專利名稱：玉米稈碳源培養彩絨革蓋菌誘導草酸脫羧酶的方法
技術領域：
本發明屬草酸脫羧酶的制備領域，特別是涉及一種玉米稈碳源培養彩絨革蓋菌誘
導草酸脫羧酶的方法。
背景技術：
草酸脫羧酶可以催化草酸脫羧形成甲酸和二氧化碳，因此在酶法檢測草酸含量，
降解工業廢水中草酸鹽，制備低草酸含量食品以及降低人體內草酸濃度等方面具有廣闊的
應用前景。彩絨革蓋菌作為生產草酸脫羧酶的重要菌種，如何降低其培養成本，大量生產菌
絲體，并誘導菌絲體合成草酸脫羧酶是一項重要課題。由于碳元素是生物體內含量最多的
元素，因此碳源是培養基中用量最大的一種，占生物產品總成本的比例較高，所以通過利用
低成本碳源替代目前使用的純凈葡萄糖能大幅度降低微生物的培養成本。 秸稈是農作物收割后的剩余物，作為農業生產的副產品，農村中每年大量的秸稈
主要用來燒火，或者粉碎后給家畜做飼料用。雖然焚燒后的秸稈可以撒在田里作為肥料，但
在焚燒過程中產生的氣體會導致溫室效應的增加，而且產生的煙塵也會造成空氣污染。所
以，將秸稈水解后獲得的水解液來作為培養工業微生物的碳源，不僅可以降低微生物培養
成本，減輕焚燒對環境的污染，而且提高了秸稈應用附加值，具有重大的經濟效益和環境效
.
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種玉米稈碳源培養彩絨革蓋菌誘導草酸脫 羧酶的方法，該方法簡單，成本低，效率高；底物誘導產草酸脫羧酶不受抑制，產酶量穩定。
本發明的一種玉米稈碳源培養彩絨革蓋菌誘導草酸脫羧酶的方法，包括
(1)將粉碎的玉米稈按照固液比為lg : 5-15mL用酸溶液浸泡10_20h，在 100-15(TC條件下水解反應20-60min，離心去除殘渣后，得到玉米稈水解液，并用DNS法測 定水解液中還原糖含量(以葡萄糖為標準糖計)； (2)按7-30g/L的還原糖量，將玉米稈水解液配制發酵培養基，調節pH值為 4. 0-5. 0，過濾除去雜質，并添加氮源和無機鹽等營養物質獲得發酵培養基，檢查并調節pH 值至4. 0-5.0，滅菌后備用; (3)取2-3片直徑為9 llmm含菌絲體的瓊脂培養基，接入液體種子培養基，在 3(TC靜置培養4-6天；待菌絲體在液體培養基上方形成白色菌絲群但尚未浮出水面時，將 菌絲體和培養基全部轉移到含有無菌玻璃珠的容器中，對菌絲體進行震蕩破碎獲得含有菌
絲碎片的懸濁液，以3-15%的接種量接入發酵培養基，在20-3(TC和100-250rpm轉速條件 下培養4-6天； (4)待菌絲球形成時，加入終濃度為5-20mM的草酸誘導草酸脫羧酶的產生，培養 0. 5-6天后獲取菌絲體；菌絲體經液氮冷凍后研磨破碎，用0. 2M，pH 3. 7的醋酸緩沖液提取 菌絲碎片，離心去除殘渣，所得上清液即為草酸脫羧酶粗酶液。
所述步驟(1)中的酸為硫酸、鹽酸、醋酸，質量百分比濃度為0. 5% -8% ;
所述步驟(2)用氫氧化鈉溶液調節pH值； 所述步驟(2)中的發酵培養基中組分為玉米稈水解物中的還原糖7-30g(以葡萄 糖為標準糖計)，蛋白胨3. Og， KH2P041. Og， Na2HP04 12H20 0. 2g， MgS04 7H20 0. 5g以及微 量元素lml，用水定容至1L; 所述的微量元素的組分為:FeS04 *7H20 10g，MnS04 *H20 1. Og， ZnS04 *7H20 1. Og/， CuS04 5H20 2. Og， CaCl2 2H20 13g，用水定容至1L ; 所述步驟(3)中的液體種子培養基，以葡萄糖代替發酵培養基中的還原糖，其余 組分含量與發酵培養基相同。 本發明通過水解玉米稈獲得培養彩絨革蓋菌生長的碳源，并用底物草酸誘導菌絲
體合成草酸脫羧酶。 (1)本發明利用玉米稈水解液作為發酵培養彩絨革蓋菌的碳源，方法簡單，易于操 作； (2)本發明使用的的玉米稈產量大，成本低，作為生產碳源的原料價格低廉；且碳 源的制備可控性強，含糖量穩定； (3)與傳統培養基碳源——葡萄糖相比，以該低值碳源生產彩絨革蓋菌獲得的菌 絲體生物量大，轉化率高。 (4)與傳統培養基相比，以該低值碳源培養菌體時，底物誘導產草酸脫羧酶不受抑 制，產酶量穩定。
圖1稻稈水解液培養基(初始pH 5. 0)生產的菌絲體干重隨發酵時間的變化；+ 水解液培養基+葡萄糖培養基； 圖2玉米稈水解液培養基(初始pH 5. 0)中利用草酸誘導合成的酶活力；+水 解液培養基+葡萄糖培養基； 圖3玉米稈水解液培養基(初始pH 5. 0)中添加草酸誘導后提取的菌絲體蛋白含 量；+水解液培養基+葡萄糖培養基； 圖4玉米稈水解液培養基(初始pH 5. 0)中添加草酸誘導后的還原糖含量；+ 水解液培養基+葡萄糖培養基。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。 實施例1 玉米稈水解液生產彩絨革蓋菌(培養基初始pH值5. 0) 將充分磨碎的玉米稈稱重，以lg : 12ml的固液比加入濃度為5%的硫酸溶液，玉
4米稈粉經稀硫酸溶液浸泡10小時后，放置于高壓蒸煮鍋中，在12rC下，反應30min，過濾除 去玉米稈殘渣，獲得玉米稈水解液備用。用DNS法測定玉米稈水解液中還原糖的含量(以 葡萄糖為標準糖)，4t:條件下儲存備用。每50mL培養基中加入含lg還原糖(以葡萄糖 計)的玉米稈水解液，再加入O. 15g蛋白胨，0. 05g磷酸二氫鉀，0. 025g MgS04*7H20，0. Olg Na2HP04 12H20，以及微量元素50 y L(微量元素配方為:FeS04 7H20 10g/L， MnS04 H20 1. Og/L， ZnS04 7H201. Og/L， CuS04 5H20 2. Og/L， CaCl2 2H20 10g/L)。培養基配制完成 后，用氫氧化鈉調節PH值至5. 0，滅菌后備用。 取一塊瓊脂平板菌種，用打孔器打下直徑約10mm含菌絲體的固體培養基薄片，取 2-3片加入液體種子培養基，3(TC靜置4-6天。待菌絲體在培養基上方形成白色菌蓋但尚未 完全浮出液面，全部移入裝有玻璃珠的容器，進行震蕩破碎，獲得含有菌絲碎片的懸濁液。 將混勻的菌懸液按12%的接種量接入發酵培養基中，培養1-5天，稱取菌絲體絕干重。發現 玉米稈水解液培養基的菌絲體產量高于對照培養基(葡萄糖)菌絲體產量，且處于上升趨 勢(見圖1)。
實施例2 玉米稈水解液生產彩絨革蓋菌(培養基初始pH值5. 0) 將充分磨碎的玉米稈稱重，以lg : 8ml的固液比加入濃度為3%的硫酸溶液，玉 米稈粉經稀硫酸溶液浸泡10小時后，放置于高壓蒸煮鍋中，在15(TC下，反應60min，過濾除 去玉米稈殘渣，獲得玉米稈水解液備用。用DNS法測定玉米稈水解液中還原糖的含量(以 葡萄糖為標準糖)，4t:條件下儲存備用。每50mL培養基中加入含lg還原糖(以葡萄糖 計)的玉米稈水解液，再加入O. 15g蛋白胨，0. 05g磷酸二氫鉀，0. 025g MgS04*7H20，0. Olg Na2HP04 12H20，以及微量元素50 y L(微量元素配方為:FeS04 7H20 10g/L， MnS04 H20 1. Og/L， ZnS04 7H201. Og/L， CuS04 5H20 2. Og/L， CaCl2 2H20 13g/L)。培養基配制完成 后，用氫氧化鈉調節PH值至5. 0，滅菌后備用。 取一塊瓊脂平板菌種，用打孔器打下直徑約10mm含菌絲體的固體培養基薄片，取 2-3片加入液體種子培養基，3(TC靜置4-6天。待菌絲體在培養基上方形成白色菌蓋但尚未 完全浮出液面，全部移入裝有玻璃珠的容器，進行震蕩破碎，獲得含有菌絲碎片的懸濁液。 將混勻的菌懸液按3%的接種量接入發酵培養基中，培養1-5天，稱取菌絲體絕干重。發現 菌絲體產量的變化趨勢與實施例1類似，同樣高于對照培養基(葡萄糖)菌絲體產量，且處
于上升趨勢。
實施例3 玉米稈水解液生產彩絨革蓋菌(培養基初始pH值5. 0) 將充分磨碎的玉米稈稱重，以lg : 15ml的固液比加入濃度為8%的硫酸溶液，玉 米稈粉經稀硫酸溶液浸泡10小時后，放置于高壓蒸煮鍋中，在IO(TC下，反應60min，過濾除 去玉米稈殘渣，獲得玉米稈水解液備用。用DNS法測定玉米稈水解液中還原糖的含量(以 葡萄糖為標準糖)，4t:條件下儲存備用。每50mL培養基中加入含lg還原糖(以葡萄糖 計)的玉米稈水解液，再加入O. 15g蛋白胨，0. 05g磷酸二氫鉀，0. 025g MgS04*7H20，0. Olg Na2HP04 12H20，以及微量元素50 y L(微量元素配方為:FeS04 7H20 10g/L， MnS04 H20 1. Og/L， ZnS04 7H201. Og/L， CuS04 5H20 2. Og/L， CaCl2 2H20 13g/L)。培養基配制完成 后，用氫氧化鈉調節PH值至5. 0，滅菌后備用。
取一塊瓊脂平板菌種，用打孔器打下直徑約lOmm含菌絲體的固體培養基薄片，取 2-3片加入液體種子培養基，3(TC靜置4-6天。待菌絲體在培養基上方形成白色菌蓋但尚未 完全浮出液面，全部移入裝有玻璃珠的容器，進行震蕩破碎，獲得含有菌絲碎片的懸濁液。 將混勻的菌懸液按15%的接種量接入發酵培養基中，培養1-5天，稱取菌絲體絕干重。發現 菌絲體產量的變化趨勢與實施例1類似，同樣高于對照培養基(葡萄糖)菌絲體產量，且處
于上升趨勢。
實施例4 玉米稈水解液生產菌絲體并誘導合成草酸脫羧酶(培養基初始pH值5. 0)
任取實施例1 3培養4 6天的菌絲，加入終濃度為5-20mM的草酸，誘導0. 5_6 天后，收取菌絲體，保存發酵液，將菌絲體液氮冷凍研磨破碎后，用0. 2M， pH 3. 7的醋酸緩 沖液提取菌絲碎片，離心去除殘渣，上清即為粗酶液。殘渣烘至絕干稱重，上清測定草酸脫 羧酶活力(圖2)及酶液蛋白含量(圖3)，發酵液測定殘留還原糖濃度(圖4)。
對照組采用葡萄糖培養基，培養方法相同，在培養彩絨革蓋菌4天后，加入終濃度 為5-20mM的草酸，誘導0. 5至5天后，收取菌絲體，保存發酵液，將菌絲體液氮冷凍研磨破 碎后，用0. 2M， pH 3. 7的醋酸緩沖液提取菌絲碎片，離心去除殘渣，上清即為粗酶液。殘渣 烘至絕干稱重，上清測定草酸脫羧酶活力(圖2)及酶液蛋白含量(圖3)，發酵液測定殘留 還原糖濃度(圖4)。
權利要求
一種玉米稈碳源培養彩絨革蓋菌誘導草酸脫羧酶的方法，包括(1)將粉碎的玉米稈按照固液比為1g∶5-15ml用酸溶液浸泡10-20h，在100-150℃條件下水解反應20-60min，離心去除殘渣后，得到玉米稈水解液，并用DNS法測定水解液中還原糖含量；(2)按7-30g/L的還原糖量，將玉米稈水解液配制發酵培養基，調節pH值為4.0-5.0，過濾除去雜質，并添加氮源和無機鹽獲得發酵培養基，再檢查并調節pH值至4.0-5.0，滅菌后備用；(3)取2-3片直徑為9～11mm含菌絲體的瓊脂培養基，接入液體種子培養基，在30℃靜置培養4-6天；待菌絲體在液體培養基上方形成白色菌絲群但尚未浮出水面時，將菌絲體和培養基全部轉移到含有無菌玻璃珠的容器中，對菌絲體進行震蕩破碎獲得含有菌絲碎片的懸濁液，以3-15％的接種量接入發酵培養基，在20-30℃和100-250rpm轉速條件下培養4-6天；(4)待菌絲球形成時，加入終濃度為5-20M的草酸誘導草酸脫羧酶的產生，培養0.5-6天后獲取菌絲體；菌絲體經液氮冷凍后研磨破碎，用0.2M，pH 3.7的醋酸緩沖液提取菌絲碎片，離心去除殘渣，所得上清液即為草酸脫羧酶粗酶液。
2. 根據權利要求1所述的一種玉米稈碳源培養彩絨革蓋菌誘導草酸脫羧酶的方法，其 特征在于所述步驟(1)中的酸為硫酸、鹽酸或醋酸，質量百分比濃度為0. 5% -8%。
3. 根據權利要求1所述的一種玉米稈碳源培養彩絨革蓋菌誘導草酸脫羧酶的方法，其 特征在于所述步驟(2)用氫氧化鈉溶液調節pH值。
4. 根據權利要求1所述的一種玉米稈碳源培養彩絨革蓋菌誘導草酸脫羧酶的方法，其 特征在于所述步驟(2)中的發酵培養基中組分為玉米稈水解物中的還原糖7-30g，蛋白 胨3. Og， KH2P04 1. Og， Na2HP04 12H20 0. 2g，MgS04 7H20 0. 5g以及微量元素lml，用水定容 至1L。
5. 根據權利要求4所述的一種玉米稈碳源培養彩絨革蓋菌誘導草酸脫羧酶的方法，其 特征在于所述的微量元素的組分為FeS04 *7H20 10g，MnS04 *H20 1. 0g，ZnS04 *7H20 1. Og， CuS04 5H20 2. Og， CaCl2 2H20 13g，用水定容至1L。
6. 根據權利要求1所述的一種玉米稈碳源培養彩絨革蓋菌誘導草酸脫羧酶的方法，其 特征在于所述步驟(3)中的液體種子培養基，以葡萄糖代替發酵培養基中的還原糖，其余 組分與發酵培養基相同。
全文摘要
本發明涉及一種玉米稈碳源培養彩絨革蓋菌誘導草酸脫羧酶的方法，包括(1)將粉碎的玉米稈用酸溶液浸泡，在100-150℃條件下水解；(2)配制發酵培養基，調節pH值為4.0-5.0；(3)取菌絲體接入液體種子培養基，待形成白色菌絲群但尚未浮出水面時，將菌絲體和培養基全部轉移到含有無菌玻璃珠的容器中，震蕩破碎，以3-15％的接種量接入發酵培養基；(4)培養4-6天，加入草酸，培養0.5-6天后獲取菌絲體；菌絲體經液氮冷凍后研磨破碎，用醋酸緩沖液提取菌絲碎片，離心。本發明方法簡單，易于操作，成本低，且碳源的制備可控性強，含糖量穩定。
文檔編號C12N9/88GK101735995SQ20091020093
公開日2010年6月16日 申請日期2009年12月25日 優先權日2009年12月25日
發明者曹張軍, 楊光, 楊雪霞, 洪楓 申請人:東華大學