抗hcv藥物篩選方法

專利名稱：：抗hcv藥物篩選方法
技術領域：
：本發明屬于抗病毒藥物篩選領域，具體地，涉及在2a型嵌合病毒J6/JFHl感染Huh7.5.1細胞產生有感染性的病毒顆粒這一HCV細胞培養體系(HCVcellculture，HCVcc)基礎上，以干擾素和利巴韋林為陽性對照，建立抗HCV藥物的MTT細胞毒性檢測及體外抗HCV藥效評價方法。
背景技術：
：Chiron在長期大量的研究后，1989年將輸血后非A非B型肝炎定義為丙型肝炎(h印atitisC)，并分離和確認其病原體為丙型肝炎病毒(HCV)。丙型肝炎病毒(HCV)屬于黃病毒科，肝炎病毒屬，為有包膜的單股正鏈RNA病毒，全長約9.6kb。在過去的20年中，在世界范圍內，約有1.7億人感染HCV。感染HCV的約80%的病例特點是持久性和慢性肝病疾病，20%慢性丙型肝炎患者最終發展成為肝硬化和肝癌。在工業化國家，丙型肝炎病毒相關的終末期肝病現在主要采取肝移植方法。在臨床治療中，干擾素(interferon,IFN)起到了重要的作用，1990年開始用單劑IFN進行慢性丙型肝炎治療，在10%的病人中產生持續病毒學應答(sustainedvirologicresponse，SVR)。而經過近年用聚乙二醇(PEG)改良的聚乙二醇干擾素(PEG-IFN)與利巴韋林(ribavirin)聯合治療，病毒學持續應答提高到50%，但是治療效果仍不理想，利巴韋林在紅血球中積累，會伴有溶血性貧血等不良反應，并且1型HCV感染患者SVR率仍然偏低。因此，發展新的高效的治療具有重大意義。在干擾素治療發展的同時，最引人注目的研究是在基礎研究上建立的支持自主HCVRNA復制的細胞培養系統的發展。1999年，Lohman等人首次報道建立了能在Huh7中自主復制的亞基因組HCVRNA復制子系統，這個復制子系統的不僅應用于針對結構蛋白作為藥物靶點的的篩選，同樣還用于研究HCVRNA的復制機理。在此基礎上，一些學者使用不同的HCV病毒株(H，N，Conl和0)建立了全基因組長度的HCVRNA復制系統。這些復制子系統促進了HCV的研究及抗HCV藥物的篩選，但是其不能產生完全的病毒顆粒，所以存在缺陷。在泡疹性口炎病毒(Vesicularstomatitisvirus,VSV)、HIV或鼠白血病病毒(mouseleukemiavirus,MLV)的基礎上與HCVEl和E2蛋白嵌合得到的病毒假病毒系統(HCVpseudotyp印articles，HCV卯)，廣泛應用于篩選以包膜蛋白為耙點的抗HCV化合物和免疫研究。但是由于HCVpp本身的結構和來源，HCVpp只能用于HCV感染性的研究而無法研究HCV的復制。復制子系統發展成為一個研究HCV復制和抗病毒藥物篩選的重要工具，但是在藥物篩選過程有局限性，所以2005年細胞培養系統的出現，無疑是一項突破性的進展。這是從一名爆發性丙型肝炎患者體內分離得到的2a型病毒株JFH1株，不需要適應性突變就能進行自主復制，并感染Huh7人肝癌細胞后，其RNA能在細胞中復制，重組病毒顆粒能分泌至培養液中，且分泌的病毒顆粒對Huh7細胞和黑猩猩具有感染性。其后Brett等人利用J6病毒株的結構蛋白區與JFH1株的非結構蛋白區嵌合產生的病毒J6/JFH1感染由Huh7.5衍生而來的對HCV更易感的Huh7.5.1的體系，對抗HCV藥物進行了藥效評價。HCV細胞培3養體系的建立是近年來HCV研究中的重大突破，是今后了解HCV完整增殖周期、研究抗HCV治療方法和開發丙型肝炎疫苗的強有力技術平臺。迄今，現有技術中未見有在2a型嵌合病毒J6/JFH1感染Huh7.5.1細胞產生有感染性的病毒顆粒這一HCV細胞培養體系(HCVcellculture,HCVcc)基礎上，以干擾素和利巴韋林為陽性對照，建立抗HCV藥物的MTT細胞毒性檢測及體外抗HCV藥效評價方法。
發明內容本發明目的是提供在2a型嵌合病毒J6/JFH1感染Huh7.5.1細胞產生有感染性的病毒顆粒這一HCV細胞培養體系(HCVcellculture,HCVcc)基礎上，以干擾素和利巴韋林為陽性對照，建立抗HCV藥物的MTT細胞毒性檢測及體外抗HCV藥效評價方法。利用HCV細胞培養系統對抗HCV藥物進行TMTT法細胞毒性檢測及體外抗HCV藥效評價。本發明的上述目的是通過下面的技術方案得以實現的抗HCV藥物篩選方法，包括下述步驟(1)細胞生長曲線制作，確定最適Huh7.5.1細胞濃度；(2)確定最適感染復數MOI;(3)以IFNE及RBV為陽性對照，建立HCV藥物篩選方法(3-1)最佳干擾素(IFN)和利巴韋林(RBV)給藥方式選擇；(3-2)MTT法檢測IFNE及RBV細胞毒性，通過細胞生長抑制率，以Gr即hpadPrism5計算IQ值。(1(:5。半數抑制濃度，將細胞生長抑制50%所需的濃度)；(3-3)HCVPCR熒光定量法檢測RNA載量，通過IFN、RBV對HCV復制抑制率，以GraphpadPrism5計算ECs。值。(EC50:半數效應濃度，引起受試對象50%個體產生一種特定效應的藥物劑量)(3-4)IFN、RBV抗HCV藥效評價，以藥物對細胞毒性IC5。和半數致死濃度EC5。，通過計算兩者比值得到該藥物的治療指數TI。用MTT法測定細胞生長曲線，確定最佳實驗細胞密度。確定最適感染復數MOI是用病毒基因組載量與細胞數量之比計算最適感染復數MOI。對于體外抗HCV藥物的篩選，主要從兩個方面進行藥物的藥效評價藥物細胞毒性、抗病毒效果。以MTT法檢測藥物對細胞的毒性得到IC5。，HCVT叫man探針的熒光定量PCR檢測方法檢測HCV病毒載量得到EC5。，最后計算TI=IC5。/EC5。，進行抗病毒藥效評價。對抗HCV藥物陽性對照IFN和RBV采用不同給藥方式，以達到藥物抗HCV的最佳效果，得出結論IFN以先預處理細胞18h后加入病毒、RBV和病毒同時加入可達到最佳抗病毒效果。本發明依靠HCV細胞培養系統，利用2a型嵌合病毒株J6/JFH1感染Huh7.5.1產生有感染性的病毒顆粒這一特點上，對藥物進行MTT細胞毒性檢測及抗HCV藥效評價。下面結合附圖，用本發明的實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但并不以此來限定本發明。圖1為Huh7.5.1細胞生長曲線圖；圖2為感染復數確定圖；圖3為利巴韋林細胞毒性圖；圖4為IFNa-lb給藥方式圖；圖5為利巴韋林給藥方式圖；圖6為IFNa-lb抗HCV活性圖;圖7為利巴韋林抗HCV活性圖。具體實施方式實施例1:1、細胞及病毒人肝癌細胞株Huh7.5.1用含15%新生牛血清的DMEM(Dulbecco'smodifiedEagle，smedium,DMEM)于37。C5%0)2培養箱中培養。病毒J6/JFH1由Huh7.5.1細胞培養培養后，保存于-80°C。2、Huh7.5.1細胞生長曲線采用MTT法測定細胞生長曲線。MTT全稱為3-(4，5_二甲基噻唑_2)_2，5_二苯基四氮唑溴鹽，以PBS配制，過濾除菌保存。MTT法是一種檢測細胞存活和生長的方法，但不能測定細胞絕對數。其原理為活細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能夠代謝還原MTT，同時在細胞色素C的作用下，生成藍色(或藍紫色)不溶于水的甲臜(Formazan)，并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。以二甲基亞砜(DMSO)溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。(1)取對數生長期的Huh7.5.1細胞，O.25%胰酶消化，800-1000rpm/mim離心3min，血球計數板計數后，調整細胞濃度為9X10Wls/ml，鋪于96孔板(lOOiU/well)。(2)補加培養基至終體積為200iil/well，將培養板置于37°C5%C02培養，每三天補充50-1001新鮮培養基。設3個重復孔，同時設空白調零組。(3)每天于實驗孔加入20ii15mg/mlMTT溶液，37°C5%C02培養箱孵育4h后，吸棄上清，加入1501DMSO，震蕩溶解10min，用酶標儀測各孔0D49。值。從圖可知從3-7天細胞處于指數生長期，并在第3天細胞占板底約80-90%，為藥物篩選的最佳密度，因此選擇為實驗最佳細胞密度。3、最適感染復數(Multiplicityofinfection,MOI)感染復數為感染病毒與細胞數量的比值，可用病毒顆粒(viralparticles，v.p.)或基因組載量(vectorgenome,v.g.)來表示病毒數量。本發明采用病毒基因組載量與細胞數量之比(v.g.number/cell)計算MOI。(1)取對數生長期的Huh7.5.1細胞，O.25X胰酶消化，800-1000rpm/mim離心3min，血球計數板計數后，調整細胞濃度為5X10、ells/ml，鋪于24孔板(lml/well)于37°C5%C02培養，貼壁5h。(2)加入感染復數分別為0.5、1、1.5的病毒，感染5小時。(3)用PBS(pH7.4)洗去未吸附的病毒，加入新鮮培養基。(4)于ld、3d、5d、7d、9d分別收集上清，以3000rpm/min離心10min，取澄清上清進行HCVPCR熒光定量檢測RNA載量。從圖2得出在三個感染復數中，感染復數為1時病毒感染性載量較高，因此選擇MOIl為最適感染復數。4、以IFN和RBV為陽性對照，建立抗HCV藥物篩選方法利用IFNa-lb與RBV進行陽性對照的選擇，主要對兩種藥物采用MTT法檢測細胞毒性與抗HCV藥效評價，同時為體外抗HCV藥物篩選建立方法。4.1MTT法檢測IFNa-lb及利巴韋林細胞毒性(1)取對數生長期的Huh7.5.1細胞，O.25%胰酶消化，800-1000rpm/mim離心3min，血球計數板計數后，調整細胞濃度為9X10、ells/ml，鋪于96孔板(lOOiU/well)于37°C5%C02培養，貼壁5h。(2)加入用無血清培養基梯度稀釋的藥物，8個稀釋度，每個梯度設三個重復孔，同時設置空白對照(只含培養基)、細胞對照及藥物顏色對照，使培養基至終體積為200iil/well，將培養板置于37°C5%C02培養箱進行培養。(3)第三天于實驗孔加入20ill的5mg/mlMTT溶液，37°C5%C02孵育4小時后，棄去上清，加入150ii1/well的DMSO，振蕩溶解lOmin后，于酶標儀上測定0D49。的值，并計算細胞生長抑制率及藥物IC5。(IC5。半數抑制濃度，將細胞生長抑制50%所需的濃度)的細胞生長抑制率(％)=a-S，，)xioo對照孔OD值4.2IFNa-lb與RBV給藥方式(1)取對數生長期的Huh7.5.1細胞，O.25%胰酶消化，800-1000rpm/mim離心3min，血球計數板計數后，調整細胞濃度為9X10、ells/ml，鋪于96孔板(lOOiU/well)于37°C5%C02培養，貼壁5h。(2)加入用無血清培養基梯度稀釋的藥物，3個稀釋度，每個梯度設三個重復孔。對IFNa-lb和RBV兩種藥各采取三種給藥方式加病毒5h時后加入藥物、病毒和藥物同時加入、藥物預處理18h后加入病毒。同時設正常病毒對照組和細胞對照組，使培養基至終體積為200iil/well，將培養板置于37°C5%C02培養箱進行培養。(3)3d后收集上清3000rpm/min離心10min，取澄清上清進行HCVPCR熒光定量檢測RNA載量。計算HCV復制抑制率，并對三種給藥方式進行比較。i^復制抑制率(％)=(1_，CV腿S)xlO。對照孔HCVRNA載量4.3IFNa-lb與RBV抗HCV藥效評價(1)取對數生長期的Huh7.5.1細胞，O.25%胰酶消化，800-1000rpm/mim離心3min，血球計數板計數后，調整細胞濃度為9X10、ells/ml，鋪于96孔板(lOOiU/well)于37°C5%C02培養，貼壁5h。(2)加入用無血清培養基梯度稀釋的藥物，8個稀釋度，每個梯度設三個重復孔。對IFNa-lb和RBV兩種藥采取選定給藥方式，同時設正常病毒對照組和細胞對照組，使培養基至終體積為200iil/well，將培養板置于37°C5%C02培養箱進行培養。(3)3d后收集上清3000rpm/min離心10min，取澄清上清進行HCVPCR熒光定量檢測RNA載量。計算HCV復制抑制率及EC5。(EC5。半數效應濃度，引起受試對象50%個體產生一種特定效應的藥物劑量)。表1表示IFNa-lb與利巴韋林抗HCV藥效評價數據。表1:IFNa-lb與利巴韋林抗HCV藥效評價<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權利要求抗HCV藥物篩選方法，包括下述步驟(1)細胞生長曲線制作，確定最適Huh7.5.1細胞濃度；(2)確定最適感染復數MOI；(3)以IFNE及RBV為陽性對照，建立HCV藥物篩選方法(3-1)選擇最佳干擾素IFN和利巴韋林RBV給藥方式；(3-2)MTT法檢測IFNE及RBV細胞毒性，通過細胞生長抑制率，以GraphpadPrism5計算IC50值；(3-3)HCVPCR熒光定量法檢測RNA載量，通過IFN、RBV對HCV復制抑制率，以GraphpadPrism5計算EC50值；(3-4)IFN、RBV抗HCV藥效評價，以藥物對細胞毒性IC50和半數致死濃度EC50，通過計算兩者比值得到該藥物的治療指數TI。2.如權利要求1所述的方法，其特征在于用病毒基因組載量與細胞數量之比確定最適感染復數MOI。3.如權利要求1所述的方法，其特征在于用MTT法測定細胞生長曲線。全文摘要本發明提供了一種以干擾素和利巴韋林為陽性對照，利用2a型嵌合病毒J6/JFH1轉染Huh7.5.1細胞產生有感染性的病毒顆粒這一HCV細胞培養體系(HCVcellculture，HCVcc)進行體外抗HCV藥物篩選的方法。該方法包括確定最適Huh7.5.1細胞濃度、最適感染復數以及最佳干擾素和利巴韋林給藥方式；在此基礎上分別計算藥物對細胞毒性(IC50)和半數致死濃度(EC50)，通過計算兩者比值得到該藥物的治療指數(TI)。該方法的建立可以準確、快速、便捷的在體外進行抗HCV藥物的篩選，為我國天然藥物，化學合成藥物等提供了體外抗HCV藥物篩選的良好技術平臺。文檔編號C12Q1/68GK101748219SQ20091016325公開日2010年6月23日申請日期2009年12月29日優先權日2009年12月29日發明者馮悅,劉麗,唐穎蕾,夏雪山,魏大巧申請人:昆明理工大學