專利名稱：一種生產不同分子量普魯蘭糖的方法
技術領域：
本發明涉及微生物法發酵生產普魯蘭糖的生產方法。
背景技術：
普魯蘭糖(Pullulan)由出芽短梗霉分泌的一種易溶于水的微生物多糖，1939年 R-Baner首先在出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)的發酵液中發現一種黏性物 質，即普魯蘭糖。1959年Bender等首先表征了出芽短梗霉發酵產生的普魯蘭糖是由中性 葡萄糖組成，它是葡萄糖按α-1，4-糖苷鍵結合成麥芽三糖，兩端再以α-1，6_糖苷鍵反復 連接而成高分子多糖，是一種易溶于水 、安全無毒害、可食用、低熱值的天然多糖，因其可塑 性、成膜性好、簿膜隔氣性佳，故常用其作為保色、保香、保鮮、抗氧化等的包裝材料。在醫 藥、食品、化妝品、農藥等行業具有廣泛的用途。因其在自然界可被微生物降解利用，不會引 起環境污染，故被譽為無公害塑料。普魯蘭糖的生產及應用已經有30多年的研究歷史，日本林原公司在70年代進行 中試規模工業化生產，至今一直壟斷國際市場。國內經過20年研究也有較大進展，但仍存 在較多問題，如色素水平高、底物糖轉化率低、發酵時間長等問題，還有一個突出的問題就 是得到的普魯蘭多糖分子量較低或分子量范圍較廣，而普魯蘭糖的應用與其分子量存在直 接聯系，這就導致普魯蘭糖附加值降低。本發明通過控制發酵培養基氮源組成及攪拌速度，可以得到預期分子量的普魯蘭 糖產品，同時無黑色素產生，提高了普魯蘭糖的收率及附加值。
發明內容
(1)種子培養基及種子液制備a.種子培養基組成為蔗糖5% ；酵母膏0. 2% ； NaClO. l%;MgS04 ·7Η20 0. 02%;Κ2ΗΡ04 ·3Η20 0· 63% ; (NH4) 2S040. 06%，初始 ρΗ 6.5。115°C 滅菌20分鐘；b.種子液制備將步驟(1)中所得出芽短梗霉突變菌株接種到裝有1/5種子 培養基的500mL三角瓶中，培養溫度28 士 1 °C，搖床轉速250r/min，培養24 36h，種子濃度 0.8 2. 5X IO8個/mL，作為一級種子，將一級種子按2% 10%接種量接入種子培養基， 逐級擴大至適合相應接種量，作為發酵種子液。(2)發酵生產普魯蘭多糖的基本培養基為碳源10% ；酵母膏0. 2% ；NaCl 0. 1%； MgSO4 · 7H20 0. 02% ；K2HPO4 · 3H20 0. 63% ； (MM)2SO4O. 06%，初始 pH 6. 5。其中碳源包括 蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、DE值為30 70的淀粉水解液等。按欲得普魯蘭糖分子量的不同，調 節發酵培養基中的氮源組成，其中酵母膏調節范圍為0. 2.0%，(MM)2SO4調節范圍為 0.02% 0. 1%，酵母膏含量越高則得到的普魯蘭多糖分子量越低，(MM)2SO4含量越高則 普魯蘭多糖分子量越高，在其調節范圍內適當組合酵母膏及(NH4) 2S04,培養溫度28士 1 °C， 罐壓0.01 0. 05Mpa。發酵前24h，攪拌速度為150 250r/min，24 48h攪拌速度為 300 400r/min，48h后攪拌速度為100 200r/min。發酵時間為60 72h。(3)發酵液經除菌、濃縮后噴霧干燥得到普魯蘭糖產品。
具體實施方法實施例一種子培養基蔗糖5%;酵母膏 0. 2% ；NaCl 0. 1 % ；MgSO4 · 7H20 0. 02 % ； K2HPO4 · 3Η200· 63% ； (MM)2SO4O. 06%，初始 ρΗ 6. 5。115°C滅菌 20min。發酵生產所用培 養基為蔗糖10% ；酵母膏0.6% ;NaCl 0. 1 % ；MgSO4 · 7H20 0. 02% ；K2HPO4 · 3H20 0. 63% ； (MM)2SO4O. 05%，初始 ρΗ 6. 5。115°C滅菌 20min。種子液培養將中所得出芽短梗霉突變菌株接種到裝有1/5種子培養基的500mL 三角瓶中，培養溫度28士 1°C，搖床轉速250r/min，培養24h，種子濃度2. OX IO8個/mL，作 為一級種子，將一級種子按2%接種量將菌種接入裝有1/5種子培養基的500mL三角瓶中， 培養溫度28士 1°C，搖床轉速250r/min，培養24h作為二級種子液。按2%接種量將二級種 子液接入含有20L種子培養基的30L發酵罐中，培養溫度28 士 1 °C，罐壓0. 03Mpa,攪拌速度 180r/min,通氣量lL/min，培養24h，作為三級種子。lm3發酵罐發酵按2%接種量將種子液接入含有700L發酵培養基的Im3發酵罐 中，培養溫度28 士 1 °C，罐壓0. 03Mpa,通氣量為3L/min。發酵前24min，攪拌速度180r/min， 24 48min調攪拌速度到400r/min。48min以后，攪拌速度調為150r/min，繼續發酵12min， 發酵結束，普魯蘭糖分子量為糖轉化率為67%，平均分子量為8萬道爾頓。實施例二 種子培養基蔗糖5%;酵母膏 0. 2% ；NaCl 0. 1 % ；MgSO4 · 7H20 0. 02 % ； K2HPO4 · 3Η200· 63% ； (MM)2SO4O. 06%，初始 ρΗ 6. 5。115°C滅菌 20min。發酵生產所用培養基為DE值55的玉米淀粉水解液10% ；酵母膏1.0% ；NaCl 0. 1% ；MgSO4 · 7H20 0. 02% ；K2HPO4 · 3H20 0. 63% ； (MM)2SO4O. 02%，初始 ρΗ 6. 5。115°C滅 菌 20min。種子液培養將中所得出芽短梗霉突變菌株接種到裝有1/5種子培養基的500mL 三角瓶中，培養溫度28士 1°C，搖床轉速250r/min，培養24h，種子濃度2. OX IO8個/mL，作 為一級種子，將一級種子按2%接種量將菌種接入裝有1/5種子培養基的500mL三角瓶中， 培養溫度28士 1°C，搖床轉速250r/min，培養24h作為二級種子液。按2%接種量將二級種 子液接入含有20L種子培養基的30L發酵罐中，培養溫度28 士 1 °C，罐壓0. 03Mpa,攪拌速度 180r/min，通氣量lL/min，培養24h，作為三級種子。Im3發酵罐發酵按2%接種量將種子液接入含有700L發酵培養基的Im3發酵罐 中，培養溫度28 士 1°C，罐壓0.03Mpa，通氣量為3L/min。發酵前24h，攪拌速度180r/min， 24 48h調攪拌速度到400r/min。48h以后，攪拌速度調為150r/min，繼續發酵12h，發酵 結束，普魯蘭多糖分子量為糖轉化率為67%，平均分子量為40萬道爾頓。實施例三種子培養基蔗糖5%;酵母膏 0.1% ；NaCl 0. 1 % ；MgSO4 · 7H20 0. 02 % ； K2HPO4 · 3Η200· 63% ； (MM)2SO4O. 08%，初始 ρΗ 6. 5。115°C滅菌 20min。發酵生產所用培養基為蔗糖10% ；酵母膏0.5% ;NaCl 0. 1 % ；MgSO4 · 7H20 0. 02% ；K2HPO4 · 3H20 0. 63% ； (MM)2SO4O. 08%，初始 ρΗ 6. 5。115°C滅菌 20min。種子液培養將中所得出芽短梗霉突變菌株接種到裝有1/5種子培養基的500mL 三角瓶中，培養溫度28士 1°C，搖床轉速250r/min，培養24h，種子濃度2. OX IO8個/mL，作為一級種子，將一級種子按2%接種量將菌種接入裝有1/5種子培養基的500mL三角瓶中， 培養溫度28士 1°C，搖床轉速250r/min，培養24h作為二級種子液。按2%接種量將二級種 子液接入含有20L種子培養基的30L發酵罐中，培養溫度28 士 1 °C，罐壓0. 03Mpa,攪拌速度 180r/min,通氣量lL/min，培養24h，作為三級種子。 Im3發酵罐 發酵按2%接種量將種子液接入含有700L發酵培養基的Im3發酵罐 中，培養溫度28 士 1°C，罐壓0.03Mpa，通氣量為3L/min。發酵前24h，攪拌速度180r/min， 24 48h調攪拌速度到400r/min。48h以后，攪拌速度調為150r/min，繼續發酵12h，發酵 結束，普魯蘭糖分子量為糖轉化率為67%，平均分子量為18萬道爾頓。
權利要求
一種生產不同分子量普魯蘭糖的方法，由以下步驟組成(1)按2％～10％接種量將出芽短梗霉菌種接到種子培養基中培養，得到種子液；(2)按2％～10％接種量將上述種子液接到發酵培養基中培養，得到發酵液；(3)上述發酵液經下游處理得到普魯蘭糖；其特征在于通過控制發酵培養基的氮源組成，制得不同分子量的普魯蘭糖。
2.權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中的種子培養基的組成為蔗糖5%、 酵母膏 0. 2%, NaCl 0. 1 %, MgS04 7H20 0. 02%, K2HP04 3H20 0. 63%, (NH4)2S040 . 06%, 其余為水；初始pH 6. 5 ；培養溫度28 士 1°C ；搖床攪拌速度250r/min。
3.權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中的發酵培養基的組成為碳源、酵 母膏、NaCl、MgS04 7H20、K2HP04 3H20、(NH4)2S040. 06%、其余為水；初始 pH 6. 5 ；其中碳源 包括蔗糖、葡萄糖、麥芽糖和/或DE值為30 70的淀粉水解液；酵母膏在發酵培養基中 的含量為0. 2.0%，(NH4)2S04在發酵培養基中的含量為0.02% 0. ；培養溫度 28 士 1°C，發酵 60 72h。
4.權利要求3所述的方法，其特征在于發酵培養基的組成為碳源10%、酵母膏 0. 2%,NaCl 0. l%,MgS04 '7H20 0. 02%、K2HP04 3H20 0. 63%、(NH4)2S040 . 06%、其余為水。
5.權利要求1所述的方法，其特征在于通過調節發酵培養基中酵母膏和(NH4)2S04 的含量，制得不同分子量的普魯蘭糖；酵母膏含量越高則得到的普魯蘭糖分子量越低， (NH4)2S04含量越高則普魯蘭糖分子量越高。
6.權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)的培養溫度28士1°C，罐壓0.01 0. 05Mpa ；發酵前24h，攪拌速度為150 250r/min，24 48h攪拌速度為300 400r/min， 48h后攪拌速度為100 200r/min。發酵時間為60 72h。
7.權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中所述的下游處理包括除菌、濃縮和 干燥。
全文摘要
本發明涉及普魯蘭糖的發酵生產，通過控制發酵培養基的組成及發酵參數得到不同分子量的普魯蘭糖產品。生產不同分子量普魯蘭糖的方法包括以下步驟(1)種子及發酵培養基的制備；(2)將活化后菌種按2％～10％接種量將菌種接到種子培養基，28±1℃培養24～36h，種子濃度0.8～2.5×108個/mL；(3)按2％～10％接種量將種子液接到發酵培養基，罐壓0.01～0.05Mpa，溫度28±1℃，發酵60～72h；(4)發酵液經除菌、濃縮后噴霧干燥得到普魯蘭糖產品。
文檔編號C12P19/10GK101942492SQ20091014876
公開日2011年1月12日 申請日期2009年7月3日 優先權日2009年7月3日
發明者候重文, 凌沛學, 劉飛, 張曉元, 朱希強, 李海軍, 李霞, 相茂功, 蘇移山, 郭學平, 陳勉, 顏震 申請人:山東省生物藥物研究院