一種篩選新型脂肪酸合成抑制劑的方法與流程

本發明屬于藥物篩選領域，特別涉及一種利用產油微生物為模型篩選脂肪酸合成抑制劑的方法。

背景技術：

在體內各組織中，脂肪酸的合成參與細胞增殖、分化和機體能量代謝、脂類代謝等重要生命活動。在脂肪組織，脂質物質的主要合成場所肝臟，以及多種脂質合成密切相關的癌癥如乳腺癌、前列腺癌組織中脂肪酸合成相關酶都高度表達。因此，抑制脂肪酸的合成成為治療肥胖及腫瘤的新靶點。

至今，已批準上市并用于臨床治療肥胖的藥物僅有三種。即5-羥色胺去甲腎上腺素重攝取抑制劑——西布曲明、選擇I型大麻受體拮抗劑——利莫那班和胰脂肪酶抑制劑——奧利司他。這些藥物對肥胖癥有較好的療效，但也會產生一些副作用。因此，為了研究開發出副作用小、安全性高，更符合肥胖患者需求的脂肪酸抑制劑，有必要建立一種高效、快速、簡單的脂肪酸合成抑制劑篩選方法。

目前，篩選脂肪酸合成抑制劑可以使用細胞實驗或動物實驗來完成。但是該手段培養周期長、條件嚴格、費用相對較高。因此建立一個高效、準確篩選脂肪酸合成抑制劑的體外方法是十分必要的。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題是克服上述現有技術的不足，提供一種適合于在體外環境中，直觀、快速、高效、低成本的篩選脂肪酸合成抑制劑的方法，該方法利用產油微生物作為一個有效的工具從植物提取物、天然產物以及各種化合物中篩選出新型的脂肪酸合成抑制劑，同時可測量蛋白量以及生物量確保所篩選的抑制劑對菌體的正常生長影響很小。脂肪酸合成抑制劑的尋找對于治療脂肪相關疾病如肥胖、癌癥具有一定的幫助。

為達到上述目的，提供以下技術方案：

本發明所述篩選脂肪酸合成抑制劑的方法，是以產油微生物為工具，經過培養活化后，等量加入微孔板中，同時在相應的微孔中加入脂質染色劑以及所要篩選的抑制劑，培養一段時間后觀察并用圖像分析軟件以及分光光度計或酶標儀對微孔顯色結果進行分析，染色越淺的微孔對應的脂肪酸合成抑制劑的抑制效果越好。

該方法中，微孔的染色深度直觀地顯示了相應的微孔在培養一段時間后脂肪酸的含量，通過對顯色結果分析，可知染色越淺的微孔對應的脂肪酸合成抑制劑的抑制效果越好。

在具體操作時，本發明所述篩選脂肪酸合成抑制劑的方法，包括以下步驟：

1)產油微生物活化培養，并用打碎機打勻菌液；

2)將步驟1)中所述活化的菌液等量加入微孔板中，在實驗組中等量加入將要篩選的抑制劑，在對照組和實驗組中等量加入染色劑；

3)將步驟2)中所述微孔板中的菌體培養72小時后肉眼觀察結果，將有明顯顏色變化的篩選抑制劑用圖像分析軟件及酶標儀對顯色結果進行分析，染色越淺的微孔對應的脂肪酸合成抑制劑的抑制效果越好。

上述的方法中，還包括步驟4)將篩選出的抑制劑加入菌體培養基培養菌體，檢測生物量、蛋白量的變化，檢測抑制劑對菌體正常生長情況的影響。

上述的方法中，步驟1)中產油微生物可以是高山被孢霉、裂殖壺菌、卷枝毛霉中的至少一種；且所述產油微生物采用液體培養基培養。

上述的方法中，步驟2)中設計對照組與實驗組，對照組為只加菌液和只加菌液、染色劑的微孔，實驗組為加入菌液、抑制劑和染色劑的微孔。

上述的方法中，步驟2)中脂肪酸染色劑為TTC(2，3，5—氯化三苯基四氮唑)，加入TTC的質量與液體培養基的體積之間的百分比為0.05％～0.5％，脂質含量越多則TTC染色結果越紅。

上述的方法中，步驟2)中抑制劑加入量根據其性能強弱及降解能力添加。

上述的方法中，步驟3)中所使用的圖像分析軟件可以是image j，Adobe Photoshop CS6中的至少一種。

本發明通過上述篩選脂肪酸抑制劑的方法，篩選除了一種新的脂肪酸抑制劑丁香乙醇提取物，經過檢測可知丁香乙醇提取物可降低高山被孢霉中的C14.0，C16.0，C18.0等多種脂肪酸，可降低人類肝癌細胞HepG2與人前列腺癌細胞LNCaP中總脂肪酸的生成量，同時對于各種種類的脂肪酸的量也有明顯的降低作用。

本發明使用產油微生物作為篩選工具，由于高山被孢霉擁有一套完整的脂質合成基因，已被發現可用于高產脂肪酸。因此，高山被孢霉可以作為一個有效的工具用來篩選新型的脂肪酸合成抑制劑。相對于動物、細胞實驗，所需周期短，培養條件相對簡易，在篩選多種不同抑制劑時使用微孔板操作更加方便。

本發明在大量篩選未知物抑制劑前期可直接用肉眼分辨顏色差別，選出可行性新型抑制劑后使用圖像分析軟件、酶標儀及分光光度計對顯色結果進行分析，不需要高效液相色譜等昂貴復雜儀器設備。因此，結果觀察直觀、簡單、方便、快速。本發明在篩選脂肪酸抑制劑抑制效果的同時，還檢測了菌種生物量、蛋白量是否受到影響，影響小的抑制劑在一定程度上保證了其溫和性。篩選得到的抑制劑對于醫學上治療肥胖及其相關疾病有一定的研究作用。

綜上可知，本發明具有以下有益效果：1、本發明采用產油微生物為模板來篩選脂肪酸合成抑制劑，周期短、培養條件簡易、篩選操作方便；2、可用肉眼分別顏色差別，也可以結合儀器檢測，結果觀察直觀、簡單、方便、快速；3、還通過檢測菌種蛋白量以及生物量確保所篩選的抑制劑對生物體的影響較小；4、丁香乙醇提取物可用作脂肪酸抑制劑，脂肪酸合成抑制劑的尋找對于治療脂肪相關疾病如肥胖、癌癥具有一定的幫助。

附圖說明

圖1為本發明實施例1中使用TTC篩選脂肪酸抑制劑時微孔板的圖像；

圖2為本發明實施例2中使用TTC篩選脂肪酸抑制劑時微孔板的圖像；

圖3為本發明實施例3中測定的脂肪酸合成抑制劑丁香乙醇提取物對高山被孢霉脂肪酸含量的減少結果；

圖4為本發明實施例4中測定的脂肪酸合成抑制劑丁香乙醇提取物對哺乳動物前列腺癌細胞LNCaP脂肪酸含量的減少結果；

圖5為本發明實施例5中測定的脂肪酸合成抑制劑丁香乙醇提取物對哺乳動物肝癌細胞HepG2脂肪酸含量的減少結果；

其中ns：P＞0.05，*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001。

具體實施方式

下面結合具體實施例和附圖來進一步說明本發明的技術方案。

實施例1：

將已知的脂肪酸合成抑制劑Cerulenin溶于二甲亞砜中并保存于-20℃，作為實驗陽性參照物備用，TTC粉末以5mg/mL的濃度溶解于無菌水中保存。

設計等量的二甲亞砜溶液作為對照組，用于表明二甲亞砜對菌體生長沒有影響。

下面進行脂肪酸抑制劑的篩選：

1)將培養于Broth液體培養基(葡萄糖，20g/L；蛋白胨酵母提取物，50g/L；KH₂PO₄，1g/L；MgSO₄，0.25g/L；KNO₃，10g/L)中的高山被孢霉用打碎機打碎，并用紫外分光光度計測定吸光度(OD)稀釋至所需濃度，分別為OD＝0.2、OD＝0.5、OD＝0.8；

2)將上述菌液等量接種于96孔板中。每種濃度的高山被孢霉孔設置加入不同濃度TTC組(TTC的濃度分別為0.02％，0.05％，0.1％，0.15％)與加入TTC跟陽性參照物Cerulenin(1μM)組；

3)上述96孔板在28℃下培養72小時后，肉眼觀察結果，將有明顯顏色變化的篩選抑制劑用圖像分析軟件及酶標儀對顯色結果進行分析，染色越淺的微孔對應的脂肪酸合成抑制劑的抑制效果越好。圖1為加入不同濃度TTC(0.02％，0.05％，0.1％，0.15％)和一定濃度的陽性對照抑制劑(C75，Ceulenin)于微孔板不同濃度的高山被孢霉培養液中(接種OD為0.2，0.5，0.8)，28℃培養72小時。

實驗結果：根據顏色變化選擇最優的篩選條件為0.05％TTC與接種OD為0.5的高山被孢霉。

實施例2：

在96孔板中接種實施例2中的OD為0.5的打碎的高山被孢霉，并在相應微孔中加入0.5％的TTC溶液和適量藥食同源功能成分或化學合成類藥物，并設置溶劑陰性對照組與Cerulenin(1μM)和C75(1μM)陽性對照組，放置于28℃暗處培養72小時，觀察微孔顏色變化。

圖2為本實施例使用TTC篩選脂肪酸抑制劑時微孔板的圖像。

實驗結果：加入陽性參照物的微孔紅色明顯較弱，說明脂肪酸合成量減少，證明了該方法的可行性。其中有幾個天然產物(丁香乙醇提取物)及化和藥物的微孔紅色較弱，說明篩選到了一定的脂肪酸合成抑制劑成分。

實施例3：

實施例2中篩選到的丁香乙醇提取物對高山被孢霉脂肪酸含量的減少作用測定：

1)菌體培養：M.alpina ATCC32222接種于Potato Dextrose Agar(PDA)培養基上在28℃條件下培養20-30天。加入5mLBroth培養基，將孢子從壁上刮下。

吸取3mL孢子懸浮液到45mL的Broth培養基中，在25℃、200rpm的搖床中培養兩天。第三天加入丁香乙醇提取物(200mg/L)，并設置DMSO溶劑對照組，繼續培養4小時。

2)菌體脂肪酸含量測定：收取菌體并過濾，凍干后菌體研磨并稱重。約50mg菌體中加入標準樣品用來定量。隨后加入HCl，80℃水浴1小時。-80℃冷凍15分鐘，重復一次后于80℃水浴30分鐘。加入甲醇與氯仿萃取，離心分離，用氮氣將溶劑吹干后加入10％的鹽酸甲醇溶液甲酯化，60℃，2小時。甲酯化后加入正己烷萃取，分離后將溶劑用氮氣吹干后溶于1mL正己烷，得到樣品用GCMS分析。

圖3為本實施例中測定的脂肪酸合成抑制劑丁香乙醇提取物對高山被孢霉脂肪酸含量的減少結果。

實驗結果：該發放篩選到的脂肪酸合成抑制劑丁香乙醇提取物可降低高山被孢霉中的C14.0，C16.0，C18.0等多種脂肪酸。

實施例4：

實施例2中篩選到的丁香乙醇提取物對對哺乳動物前列腺癌細胞LNCaP脂肪酸含量、哺乳動物肝癌細胞HepG2脂肪酸含量的減少作用測定：

1)腫瘤細胞株：人類肝癌細胞HepG2及人前列腺癌細胞LNCaP為本實驗室凍存。細胞培養基MEM和RPMI1640及牛血清為Thermo公司產品。

2)受試藥物：取丁香干物料粉碎，丁香與75％乙醇比為1:20混合，37℃、200rpm震蕩提取12小時，過濾且殘渣重復上述步驟兩次，合并三次濾液旋轉蒸發，以100mg/mL濃度溶于二甲亞砜用于細胞實驗。

3)細胞培養：細胞用含體積分數10％的胎牛血清及1％的雙抗(康青霉素和抗鏈霉素)的RPMI1640或MEM培養液常規培養。每72小時用0.25％胰酶消化，1:2～1:3擴瓶傳代。傳代后24小時細胞貼壁，加入丁香乙醇提取物(100mg/L)，并設置溶劑對照組，培養三天。

4)細胞脂肪酸提取：倒掉細胞中培養基，加入PBS刮下細胞，同時加入標準品用來定量。加入4mL甲醇，2mL氯仿，用鹽酸調節pH，室溫反應1小時，加入2mL水與2mL氯仿震蕩離心，分離。重復該步驟。得到物質合并，氮氣吹干，加入2mL乙醇與200μL 50％KOH，75℃水浴1小時。加入2mL水與6mL正己烷震蕩離心，加入6mL正己烷，震蕩離心并分離，氮氣吹干。加入2mlNaOH甲醇，100℃水浴，加入BF₃，100℃水浴。加入4mL正己烷，2mL飽和NaCl，震蕩離心，分離后GCMS分析。

圖4為本實施例中測定的脂肪酸合成抑制劑丁香乙醇提取物對哺乳動物前列腺癌細胞LNCaP脂肪酸含量的減少結果；圖5為實施例中測定的脂肪酸合成抑制劑丁香乙醇提取物對哺乳動物肝癌細胞HepG2脂肪酸含量的減少結果。其中ns：P＞0.05，*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001。

實驗結果：該方法篩選到的脂肪酸合成抑制劑丁香乙醇提取物可降低人類肝癌細胞HepG2與人前列腺癌細胞LNCaP中總脂肪酸的生成量，同時對于各種種類的脂肪酸的量也有明顯的降低作用。