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTAThrGluAlaGlyArgAspTrpLeuLeu8590CACCTTGCTCCTGCCGAGMAGTATCCHisLeuAlaProAlaGluLysValSer110GATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACAspProAlaThrCysProPheAspHis130135ATGGMGCCGGTCTTCTCGATCAGGATMetGluAlaGlyLeuValAspGinAsp150155GAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCGluLeuPheAlaArgLeuLysAlaArg170175GATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGAspAlaCysLeuProAsnlieMetVal185190CGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGArgLeuGlyValAlaAspArgTyrGin210CTTGGCGGCGMTGGGCTGACCGCTTCLeuGlyGlyGluTrpAlaAspArgPheCysSerAspAlaAlaValPheArgLeu35GACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGAspLeuSerGlyAlaLeuAsnGluLeu5560ACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCThrGlyValProCysAlaAlaValLeu7580TTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCLeuGlyGluValProGlyGinAspLeu95100ATCATGGCTGATGCAATCCGGCGGCTGlieMetAlaAspAlaMetArgArgLeu115120CMGCG嵐CATCGCATCGAGCGAGCAGinAlaLysHisArglieGluArgAla140GATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCAspLeuAspGluGluHisGinGlyLeu160165ATGCCCGACGGCGATGATCTCGTCGTGMetProAspGlyAspAspLeuValVal175180GMMTGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGluAsnGlyArgFheSerGlyPhelie195200GACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTAsplieAlaLeuAlaThrArgAsplie215220CTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCLeuValLeuTyrGlylieAlaAlaProSerAlaGin40CAGGACGinAspGAGGluCTGLeuCATHisCGTArg145GCGAlaTCASerACGThr125ACTThrCCAProTCTSer105CTTLeuCGGArgGCCAlaGACAspGCTAlaGATAspTGTCysGAAGlu225TCGSerGGCGly205GAGGluCAGGin189GACGTTGTC252AspValVal315378441504ACCCATGGC567ThrHisGly630693756230235CGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCArglieAlaPheTyrArgLeuLeuAspGluPhePhe240250TGAGCGGGACTCTGGGGTTC255GAAATGACCG245792ACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAG852ATTTCGATTCCCGGCTGGATCTGCGGAACAACGCCACGATGCGACTGCCCTGGAGTTCCCTCTTAAGATTACGTTAAGCATGATTAGAGTACTAGGATAACACCGCCGCCGATCCTCCAGGGCGGTCGAACCTGAGCGACAGGCAAGACCGCCACAGACCGAATCCTGTTTGTAATAATTCCCGCAATTAATTATCGCGCTTCTATGAAACGCGGGGATCGGTGCCGATAAATATGATCGGAGATGCACCCGGATGATCCGCCGGTCTTGAACATGTAATTACATTTAATGCGGTGTCATGGTTGGGCTTTCATGCTGGATCATTACGACGGCCCGGCGTGCGATATCTTCCGATCGTTCCGATGATTATGCATGACGTTACGCGATAGACTATGTTACTCGGAATCGTTGTTCTTCGCCAGCAACGGCCCCACATCAACGCTGCGTTCGAAACATTTGGCATATAATTTATTTATGAGAAAACAAAATAAGATCGGGTTCCGGGACGCACGGGATCTGACAAGCACAGGCGTCGGCGGATATTTTCGCAATAAAGTTCTGTTGAATTTGGGTTTTTATAGCGCGCAA91297210321092115212121272133213921440權利要求1、一種用于轉基因單子葉植物安全性控制的基因刪除系統，包括兩個同向的loxP與FRT融合的特異性識別位點loxP-FRT，在所述兩個特異性識別位點之間具有一段多克隆位點序列，其中所述loxP為來源于細菌噬菌體的Cre位點特異性重組酶的識別位點，所述FRT為來源于酵母的FLP位點特異性重組酶的識別位點，所述loxP-FRT由loxP識別位點序列與FRT識別位點序列融合形成，所述多克隆位點用于插入各種需要導入植物中的目的基因序列。2、權利要求1所述的基因刪除系統，其特征在于所述特異性識別位點/oxP-Fir至少包含34bp的/ox尸序列和48bp的Fir序列，分別如SEQIDNO.l和SEQIDNO.2所示。3、權利要求1所述的基因刪除系統，其特征在于所述融合的特異性識別位點中，在/ox戶序列與Fir序列之間還包括一段間隔序列。4、權利要求3所述的基因刪除系統，其特征在于所述融合的特異性識別位點具有SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。5、權利要求1所述的基因刪除系統，其特征在于所述融合的特異性識別位點具有SEQIDNO.4所示的序列。6、含有權利要求i所述的基因刪除系統的植物表達載體。7、權利要求6所述的植物表達載體，其特征在于在所述植物表達載體中，在基因刪除系統的多克隆位點進一步引入一單子葉植物組織特異性啟動子序列，所述單子葉植物組織特異性啟動子序列為花粉特異性啟動子ZM13序列。8、權利要求7所述的植物表達載體，其特征在于采用玉米花粉特異性啟動子ZM13控制"Gene-deletor"系統中重組酶FLP基因表達，同時采用來源于玉米的組成性啟動子Ubi啟動子驅動GUS和NPTII融合基因的表達，所有外源基因，包括重組酶FLP基因，GUS報告基因和NPTII抗性，置于兩個融合識別位點loxP-FRT之間。9、權利要求8所述的植物表達載體，其特征在于將從玉米基因組中克隆的ZM13啟動子，插入到FLP-Nos片段前，得到ZM13-FLP-Nos，再將該片斷引入質粒載體pLF-Ubi-GN上人工合成序列的多克隆位點中，獲得最終的植物表達載體，將其命名為pLF-ZM13-FLP-Ubi-GN。10、一種制備安全的轉基因單子葉植物的方法，包括將權利要求1所述的基因刪除系統、單子葉植物組織特異性啟動子與需導入植物的外源基因構建成植物表達載體轉化植物而獲得安全的轉基因單子葉植物。11、權利要求1所述的基因刪除系統在制備轉基因單子葉植物中的用途。全文摘要本發明涉及一種用于轉基因單子葉植物安全性控制的基因刪除系統，包括兩個同向的loxP與FRT融合的特異性識別位點loxP-FRT，在所述兩個特異性識別位點之間包含一段用于插入需導入植物中的目的基因的多克隆位點序列，將本發明的基因刪除系統進一步引入一單子葉植物組織特異性啟動子序列而構建的植物表達載體可以在特定的植物器官完全刪除外源基因，本發明的基因刪除系統刪除效率達99.8％，可用于制備安全的轉基因單子葉植物。文檔編號C12N15/11GK101624594SQ20091010377公開日2010年1月13日申請日期2009年5月4日優先權日2009年5月4日發明者明羅,羅克明,珊胥,炎裴,鄭雪蓮申請人:西南大學