專利名稱：一種從生物樣品中快速分離病毒核酸的試劑盒及方法
技術領域：
本發明涉及從生物樣品中分離核酸的方法。具體而言，本發明提供了一種從無細 胞生物樣品中快速純化病毒核酸的試劑盒及方法。
背景技術：
目前，在生物醫學的很多研究領域都離不開核酸純化。從生物材料中高效、簡便地 分離純化得到完整、高純度的目標核酸則是研究病毒性疾病的基礎。傳統的核酸純化方法步驟繁瑣，耗時長，提取效率低，已經很難滿足高通量的實驗 需求。同時傳統方法使用酚/氯仿等試劑對人體產生巨大毒害作用且污染環境。磁珠在外 加磁場的作用下可快速地分離核酸，簡單、快捷、成本低廉且安全。目前已有很多公司生產出專門為核酸磁性分離純化而設計的配套自動化系統，這 些儀器使得磁珠法純化核酸實現了自動化，極大地提高了樣品處理的通量，易于高通量的 篩選，同時也提高了提取操作的可重復性。而已商品化的磁珠法病毒核酸提取試劑盒價格 昂貴，且不同儀器之間通用性較差，迫切需要開發價格便宜、高效、穩定和簡便的病毒核酸 提取試劑盒。本發明中基于自動化核酸提取儀的磁珠法核酸純化試劑盒具有操作簡便快捷、省 時省力、成本低廉等特點。
發明內容
本發明的目的在于提供一種能夠從生物樣本中快速分離病毒核酸的試劑盒及方 法，并且適用于自動化核酸提取儀。該方法操作簡便，試劑盒成本低廉，所提取的核酸完整、 純度高，有助于后續實驗的進行。具體而言，本發明提供了一種通過磁性顆粒來純化病毒核酸的試劑盒，該試劑盒 包括以下組分(1)裂解緩沖液6M鹽酸胍，150mM Tris-HCl, 50mM EDTA, 200mM NaCl, 5% Triton, 0. 5mM DTT, pH 值=7. 4 ；(2)磁珠；(3)洗滌緩沖液 I :6M 鹽酸胍，IOOmM Tris-HCl, 500mM NaCl, 20mM EDTA, pH 值= 7.4；(4)洗滌緩沖液II 70%乙醇；(5)洗滌緩沖液III 水；(6)洗脫緩沖液10mM Tris-HCl, ImM EDTA, pH 8· 0。根據上述試劑盒進行病毒核酸提取，該方法的具體步驟包括(1)樣品裂解在含病毒的樣品中加入裂解緩沖液，使樣品中的病毒粒子裂解；(2)將步驟(1)得到的混合溶液中加入適量磁珠，樣品中的核酸與磁珠結合，然后 在外加磁場條件下進行分離，收集磁珠_核酸復合物；
(3)向步驟(2)得到的磁珠-核酸復合物中加入洗滌緩沖液I，去除未結合物質，然后在外加磁場條件下進行分離，收集磁珠_核酸復合物；(4)向步驟(3)得到的磁珠-核酸復合物中加入洗滌緩沖液II，去除雜質，然后在 外加磁場條件下進行分離，收集磁珠_核酸復合物；(5)向步驟(4)得到的磁珠-核酸復合物中加入洗滌緩沖液III，然后在外加磁場 條件下進行分離，收集磁珠_核酸復合物；(6)向步驟(5)得到的磁珠-核酸復合物中加入洗脫緩沖液，將結合在磁珠上的核 酸洗脫下來，回收上清液即為純化的病毒核酸。本方法中，生物樣品應該無細胞成分，最好是血漿或血清。如果從細胞培養物中獲 取病毒，需要從培養基中取出培養的細胞，留下無細胞的上清液。本發明所提取的核酸可以直接進行PCR及RT-PCR等分子生物學實驗研究及臨床 檢測。本試劑盒可用配合自動化儀器，高通量提取病毒核酸。
圖1為病毒含量與Ct值的相關性曲線。
具體實施例方式本發明提供了 一種直接用于快速純化病毒核酸的試劑盒及方法。本發明中所述核酸包括RNA和DNA。本發明中核酸提取試劑盒包括以下組分裂解緩沖液6Mguanidine,150mM Tris-HCl,50mM EDTA,200mM NaCl，5 % Triton, 0. 5mM DTT, pH 值=7. 4 ;磁珠；洗滌緩沖液I :6M guanidine, IOOmM Tris-HCl, 500mM NaCl,20mM EDTA, pH 值= 7.4；洗滌緩沖液II 70%乙醇；洗滌緩沖液II I:水；洗脫緩沖液10mMTris-HCl, ImM EDTA, pH 8· 0。(1)取含病毒的血清樣品100μ 1置于離心管內，加入裂解緩沖液100μ 1，充分混 勻，55 °C放置10分鐘。(2)向上述混合液中加入20 μ 1磁珠懸浮液(用前充分搖勻)，充分混勻，室溫下 柔和混勻10分鐘。(3)將離心管置于磁力架上，磁力分離30秒，吸棄上清。(4)加入250 μ 1洗滌緩沖液I，振蕩使磁珠充分懸浮，1分鐘后磁力分離，吸棄上清。(5)加入250 μ 1洗滌緩沖液II，振蕩使磁珠充分懸浮，1分鐘后磁力分離，吸棄上清。(6)離心管仍置于磁力架上，并保證磁珠被吸附，加入300 μ 1洗滌緩沖液III，1分鐘后移走洗滌緩沖液III。
(7)加入50 μ 1洗脫緩沖液，輕彈使磁珠懸浮，60°C水浴10分鐘，其間輕輕晃動使 核酸洗脫出來。(8)將離心管置于磁力架1分鐘，將洗脫液轉移至干凈的離心管。磁力分離30-60 秒，使磁珠被吸附，吸取洗脫液到新的離心管中。洗脫液即為純化的病毒核酸。本發明提供了一種提取完整、高純度病毒核酸的試劑盒及方法，該試劑盒成本低 廉、操作簡便，可配合自動化儀器，快速高通量提取病毒核酸。所提取的核酸可直接用于后 續PCR或RT-PCR及基因克隆等分子生物學實驗研究及臨床檢測。實施例1 :HEVRNA的提取取含有HEV的血清樣品，進行10倍梯度稀釋，然后用本試劑盒提取HEV RNA,同時 用Chemagen的病毒核酸提取試劑盒作為對照。按照下述操作步驟提取HEV RNA (1)取經梯度稀釋的含HEV血清樣品100 μ 1置于離心管內，加入5ul (20 μ g/μ 1) ProteinaseK、裂解緩沖液100 μ 1，充分混勻，55°C放置10分鐘。(2)向上述混合液中加入20 μ 1磁珠懸浮液(用前充分搖勻)，充分混勻，室溫下 柔和充分混勻10分鐘。(3)將離心管置于磁力架上，磁分離30秒，吸棄上清。(4)加入250μ 1洗滌緩沖液I，振蕩使磁珠充分懸浮，1分鐘后用磁力架分離，吸棄上清。(5)加入250 μ 1洗滌緩沖液II，振蕩使磁珠充分懸浮，1分鐘后用磁力架分離，吸
棄上清。(6)離心管仍置于磁力架上，并保證磁珠被吸附，從離心管的另一側緩慢加入 300 μ 1洗滌緩沖液III，盡量不要沖起磁珠，1分鐘后移走洗滌緩沖液III。(7)加入50 μ 1洗脫緩沖液，輕彈使磁珠懸浮，60°C水浴10分鐘，其間輕輕晃動使 RNA洗脫出來。(8)將離心管置于磁力架1分鐘，將洗脫液轉移至干凈的離心管。磁力分離30-60 秒，使磁珠被吸附，吸取洗脫液到新的EP管中，即為純化的RNA。取上述RNA提取液2μ 1作為模板，進行熒光定量PCR檢測。檢測結果見下表和圖
Io
~病毒含量Ct值 (copies/ml)— 本試劑盒對比試劑盒IQ4 —21.0~21.3
IO3__2A5__2ΑΛ_
IO227.228.0表中為不同稀釋度時RNA的熒光定量PCR Ct值。Ct值越低，核酸量及純度越高。
權利要求
1.一種可自動化提取病毒核酸的試劑盒，其特征在于包括以下組分(1)裂解緩沖液6M鹽酸胍，150mM Tris-HCl, 50mM EDTA, 200mM NaCl,5% Triton, 0. 5mM DTT, pH 值=7. 4 ；(2)磁珠；(3)洗滌緩沖液I :6M 鹽酸胍，IOOmM Tris-HCl, 500mM NaCl, 20mM EDTA, pH 值=7. 4 ；(4)洗滌緩沖液II:70%乙醇;(5)洗滌緩沖液III水；(6)洗脫緩沖液10mMTris-HCl, ImM EDTA, pH 8· 0。
2.一種根據權利要求1所述試劑盒進行病毒核酸提取的方法，其特征在于具體步驟包括(1)樣品裂解在含病毒的樣品中加入裂解緩沖液，使樣品中的病毒粒子裂解；(2)將步驟(1)得到的混合溶液中加入適量磁珠，樣品中的核酸與磁珠結合，然后在外 加磁場條件下進行分離，收集磁珠-核酸復合物；(3)向步驟( 得到的磁珠-核酸復合物中加入洗滌緩沖液I，去除未結合物質，然后 在外加磁場條件下進行分離，收集磁珠-核酸復合物；(4)向步驟C3)得到的磁珠-核酸復合物中加入洗滌緩沖液II，去除雜質，然后在外加 磁場條件下進行分離，收集磁珠-核酸復合物；(5)向步驟(4)得到的磁珠-核酸復合物中加入洗滌緩沖液III，然后在外加磁場條件 下進行分離，收集磁珠-核酸復合物；(6)向步驟( 得到的磁珠-核酸復合物中加入洗脫緩沖液，將結合在磁珠上的核酸洗 脫下來，回收上清液即為純化的病毒核酸。
3.根據權利要求2所述的方法，其中病毒核酸為DNA或RNA。
全文摘要
一種從生物樣品中快速分離病毒核酸的試劑盒及方法，從無細胞生物樣品中快速分離病毒核酸。本發明的試劑盒包括裂解緩沖液、磁珠、洗滌緩沖液、洗脫緩沖液。方法是將生物材料進行裂解，使磁珠與核酸形成復合物，在外加磁場作用下進行分離，并洗滌去除雜質，然后洗脫回收核酸。本方法提取核酸操作簡便、安全，成本低廉，核酸完整、純度高，可直接用于后續實驗。可配合自動化核酸提取儀器進行高效的病毒核酸提取，也可用于手工操作提取核酸。
文檔編號C12N15/10GK102071186SQ20091022390
公開日2011年5月25日 申請日期2009年11月19日 優先權日2009年11月19日
發明者趙海峰 申請人:北京金麥格生物技術有限公司