抗壞血酸的新用途的制作方法

專利名稱：：抗壞血酸的新用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及抗壞血酸的用途，尤其涉及抗壞血酸通過細胞重編程機制抗衰老的新用途。
背景技術：
：抗壞血酸，又名維生素C，是一種水溶性維生素，主要功能有1、促進骨膠原的生物合成，利于組織創傷口的更快愈合；2、促進氨基酸中酪氨酸和色氨酸的代謝，延長肌體壽命；3、改善鐵、鈣和葉酸的利用；4、改善脂肪和類脂特別是膽固醇的代謝，預防心血管病；5、促進牙齒和骨骼的生長，防止牙床出血，防止關節痛、腰腿痛；6、增強肌體對外界環境的抗應激能力和免疫力；7、水溶性強抗氧化劑，主要作用在體內水溶液中；8、堅固結締組織；9、促進膠原蛋白的合成，防止牙齦出血。至今未見抗壞血酸具有通過細胞重編程機制抗衰老作用的報道。體細胞重編程(somaticr印rogramming)指的是分化的體細胞在特定的條件下被逆轉后恢復到全能性狀態，或者形成胚胎干細胞系，或者進一步發育成一個新的個體的過程。誘導體細胞重編程的方法有許多，如核移植、細胞融合、細胞提取物誘導、化學誘導以及分子調控誘導等。但到目前為止，唯一能誘導體細胞產生有功能個體的重編程的方法只有核移植，其他的方法只能在細胞、分子或生化水平上產生誘導。然而所有這些誘導體細胞重編程的技術都很不成熟，效率很低，體細胞重編程的機制還不清楚。雖然如此，但是體細胞重編程卻有著非常廣泛的應用前景，不僅在基礎理論研究中，而且在應用研究中，例如家畜繁殖、動物保護以及人口健康等領域都有著重要的作用。
發明內容本發明的目的在于提供一種抗壞血酸的新用途，具體為抗壞血酸在制備誘導體細胞重編程的藥物中的應用。抗壞血酸的新用途，具體為抗壞血酸在制備培養胚胎干細胞的培養基中的應用。抗壞血酸的新用途，具體為抗壞血酸在制備抗衰老藥物/保健品中的應用。所述抗衰老的機制為細胞重編程機制。本發明還提供了一種誘導體細胞重編程的組合物，所述組合物含有抗壞血酸。—種誘導體細胞重編程的胚胎干細胞培養基，所述培養基的主要成分為血清，所述培養基含有抗壞血酸。—種誘導體細胞重編程的方法，包括以下步驟1)將一個或多個干細胞多能性因子導入體細胞；2)將步驟1)得到的導入了干細胞多能性因子的體細胞至于胚胎干細胞培養基中培養，將所述體細胞誘導重編程為iPS細胞，所述胚胎干細胞培養基中含有抗壞血酸。—種利用抗壞血酸或其衍生物作為主要添加成分用于產生iPS細胞的具體方法，包括以下步驟(1)將一個或多個干細胞多能性因子導入體細胞；(2)用本發明提到的添加抗壞血酸或其衍生物的胚胎干細胞培養基，培養(1)中經導入的體細胞，將體細胞誘導重編程為iPS細胞；(3)利用內源報告基因激活表達或形態觀察初步確定(2)中形成克隆的狀態；(4)挑出符合(3)條件的單克隆，即內源報告基因激活或克隆呈現胚胎干細胞在相同培養基中生長的形態；(5)利用含有抗壞血酸的胚胎干細胞培養基培養(4)中的單克隆細胞；(6)利用多種檢測手段，鑒定(5)中單克隆細胞的狀態是否達到類似胚胎干細胞的狀態，主要包括定量PCR分析干細胞特異基因表達，分析體內自發分化形成畸胎瘤的能力，對于非人iPS細胞，檢測嵌合能力，是否有生殖細胞轉移(germlinetransmission)。本發明的抗壞血酸一般以藥物組合物的形式使用，這種組合物含有治療有效劑量的作為活性成分的抗壞血酸和可藥用輔料。含有抗壞血酸的藥物組合物可通過口服、注射或粘膜給藥，可以制成片劑、膠囊、粉劑、顆粒、錠劑，或口服液等劑型供臨床應用。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規方法制備。含有抗壞血酸的營養品可以口服。本發明提供了抗壞血酸具有協助細胞重編程的作用，具體為使已經分化的細胞重新回到原始的多能干細胞狀態，并且具有維持這種狀態的功能；這是抗壞血酸具有抗衰老的主要原因。本發明提供了抗壞血酸具有抗衰老功能，從而為抗壞血酸應用于通過細胞重編程機制抗衰老提供了直接有力的實驗依據和理論基礎，既有很強的科學性和創新性，又有很高的開發應用價值。圖1VC顯著提高0G2小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)的誘導重編程效率。在以血清為基礎的小鼠iPS實驗中，與其他抗氧化劑(維生素Bl，VB1;N-乙酰半胱氨酸，NAC;還原型谷胱甘肽，Gmee;亞硒酸鈉，Sel)相比，VC顯著提高經典四因子SK0M(Sox2，0ct4，Klf4和cMyc)和三因子SK0(Sox2，0ct4和Klf4)的iPS效率(iPS效率以流式細胞儀分別檢測四因子第9天以及三因子第16天轉基因0ct4啟動子驅動的GFP基因表達效率)。圖2用添加有VC的血清胚胎干細胞培養基制備的iPS克隆具有與胚胎干細胞相似的多能性。(A)用mES+VC培養基制備的不同小鼠iPS克隆細胞內源胚胎干細胞標記基因的表達用實時定量PCR檢測結果與小鼠胚胎干細胞系Rl基本一致；(B)不同小鼠iPS克隆細胞胚胎干細胞標記基因Nanog啟動子甲基化水平檢測結果與Rl—致，顯著低于iPS初始細胞MEF(黑色實心圈代表該位點甲基化，空心圈代表去甲基化)；(C)這些iPS克隆細胞具有多能性，分別體現在在裸鼠畸胎瘤實驗中能夠形成內(腺體)，中(骨骼)，外胚層(皮膚)細胞，以及形成嵌合小鼠(藍色胚胎來自0G2小鼠的lacZ轉基因染色)。圖3其他抗壞血酸衍生物對小鼠iPS的影響。與對照相比，抗壞血酸(LAA)，穩定型衍生物抗壞血酸磷酸酯(ASCP)均能顯著提高四因子和三因子iPS效率，但是氧化型抗壞血酸(DHA)則對iPS無顯著影響。圖4VC促進iPS前體細胞(pre-iPScells)向完全iPS細胞(full-iPScells)的轉變。(A)MEFiPS前體細胞C2，C4和C5用含有VC的培養基處理9代后GFP陽性率顯著提高，而對照組不加VC的GFP陽性率持續很低；(B)C2和C4加VC處理后的克隆形態和GFP熒光情況比較相同代數的未處理對照細胞更加接近mES細胞。圖5VC有利于iPS細胞維持自我更新狀態。(A)iPS細胞在含VC培養基中能更好的維持0ct4-GFP的表達；(B)iPS細胞在含VC培養基中能更好維持胚胎干細胞形態和GFP克隆比例。圖6用添加有VC的培養基制備的人iPS細胞形態與人ESC沒有明顯區別。(A)人成體細胞形態；(B，C)以VC為主要添加劑制備的人iPS克隆AP染色及形態圖；(D)人iPS克隆在無滋養層培養的形態圖。圖7用添加有VC的培養基制備的iPS的效率比較其他經典或已報道的培養基顯著提高。在圖示中的三次獨立實驗中，以AP染色陽性克隆數為指標(縱坐標)衡量不同培養基，包括單純血清(DFBS)，血清加以VC為主的抗氧化劑(DFBS+A)，單純血清替代物(KSR)，以及血清加丙戊酸(VPA)，結果顯示，DFBS+A得到的AP陽性iPS效率顯著高于其他培養基，值得注意的是，該組合甚至高于目前國際已報道的顯著提高人iPS效率的VPA。圖8含有VC的培養基用于細胞因子對小鼠iPS效率影響的篩選。相比經典的mES培養基，添加以VC為主的抗氧化劑(A)培養基更有利于細胞因子對iPS影響的篩選。具體體現在在mES中沒有顯著差異的bFGF在mES+A中顯著提高iPS效率。具體實施例方式下列實施例舉例了發明人的標準實驗室實踐，用于示例本發明的模式，而不應將本發明理解為限定于這些實施例的范圍。這些實施例。根據本文公開和本領域技術人員的普遍水平，技術人員將理解下列僅用于示例，可以在不超過本發明的范圍內進行各種變動、修飾和改造。其中所涉及的技術，除非特別說明，均是本領域技術人員熟知的分子生物學、細胞生物學、生物化學等各個領域的常規技術。本發明中所用技術概述除了特別說明，本文中提及的各種物質均來自英杰生命科學公司(Invitrogen)包裝反轉錄病毒以及誘導iPS細胞從Addgene公司購置包含小鼠0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc的DNA的反轉錄病毒載體(pMXs)。按照現有技術進行病毒的產生和感染(Qin，D.，Li，W.，Zhang，J.&Pei，D.DirectgenerationofES-likecellsfromunmodifiedmouseembryonicfibroblastsby0ct4/Sox2/Myc/Klf4.Cellresearch17,959-962(2007);Qin，D.等人MousemeningiocytesexpressSox2andyieldhighefficiencyofchimerasafternuclearr印rogrammingwithexogenousfactors.JBiolChem283，33730-33735(2008))簡言之，利用常規方法將這些質粒轉染到PlatE細胞中。48小時后收集病毒上清液并且過濾，以感染MEF，其中補充有1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物。在第二天重復相同的步驟。添加病毒上清液的當天被定義為第0天(DO)。將病毒感染后(即已經轉染了Sox2、Klf4、0ct4和/或c-Myc，下文中，如無特殊說明，3因子感染代表用Sox2、Klf4和0ct4感染，4因子感染代表用Sox2、Klf4、0ct4和c-Myc感染)的成纖維細胞培養在mES培養基中，在感染后13-15天(4因子感染實驗)或23-25(3因子感染實驗)挑取iPS集落，這是基于Oct-GFP(即在熒光顯微鏡下發射熒光的集落)和典型的ES形態來挑取的。隨后如ES細胞樣延展和保持挑取的集落(如上所述Qin，D.，Li，W.，Zhang，J.&Pei，D，2007;以及Qin，D.等人，2008)。重編程效率的定量用于定量重編程效率的主要方法有l，直接利用流式細胞儀對D9-10天的四因子SK0M或D15-16天的三因子iPS測定Oct3/4-GFP陽性細胞比例；2，在感染原盤或孔中(未分到滋養層細胞上)計數0ct3/4-GFP陽性克隆數；3，將感染后的細胞以確定細胞數分到滋養層細胞上，培養一定時間后，AP染色，計數AP陽性克隆和Oct3/4-GFP陽性克隆。iPS細胞的表征進行堿性磷酸酶和免疫熒光染色(如上所述Qin，D.，Li，W.，Zhang，J.&Pei，D，2007;以及Qin，D.等人，2008)。使用下列一抗小鼠抗_0ct4(SantaCruz公司)、小鼠抗-SSEA1(Abcam公司)，小鼠抗-Nanog(Abcam公司)。實施例l利用VC提高小鼠體細胞重編程效率。a，將四因子(SKOM)或三因子(SKO)的病毒以等體積混合(每種病毒lml)后感染到12孔板的一孔中共計2.0萬個0G2小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)中，在37度5%C02培養在mES培養基中。從兩次感染結束后D2天起，添加VC或其他化合物(VC，50ug/ml;Vbl，9ug/ml;NAC，lmM;GMEE，1.5ug/ml;Selenite，20nM;抗氧化劑混合物Antiox，即VC+Vb1+GMEE+Se1enite);對四因子，D9-10天消化，對三因子，D15-16天消化，流式檢測GFP陽性細胞比例。如圖1所示，與對照組相比，添加VC或含有VC的多種抗氧化劑均顯著提高SKOM和SKO的iPS效率。b，如上所述，將三因子SKO-iPS細胞分到滋養層細胞上，繼續用含VC或含VC的抗氧化劑的mES培養基(Vc，50ug/ml)培養，10-14天后挑出GFP陽性的mESC形態的克隆，這些細胞經過去除滋養層細胞，使用Trizol(Takara公司)試劑，按照制造商說明提取總RNA。用M-MLV(Takara公司)試劑盒進行逆轉錄，并使用SYBR⑧PremixExTaq試劑盒(Takara公司)，ABI7300熒光定量PCR儀(ABI公司)進行Real-TimePCR。所有上述PCR條件均使用常規PCR條件，按照制造商說明進行。其中鑒定iPS各標志物使用引物列表如表1所示。表1RT-PCR所用引物<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>如圖2A所示，使用本申請的方法獲得的iPS表達較高水平與mESC細胞Rl—致的多能性因子Nanog和Rexl，而這些因子在原始MEF細胞中均沒有可檢測到的表達。c，根據制造商的說明，使用CpGenome修飾試劑盒(Chemicon公司)進行亞硫酸氫鹽處理。處理過程中使用的Nanog啟動子的PCR引物見下表2。將上述PCR產物克隆到pMD18-T(Takara公司)載體中，隨機選擇克隆用于對每個基因測序，所述測序用M13正向和M13反向引物。表2:PCR所用引物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>圖2B中顯示iPS克隆與Rl中內源性Nanog啟動子區域沒有甲基化，而MEF細胞中，上述基因組區域均呈現相對高度甲基化。也就是說，經過誘導重編程的iPS細胞中，內源性多能性干細胞因子Nanog的啟動子區去甲基化，從而其表達得以被激活。d，將消化重懸在PBS中的2百萬iPS克隆細胞注射到裸鼠腋下，經過2-3周，解剖裸鼠取出腫瘤，固定，包埋，切片，HE染色觀察畸胎瘤分化情況。如圖2C所示，iPS細胞成功分化為三個胚層的不同組織細胞，如外胚層的皮膚，中胚層的骨骼，以及內胚層的腺體。e，將消化重懸在培養基中的iPS細胞注射到ICR小鼠囊胚中的內細胞團中進行嵌合實驗，在E12-16天解剖母鼠，對胚胎進行beta-半乳糖酐酶染色，結果如圖2C顯示，iPS細胞成功嵌合到皮膚組織中。實施例2利用VC促進小鼠iPS前體細胞向完全iPS細胞的轉化。用經典的mES培養基誘導產生的多數四因子SKOM-iPS克隆沒有GFP表達，初步顯示這些細胞沒有最終達到完全iPS細胞的狀態。我們將這些克隆挑出并連續傳代，如圖4所示，經過5-9代VC處理，約3/4的克隆出現明顯的GFP表達。這些克隆的形態也明顯接近mESC細胞，而這些克隆在經典mES培養基中連續傳代導致其喪失mESC形態。因此，VC對iPS的促進作用至少一部分體現在將多數前體iPS細胞轉化為完全iPS細胞。實施例3利用VC維持小鼠iPS細胞穩定傳代。與實施例2類似，我們挑取GFP陽性的iPS克隆，體外以經典mES培養基以及加VC的培養基分別連續傳代，經過約5代，如圖5所示，在經典mES培養基中，iPS克隆熒光顯著喪失，同時克隆也喪失mESC形態；而加有VC的培養基可以相對穩定的維持iPS的GFP熒光表達以及細胞的mESC形態。這說明VC能夠維持小鼠iPS細胞的mESC狀態。實施例4VC提高人iPS效率。a，細胞的制備和培養由外科手術廢棄物中分離人體組織，培養得到原代細胞，用高葡萄糖DMEM(Dulbcco'sModifedEagleMedium)培養基(4.5g/L的葡萄糖，HyClone公司)培養所得到的細胞，培養基中包含10%胎牛血清(HyClone公司)、非必需氨基酸(NEAA，1%)、2mML-谷氨酰胺、青霉素(飾/ml)和鏈霉素(100iig/ml)。在多能干細胞誘導過程中使用DFBS(defined-FBS)培養基和DFBS+A(以VC為主的抗氧化劑組合混合物，詳情如下所述)培養基。所述的DFBS+A培養基包含高葡萄糖DMEM培養基，20X特級胎牛血清(DefinedFBS，Hyclone)，4ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、青霉素/鏈霉素、lXL-谷氨酰胺、0.lmMP_巰基乙醇和1%非必需氨基酸(NEAA);所述的DFBS+A培養基為在DFBS基礎上添加如下三種組分，50ug/mlVC，9ug/ml維生素(VBl)，10uM還原型谷胱甘肽。將人胚胎干細胞(hES)和用于擴增的誘導的多能干細胞(inducedpluripotentstemcells,iPS細胞)培養在用絲裂霉素(10ug/ml)處理的MEF(小鼠胚胎成纖維細胞)上，并且培養在KSR培養基中DMEM/F12(HyClone公司)，20%血清替代物(KSR，Invitrogen公司)，4ng/mlbFGF、青霉素/鏈霉素、1%L-谷氨酰胺、0.ImMP-巰基乙醇和1%非必需氨基酸。b，病毒感染人體細胞根據實施例1所述的方法，在p6孔培養板中按每孔約6X104個細胞接種人的人體細胞，在37°C、5%C02的常規培養條件下培養過夜，用收集的病毒上清液感染培養的人體細胞。所述病毒上清液是通過用包含人0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc的cDNA的反轉錄病毒pMX載體(Addgene)按常規方法轉染293T細胞(Lipofectamine2000，Invitrogen)獲得的(參見Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆實驗指南，第3版(2002))。c，感染細胞的繼續培養和克隆篩選在感染后第2天，將感染后的人體細胞的培養基，替換為實施例1中所述的DFBS+A培養基，在371\5%C02的常規培養條件下培養7天，每天更換一次培養基，用0.25%胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)于37。C消化為單細胞懸液，將消化后的細胞按每培養皿約10000個細胞的密度接種到100mm培養皿中，所述培養皿按a中描述的方法，預先用滋養層細胞包被。接種后的細胞在371:、5%C02的常規培養條件下培養14天，顯微鏡檢可見hESC樣克隆(如圖6所示)，其中A為人體細胞感染SK0M前的形態，B為人體細胞在感染SK0M后26天在滋養層上形成典型的hES樣克隆形態；C為人體細胞hiPS克隆挑取至新的滋養層上傳代擴增仍保持很好的hESC樣形態，該圖為傳代2代后的形態，使用KSR培養基；D是人體細胞hES樣克隆在Matrigel預包被的6孔平板上生長形態，此處所用培養基為mTeSRTMl。使用玻璃針分割邊緣光滑，細胞核清晰，人胚胎干細胞樣的單個克隆(見圖6C)，然后用玻璃管吸取這些分割開的克隆接種到12孔板的單個孔中，每個孔接種一個ES樣克隆，一共挑取12個。所述12孔板按a中描述的方法，預先用滋養層細胞包被。接種后的細胞在KSR培養基中，37t:、5XC02的常規培養條件下培養。這些挑取出的克隆具有典型的hES致密形態，在12孔板培養一周后，每孔選擇部分克隆進行AP染色，結果為100XAP染色陽性(數據未顯示)。挑取部分hES樣克隆后將剩余100mm培養皿AP染色，計數AP陽性克隆數目，第7天時向100mm培養皿共種下10000個SK0M感染的人體細胞，計算誘導iPS細胞效率如圖7所示；AP染色后，依據克隆形態及AP結果對hES樣的克隆計數，我們這種加VC的方法的總體效率為大約2.2%，與傳統用KSR培養基培養的0.01-0.02%的效率相比超過100倍，與本實驗中設置的DFBS和KSR對照相比效率提高超過70倍。實施例5利用含有VC的培養基篩選能夠顯著影響iPS的化合物或細胞因子。由于小鼠三因子iPSGFP效率在D15-16天大大高于四因子D9-10天效率，我們將感染S、K、0三因子的iPS細胞分別加入要篩選的不同細胞因子，包括表皮生長因子(EGF，20ng/ml)，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF，10ng/ml)，肝細胞生長因子(HGF，10ng/ml)，胰島素(insulin,10ug/ml)，D16天流式檢測GFP陽性細胞比例，結果如圖8所示，不含VC的培養基中，HGF和insulin經過統計顯示比對照效率有所提高；而在含有VC的培養基中，除了HGF和insulin夕卜，bFGF顯示了顯著提高的iPS效率。因此，含有VC的培養基更有利于細胞因子或化合物的篩選。權利要求抗壞血酸的新用途，其特征在于抗壞血酸在制備誘導體細胞重編程的藥物中的應用。2.抗壞血酸的新用途，其特征在于抗壞血酸在制備培養胚胎干細胞的培養基中的應用。3.抗壞血酸的新用途，其特征在于抗壞血酸在制備抗衰老藥物/保健品中的應用。4.根據權利要求3所述的抗壞血酸的新用途，其特征在于所述抗衰老的機制為細胞重編程機制。5.—種誘導體細胞重編程的組合物，其特征在于所述組合物含有抗壞血酸。6.—種誘導體細胞重編程的胚胎干細胞培養基，其特征在于所述培養基的主要成分為血清，所述培養基含有抗壞血酸。7.—種誘導體細胞重編程的方法，包括以下步驟1)將一個或多個干細胞多能性因子導入體細胞；2)將步驟l)得到的導入了干細胞多能性因子的體細胞至于胚胎干細胞培養基中培養，將所述體細胞誘導重編程為iPS細胞，所述胚胎干細胞培養基中含有抗壞血酸。全文摘要本發明涉及抗壞血酸具有通過細胞重編程機制抗衰老的新用途。為抗壞血酸應用于抗衰老提供了直接有力的實驗依據和理論基礎，既有很強的科學性和創新性，又有很高的開發應用價值。文檔編號A23L1/29GK101744808SQ20091018914公開日2010年6月23日申請日期2009年12月15日優先權日2009年12月15日發明者楊佳銀,王濤,秦寶明,米蓋爾.埃斯特班,裴端卿申請人:中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院