專利名稱：：對蚊子等雙翅目昆蟲有殺蟲活性的Btcry40Dal基因及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬微生物基因工程
技術領域：
，亦屬于生物防治
技術領域：
，具體涉及一種來自蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因克隆，在宿主細胞(工程菌)中的誘導表達及其在生物防治領域的應用。
背景技術：
：蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringensis,簡稱Bt)能產生對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等多種害蟲具有高毒殺作用的殺蟲晶體蛋白(又稱內毒素)。殺蟲晶體蛋白在Bt菌株形成芽孢生成期間形成，并形成伴孢晶體，是由cry基因和cyt基因編碼。自Schn印f等1981年首次從Bt中克隆cry基因，現在已有400余種殺蟲蛋白基因(http//www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/index.html)。Hofte禾口whiteleyl989年Hofte和Whiteley根據晶體蛋白的氨基酸序列和殺蟲譜的不同，將已經發表的42種Cry蛋白分為4群13亞類。現在分類原則是根據殺蟲晶體蛋白的氨基酸序列同源性，NeilCrickmore為首Bt內毒素命名委員會將它們分為為57大類。不同種類的Cry蛋白不僅殺蟲范圍不同，而且大小也不一樣，大致有三個區域范圍129-138KD、65-67KD和25-28KD。它經特定蛋白酶的水解作用后，釋放有活性的毒性肽核心片斷(toxincorefragment)，然后與敏感昆蟲消化道刷狀緣膜囊(brushbordermemberancevesicles,BBMV)上的受體不可逆特異的高親和結合，快速插入細胞質膜形成穿孔(pore)或病灶(lesion)。引起細胞膜非極化，離子梯度的破壞，擾亂了細胞內外正常的跨膜電勢，及破壞細胞的酸堿平衡。另外Bt在敏感昆蟲的血腔迅速增值會導致昆蟲的敗血癥。一般認為內毒素的作用過程要經溶解、酶解活化、與受體結合、插入和孔洞或離子通道形成等五個環節。蚊蟲、蠅等雙翅目昆蟲吸血叮人，不僅擾亂人們的工作和睡眠，而且傳播瘧疾，絲蟲病，登革熱，黃熱病及乙型腦炎等多種疾病，其以瘧疾和乙腦危害最為嚴重，目前世界上約有5億多人口遭受瘧疾的威脅，嚴重危害人類健康。以前一般利用化學農藥控制蚊蟲生長繁殖，但長期大量使用，不可避免地造成環境污染，并使害蟲產生抗性。控制蚊蟲現在人們把眼光都轉向生物農藥，在1976年，Goldberg等發現了Bt0NR260菌株對蚊蟲具有很強的殺蟲活性。這種菌株屬于一種新的血清型并被命名為Bt以色列亞種(Btsubsp.israelensis)，在它的包涵體中發現了多種殺蟲晶體蛋白成分(GoldbergL.J.，MargalitJ.Mosq.News,1977，37(3)355358)。蘇云金芽孢桿菌以色列亞種作為生物殺蟲劑成功地用于蚊蟲和蚋等多種雙翅目昆蟲的控制已有多年，在瘧疾，登革熱，黃熱病和絲蟲病等蚊媒疾病的控制上發揮了重要的作用(李潔，張應闊，錢萬紅.昆蟲知識，1997，34(2):109111)。近年來，在巴西，印度，法國，尼日利亞，塞內加爾等地，Bti已廣泛地用于蚊幼蟲孽生地的控制，取得了良好的應用防和治效果。作者從中國廣西百色大王嶺自然保護區收集了大量微生物土壤樣品，從中分離到一株高產橢圓形晶體蛋白的Bt菌株，命名為BtS2096-2(見附圖1)。本發明建立了PCR-RFLP方法鑒定該Bt菌株cry40基因的鑒定體系，然后利用PCR方法獲得獲取了Cry40Da基因全基因序列，該基因蘇云金芽孢桿菌國際命名委員會確認為一個新的cry模式基因，命名為cry40Dal基因。Cry40Dal基因并在大腸桿菌中表達，其表達產物對三齡致倦庫蚊具有相當毒力。本發明的意義在于從野生的Bt菌株S2096-2中分離克隆了殺蟲晶體蛋白基因Cry40Da，轉化到大腸桿菌表達，表明CrylAc22蛋白對庫蚊雙翅目昆蟲有相當的殺蟲活性，菌株BtS2096-2的Cry40Dal基因克隆為構建殺蚊工程菌提供一種候選基因。
發明內容本發明的主要內容是分離和克隆了一種對蚊子等雙翅目昆蟲有高效殺蟲活性的蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白模式基因cry40Dal，重組工程菌的構建，在宿主細胞(工程菌)中的誘導表達，目標蛋白的分離純化及其在生物防治領域的應用。本發明提供了一種蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白基因cry40Dal，具有如下所示的核苷酸序列a)如SQENO:1所示的核苷酸序列；b)與SQENO1所示的核苷酸序列具有兼并性的核苷酸序列；c)與SQENO1所示的核苷酸序列有90%以上同源性的核苷酸序列。本發明還提供一種含有所述基因Cry40Dal的載體。本發明還提供一種含有所述基因Cry40Dal的宿主細胞。本發明還提供一種含有所述宿主細胞的工程菌株HIC40。進一步，本發明提供一種由SEQNO1所示的核苷酸序列編碼的蛋白。本發明還提供一種如上所述的蛋白，其氨基酸序列如SQENO2所示。本發明還提供一種制備如上所述的基因Cry40Dal的方法。本發明還提供一種制備如上所述的宿主細胞的方法。本發明還提供一種制備如上所述的工程菌株的方法。進一步，本發明提供一種如上所述的基因cry40Dal的用途，對蚊子(Culexquinquefasciatus等雙翅目昆蟲有高效殺蟲活性用。本次發明所述cry40Dal所編碼的殺蟲活性蛋白對雙翅目害蟲有很強的毒殺活性，可以制成各種生物殺蟲劑，用于防治可能傳播人畜疾病的蚊子等昆蟲，減少化學農藥的使用和保護環境，對人畜無害，具有廣闊的應用前景。圖1菌株S2096-2殺蟲晶體蛋白掃描電鏡圖2菌株S2096-2的殺蟲基因PCR鑒定擴增產物電泳其中M為DNALoadingMarker(250bp,500bp,750bp,IOOObp,1500bp,2000bp,3200bp)，1為引物up40-5/up40-5擴增0.9kb的PCR產物。圖3:PCR片段RFLP分析M為DNALoadingMarker(300bp，400bp，500bp，600bp，700bp，800bp，1000bp)，1為引物up40-5/up40-5在菌株S2096-2中擴增產物BglII和DraI酶切電泳帶型。圖4:cry40Da基因全序列PCR擴增M為DNALoadingMarker(250bp,500bp,750bp,IOOObp,1500bp,2000bp,3200bp),1為引物EP40-5/EP40-3在菌株S2096-2中擴增產物BglII和DraI酶切電泳帶型。圖5:cry40Da基因全序列PCR擴增M為DNALoadingMarker(250bp,500bp,750bp,IOOObp,1500bp,2000bp,3200bp),1為引物EP40-5/EP40-3在菌株S2096-2中擴增產物BglII和DraI酶切電泳帶圖6菌株S2096-2分泌蛋白SDS-PAGE分析M為蛋白質分子量標準(200kDa,120kDa,80kDa60kDa，40kDa)2為菌株S2096-2表達75kDa的毒素蛋白，1毒素為在胰蛋白作用下酶解成50kDa毒素核心片段。3為菌株蛋白在Na2C03(pHll)溶液溶解具體實施例方式本發明的技術方案是，首先通過PCR-RFLP鑒定菌株S2096-2含有cry40基因，通過反向PCR方法獲得全基因序列。將crylAc22基因采用基因重組技術克隆到pQE30原核表達載體上，以構建重組質粒，獲得一種工程菌HIC40，用IPTG誘導表達出融合蛋白，利用工程菌或純化的表達蛋白，對雙翅目昆蟲致倦庫蚊幼蟲(Culexpipiens)具有高活力毒殺作用。具體技術方法如下1，菌株S2096-2中cry基因PCR-RFLP分析從GenBank下載已經克隆的cry40基因進行多重序列比對，尋找基因保守區域，然后在保守區域設計鑒定通用引物up40-5/up40-3，根據擴增片段，選擇BglIIandDraI酶切，達到鑒定分析Bt菌株的基因型。總DNA提取參照(BourgouinC.TransferofthetoxinproteingenesofBacillussphaericusintoBacillusthuringiensissubsp.IsraelensisandtheirexpressionEJ].ApplEnvironMicrobiol.1990,56340~3),L^i,總DNA為模板，用cry40基因鑒定的通用引物up40-5/up40-3擴增約900bp左右片段，純化PCR片段用現在內切酶消化PCR產物，酶切帶型判斷菌株S2096-2可能含有含有新型cry40類基因(如圖2、3所示)。瓊脂糖膠回收純化后(膠回收試劑盒購自北京天根公司)，與克隆載體pMD18TVector(購自于大連Takara公司)連接，亞克隆測序。BLAST分析表明克隆片段為新型cry40基因部分序列。up40-5引物序列TGGAATCTTCATCGAATAACACup40_3引物序列CGTGTTCCATTAGCTTCTAAC2，菌株S2096-2中cry40Da基因克隆克隆的PCR通過序列比發現他和cry40Aa和cry40Ba基因序列有較高同源性，而且cry40Aa和cry40Ba編碼序列兩側序列有較高保守性，于是根據cry40Aa和cry40Ba保守序列設計對引物F40-5/F40-3用來擴增cry40Da完整編碼框序列，獲得了約2.Okb的目的片段(如圖4所示)，用限制內切酶BglII和DraI消化PCR片段片段不同于cry40Aa和Cry40Ba(如圖5所示)。瓊脂糖膠回收純化后(膠回收試劑盒購自北京天根公司)，與克隆載體pMD18TVector(購自于大連Takara公司)連接，亞克隆測序，獲得cry40Da基因完整編碼蛋白序列，如SEQNOl所示，編碼659個氨基酸的毒蛋白質，如SEQN02所示。F40-5引物序列ATACGAGGAGTGAAATAGATGF40-3引物序列CACTTGTAAACATCGGACT3，基因cry40Da在大腸桿菌中表達根據編碼序列設計表達引物EP40-5/EP40-3，并在分別在正向和反向引物N端加上BamHI和Sail酶切位點，質粒為模板擴增出1.977kb片段，純化后與pMD18TVector載體連接，轉入大腸桿菌JM110，Amp抗生素培養基選擇，篩選正確克隆子，提取質粒，用BamHI和SalI完全消化，回收純化1.977kp的基因目的帶，同時用BamHI和SalI消化載體PQE30(購自QIAGEN公司)，基因目的產物和載體連接，轉入大腸桿菌宿主M15，氨芐青霉素和卡那霉素抗生素選擇正確的重組子HI40Da，然后用含有涂布于含lOOug/ml氨芐青霉素和25ug/ml卡那霉素的LB液體培養基中37度120rpm培養1_2個小時至OD值到0.4至0.6之間后加入IPTG至終濃度為0.5mM,37度120rpm誘導20小時。誘導培養的菌液超聲波破碎3次，每次用0.5M的NaCl洗滌，獲得cry40Da基因表達的粗蛋白，7.5%SDS聚丙烯酰胺變性膠檢測到75kDa蛋白帶。EP40-5引物序列CGGGATCCATGAATTCATATCAAAATACAAATGGBamHIEP40-3引物序列:ACGCGTCGACTGTTAAACAGCGATACCTCGACSail4，Cry40Da蛋白活性測定誘導表達500mL工程菌株HI40Da，收集表達的蛋白，重新用30ml無菌水重新懸浮中，滴加ImlTritonX100，800W功率超聲波破碎細胞5min。，棄上清，然后用40ml0.5M的NaCl充分懸浮，相同功率超聲波破碎lmin，12000r/min離心lOmin。反復用0.5M的NaCl洗滌3次。最后用懸浮于20ml冰冷的無菌水中，制備成生側粗蛋白樣品。利用標準的BSA蛋白標定蛋白濃度，然后將粗蛋白取菌液稀釋成六個不同濃度梯度被測液200mL，測定Cry40Da蛋白對三齡致倦庫蚊(Culexpipiens)幼蟲殺蟲活性。通過毒力回歸分析得出Cry40Da蛋白對三齡致倦庫蚊幼蟲活性。實施例實施例1菌株S2096-2的基因型分析1)總DNA提取Bt單菌落接種于7mL的LB液體培養基中，30°C，220rpm培養過夜，1%轉接于盛有50mL的LB培養基的250mL體積的三角瓶中，30°C，220rpm繼續培養4小時至0D600=1.O2.O；離心收集IOmL菌體，2mLJBuffer(0.IMTrisHCl(pH8·0)、0·IMEDTA(ρΗ8.0)、0.15ΜNacl)洗滌沉淀；將沉淀輕懸于2mLJBuffer中加入80uL新鮮配制的溶菌酶(50mg/mL)，混勻，37°C溫育45min；再加入15uLRNase(10mg/mL)，50°C作用15min；接著加入200μL505(20%)，701處理201^11；緩慢冷卻至37°C，用等體積酚氯仿異戊醇(25241)及氯仿異戊醇(241)各抽提一次，再加入等體積異戊醇混勻置-20°C沉淀上清20min，12，OOOrmp離心lOmin。70%乙醇洗滌沉淀2次，風干后溶IOOuLTEBuffer(IOmMTrisHCl(pH8.0)、ImMEDTA(pH8.0))中，取5uLDNA樣品在0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外分析儀檢測。2)PCR-RFLP鑒定菌株Cry基因50uLPCR反應體系，包括提取的總DNAluL為模板，各上下游引物分別為0.2uM，加入dNTP(dATP、dCTP、dTTP、dGTP混合物)至濃度250uM，5uL的IOXPCRbuffer(200mMTris-HCl(pH8.3),500mMKCl,15or20mMMgCl2,0.01%(w/v)gelatin)0.5UTaq酶，補雙蒸水至50uL。反應按如下程序進入循環前94°C預變性5min。然后進入30個循環反應，每個循環為94°C變性Imin；50°C退火Imin；72°C延伸2min。最后在72°C延伸IOmin。擴增反應結束后，取PCR產物5μ1，在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測擴增PCR片段約為900bp情況。然后利用GelExtractionMiniKit純化PCR產物，分別用BglIIandDraI雙酶切消化引物up40-5/up40-3擴增產物，在2%的瓊脂糖膠分析PCR產物酶切的帶型。確定酶切帶型和現已經克隆的cry40Aa和cry40Ba基因同樣的酶切帶型完全不同，初步確定為新型cry40基因。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例2cry40Dal基因克隆1)菌株S2096-2質粒DNA提取離心收集IOmL菌體。每IOmL菌液加150uLSI(10%蔗糖，50mMTris.Cl(ρΗ8·0)，20mMEDTA(pH8.0)Lysozyme20mg/ml，用時現配)，混勻，37°C水浴3h；加1350uLSII(IOmMTris‘Cl,lmMEDTA，0.085MNaOH，1.I%SDS用時現配)，輕輕混勻，放置lOmin，然后加750uLSIII(5MKAc，用冰乙酸調至pH4.8)，上下倒置離心管輕輕混勻，冰浴4h以上；12，OOOrpm離心lOmin，取上清，加入30RNase(10mg/mL)，45°C作用30min，加入1/10體積3MNaAC和2倍體積無水乙醇，_20°C沉30min。12，OOOrpm離心lOmin，棄上清，沉淀用70%乙醇漂洗。將沉淀在真空干燥器中干燥后用IOOuL超純水溶解。取5uL質粒DNA樣品在0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外分析儀檢測。2)PCR擴增基因全序列質粒為PCR反應模板，總的反應體系為50ul，10XPCRBuffer5uL，dNTP為0.2mmol/LluL，引物Crylrs5/Crylrs3各0.2mmol/L，1單位/ulpfu酶。反應30個循環，94°C變性lmin，53°C退火lmin，72°C延伸2min，30個循環后延伸lOmin，PCR產物取5uL用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外分析儀檢測目的產物2.OkbPCR產物，用NedI完全消化驗證PCR產物是否正確。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3)PCR擴增片段亞克隆與測序PCR產物用鼎國DNAFragmentQuickPurification/RecoverKit回收純化，然后和載體pMD18TEasyVector連接，重組質粒導入到用0.lmol/LCaC12誘導的大腸桿菌JM110感受態細胞中，轉化子在含有Amp(100ug/ml)，5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-gaIactopyranoside(X-Gal)(64ug/ml)禾口isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)(0.2mM)的LB培養基平板，37°C培養過夜，任意挑取白色菌落于LB液體培養基中培養，提取重組菌株的質粒，選擇相應的引物PCR擴增和選擇多克隆位點的合適的限制性內切酶消化，確定含有目的片段的重組質粒，送往北京奧科生物科技有限公司測序。實施例3cry40Da基因在大腸桿菌中表達0.5ng質粒為模板，表達引物EP40-5/EP40-3各為0.2uM，加入dNTP(dATP、dCTP、dTTP、dGTP混合物)至濃度250uM，5uL的IOXPCRbuffer(200mMTris-HCl(pH8.3)，500mMKCl,15or20mMMgC12,0.01%(w/v)gelatin)0.5ULATaq酶(東洋紡)，補雙蒸水至50uL。反應按如下程序進入循環前94°C預變性5min。然后進入30個循環反應，每個循環為94°C變性Imin；50°C退火Imin；72°C延伸3min。最后在72°C延伸IOmin。然后利用GelExtractionMiniKit純化的PCR產物，用限制內切酶BamHI和SalI37°C分別消化純化的PCR產物和表達載體pEQ30質粒3h，65°C水浴15min失活，然后將消化產物混合，力口入T4DNA連接酶和Buffer過夜連接。轉入大腸桿菌M15中，挑取重組菌落質粒DNA，BamHI禾口SalI酶切鑒定重組子HIC40為陽性重組子，在LB液體培養基中培養培養至OD=0.5或0.6(600nm)加入IPTG繼續培養4_6個小時至終濃度為lmmol/L誘導表達重組子上的目的基因。實施例4Cry40Da蛋白對雙翅目昆蟲毒性測定粗蛋白取菌液六個不同濃度梯度被測液，將人工飼養的三齡致倦庫蚊(Culexquinquefasciatus)幼蟲放到一定濃度待測液的500ml容積的水杯中，每個水杯放置25頭，重復3次。恒溫25°C，光照周期12:12，相對濕度65%環境，96h后，仔細觀察剩下的活蚊數，就可以進行濃度_死蚊數/率的線性回歸擬合了。利用spss軟件進行毒力回歸分析。得出Cry40Dal蛋白對三齡致倦庫蚊毒力LC50為0.01ug/ml，較陽性對照Cry4Ba蛋白活性(LC50:134ug/ml)高達13400倍。序列表SEQUENCELISTING<110>海南海德熱帶農業資源研究所有限公司<120>對蚊子等雙翅目昆蟲有殺蟲活性的Btcry40Dal基因及其應用<130><160>1<170>PatentInversion3.1<210>1<211>3534<212>DNA<213>蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)<220><221>gene<222>(1)..(1977)<223><400>11ATGAATTCATATCAAAATACAAATGGATATGAAATATTGGAATCTTCATCGAATAATACA61AATACGCCAAACAGATATCCTTTTGCAAATGATCCAAATATTTTTCCTATTATCCTGAAC121GATTGTCCGGGAAAACCATGGCAAGATACGTGGAAATCAATCTCGAATTTCATAAGTGTT181ATGGTAAGCATGGCAGGATTCATAAGCTCACCTGGTGTACTAATTGGAATTCCTGCACTA241TTGGGAATAGTAAACCTACTAATTCCATCTTCTGGTCCATCTGTGGCAGCACTTTCTATA301TGTGATTTATTATCTATAATTCGTAAAGAGGTAGACGAGAGTGTTTTAAATGACGCGGTT361GCAGATTTTAACGGTAAATTGACTAATTATAAAGAGTATTATCTTTCTTCTCTTCAGGAG421TGGCTTAGTGCAGGTAAACCAAATGATAGCAGACTTAGTAATGTGGTTGAGTATTTCAAA481AAGTCTGAAGAAGGTTTCAATGAAATTCTAGCAGGGTCATTATCAAGGCAGAATGCTCAA541ATATTATTATTGCCTACGTTTGCGCAAGCTGCAAATGTACAGTTATTACTATTAAGGGAT601GCCGTTCAATATAAAAAAGAATGGGGAGCATTGTTGAGTGCGGAGAAAGTAGGATCGGAA661TTAATATCACCTACTATTGATTATGGTCAGCGATTAAAAGATAAAATAGCACAGTATGCC721AAGTATTGTGTATTTTGGTATCAGGAGGGTTTAAATCAGATAAAAGAGGAGGGGGCAGGT781ACTACAACTTGGTTGAAATTTAATAAATTTCGTAGAGAAATGACGTTGGCGGTATTGGAT841ATTATCGCTCTATTTCCAATTTATGATTTTGAAAAATATCCATTAGGAACAAATGTAGAG901TTAACTAGGGAAATTTATACAGACCCAGTGGGATATTCACGGGGAAATTATCGTTGGGAA961GGGCTTTTTAGCTTTAATTCGCTAGAAGCTAATGGAACACGGGGACCTGGTTTAGTTACT1021TGGCTTCAAGCTATAGATATATATAGTCATCCTGTTTTTACTCAACCTGGTTATCTTATC1081GGCTGGGGAGGAACTCGTCATTATGAAGACTACACAAAGGGTAACGGTGCTTTTCAACGT1141ATGTCTGGAACTACGAGTAATGATCCACATTCTATTAGTTTCGGCAATACTGATATATTT1201AAAATTAGTTCATTAGCTAGAGTTGAATTGCAACCATTTGTTGGGTATTCAATCCCACGG1261TATCGTACTTCACGTGCAGAATTTTTTCCGACAACACTAAATACTTTACTATATGAGAGA1321AACAGTTCTGGGTACTCACAGACAATTGAATCTGTGTTACCAGGTATTGATAAGGATCTA1381CCACCTAGTGCTAGAAATTACTCTCATAGATTATCAAATGCGGCATGTGTTCAATATGAA1441ACCTCCGTAGTTAACGTATTTGGTTGGACACATACAAGTATGACAAGAAATAATCCAATT1501TATCCAGATAAAATTACACAAATACCGGCTGTGAAAGCTTTTGCTTTAGAAAACGGCGCT1561TATGTTAGCGCTGGACCTGGTGATACAGGGGGAGATGTAGTAACGTTACCATATCTTGGG1621CGTTTGAAAATACGTTTAACTCCTGCACCCACGAATAAAAATTACCGAGTTAGAATCCGC1681TATGCAACTTCTTATGGCGCTAGTTTAATGGTACAAAGATGGTCACCGAGTGGTTCTGAG1741AGTGACTATTTTGGTTCTTCACCTACGGGTCCTTATCCTACATTCGGATATATGAATACC1801TTAGTTACTACATTTAATCAATCAGGTGTTGAAATAATTATAGAAAATCGACATTATAGC1861AATATTATCATTGACAAAATTGAATTTTTACCGGATGATTTAACAACTTTAGAATCTGAA1921GGAGAACGGAATTTAGAAAAAACAAAGAAAGCGGTGAACGATTTATTTATCAATTAA<110>海南海德熱帶農業資源研究所有限公司<120>對蚊子等雙翅目昆蟲有殺蟲活性的Btcry40Dal基因及其應用<130><160>1<170>PatentInversion3.1<210>1<211>1178<212>氨基酸<213>蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)<220><221>protein<222>(1)..(426)<223><400>11MNSYQNTNGYEILESSSNNTNTPNRYPFANDPNIFPIILNDCPGKPffQDTWKSISNFISV61MVSMAGFISSPGVLIGIPALLGIVNLLIPSSGPSVAALSICDLLSIIRKEVDESVLNDAV121ADFNGKLTNYKEYYLSSLQEWLSAGKPNDSRLSNVVEYFKKSEEGFNEILAGSLSRQNAQ181ILLLPTFAQAANVQLLLLRDAVQYKKEffGALLSAEKVGSELISPTIDYGQRLKDKIAQYA24IKYCVFffYQEGLNQIKEEGAGTTTffLKFNKFRREMTLAVLDIIALFPIYDFEKYPLGTNVE301LTREIYTDPVGYSRGNYRffEGLFSFNSLEANGTRGPGLVTWLQAIDIYSHPVFTQPGYLI36IGffGGTRHYEDYTKGNGAFQRMSGTTSNDPHSISFGNTDIFKISSLARVELQPFVGYSIPR421YRTSRAEFFPTTLNTLLYERNSSGYSQTIESVLPGIDKDLPPSARNYSHRLSNAACVQYE48ITSVVNVFGffTHTSMTRNNPIYPDKITQIPAVKAFALENGAYVSAGPGDTGGDVVTLPYLG541RLKIRLTPAPTNKNYRVRIRYATSYGASLMVQRffSPSGSESDYFGSSPTGPYPTFGYMNT601LVTTFNQSGVEIIIENRHYSNIIIDKIEFLPDDLTTLESEGERNLEKTKKAVNDLFIN權利要求一種蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白基因cry40Da1，具有如下所示序列a)如SQENO1所示的核苷酸序列；b)與SQENO1所示的核苷酸序列具有兼并性的核苷酸序列；c)與SQENO1所示的核苷酸序列有90％以上同源性的核苷酸序列。2.一種含有權利要求1所述的基因cry40Dal的載體。3.一種含有權利要求1所述的基因cry40Dal的宿主細胞。4.一種含有權利要求3所述的宿主細胞，它是工程菌株HIC40。5.一種由編碼cry40DalgSQENOl所示的核苷酸序列的蛋白。6.一種如權利要求5所述的蛋白其氨基酸序列如SQEN0:2所示。7.一種制備權利要求1所述的基因cry40Dal的方法。8.一種制備權利要求1所述的基因cry40Dal的宿主細胞的方法。9.一種制備權利要求1所述的基因cry40Dal的工程菌株的方法。10.一種如權利要求1所述的基因cry40Dal的用途，對雙翅目昆蟲有高效殺蟲活性。全文摘要本發明公開了一種從蘇云金桿芽胞桿菌野生菌株S2096-2中分離克隆的殺蟲晶體蛋白基因cry40Da1，及其對蚊子等雙翅目昆蟲有殺蟲活性和應用。本發明采用反向PCR克隆法從菌株S2096-2中克隆了cry40Da全長基因，該基因的開放閱讀框(ORF)為1977bp，編碼由659個氨基酸組成的蛋白質，被國際Bt殺蟲晶體蛋白基因命名委員會命名為cry40Da1，GenBank登錄序號為EU596478。利用工程菌以及提取的表達蛋白，對致倦庫蚊(Culexquinquefasciatus)等雙翅目昆蟲表現出高效的殺蟲活性。文檔編號C12N15/32GK101824419SQ20091011999公開日2010年9月8日申請日期2009年3月3日優先權日2009年3月3日發明者張文飛,方宣鈞,謝柳申請人:海南海德熱帶農業資源研究所有限公司