專利名稱：LE Green混合染料及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及雙鏈核苷酸檢測技術，具體涉及一種LE Green混合染料，本發明還涉 及采用LE Green染料Mix定量檢測DNA的方法。
背景技術：
目前定量檢測DNA的方法有分光光度法，檢測260nm處的吸光值，DNA含量二 0D260 X 50 g/ml ，但此方法操作比較復雜，而且誤差較大；另一種常用方法是利用溴化乙 錠結合DNA分子，在紫外光激發下產生紅色熒光，熒光強度與DNA量成正比，利用標準曲線， 可對進行DNA定量分析，由于溴化乙錠是致癌物質，不宜推廣。 目前人們改用SYBR Green I和SYBR Gold為染料的熒光定量檢測DNA。由于這兩 種熒光染料只與DNA雙鏈結合，在與DNA雙鏈結合后發出熒光，熒光強度與DNA雙鏈產物量 成正比，可根據標準曲線，進行DNA定量分析。但由于一般染料不穩定，高溫降解，見光易分 解，發射光的光譜寬，光穩定性差，檢測本底高，準確度較低，也不宜推廣。為此必須尋找一 種能快速、高效、安全的定量檢測DNA的方法。 LC Green是綠色熒光核酸染料，激發波長為440 470nm，發射波長為470 520nm， LC Green熒光染料特異性的與DNA雙鏈結合后，在激發波長作用下能夠產生強烈的 熒光，這種特性使它特別適合于常規的DNA濃度確定。在實驗過程中，需要加入的濃度很 少，可以降低實驗成本。同時，LC Green染料與DNA結合后對PCR反應無任何抑制作用，但 其它染料，如SYBR Green I對PCR有抑制作用，所以對后續實驗有一定的影響。LC Green 在高溫條件下不易分解，熱穩定性良好，且與DNA結合穩定，為常規操作提供了便利。
Eva Green也是一種綠色熒光核酸染料，當染料和DNA結合后，其激發和發射光譜 與熒光素以及LC Green相似。這使得這兩種染料可以直接采用配置了 488nm氬離子激光 器或者此光譜區域內任何可見光激發裝置的儀器檢測。Eva Green有良好的熱穩定性和水 解穩定性；其本身沒有熒光，但和雙鏈DNA結合后能發出高亮度的熒光，這種特性使它非常 適合于常規DNA濃度的確定。Litron獨立實驗室(Litron Laboratories, Rochester, NY) 進行的艾姆斯氏測試結果表明，Eva Green沒有誘變性和細胞毒性。實驗顯示，Eva Green 完全沒有細胞膜透性，這可能是觀察到低毒性的關鍵因素。然而將Eva Green染料用于雙 鏈核酸的檢測手段仍不健全，在實際應用中難以取得好的染色效果。為此必須尋找一種能 快速、高效、安全的定量檢測雙鏈核酸如基因組DNA的方法。
發明內容
本發明的目的在于針對上述不足提供一種簡單、快速、特異性強、靈敏度高的核酸 染料，以及采用該染料定量檢測雙鏈核酸如基因組DNA的方法。 本發明將LC Green和Eva Green按比例稀釋成LE Green染料Mix利用LE Green 與雙鏈DNA結合產生熒光，且熒光的強度與DNA的量成正相關性來定量檢測雙鏈核酸如基 因組DNA，通過將LEGreen染料Mix與待測雙鏈核苷酸溶液混合避光室溫孵育，檢測其熒光
3強度，通過與標準曲線進行比對，得到待測雙鏈核苷酸溶液的濃度。 其中，LE Green染料溶液Mix的配制方案是 Na2HP04 0 . 01 0. 03mol/L NaH2P04 0 . 01 0. 03mol/LNaCl 0. 15 0. 25mol/L EDTA 2Na 1. 5 3. 5,1/L PVP 0.05-0. 20%TritonX-100 0.05-0.15% Eva Green 2. 0 4. 0 u mol/L LC Green 1. 0 3. 0 u mol/L 甘油 3 8% 最后用磷酸調pH至7.0 7. 5 其余為雙蒸水。 所述LE Green染料溶液Mix的配制優選方案為 Na2HP04 0 . 02mol/L NaH2P04 0 . 02mol/L NaCl 0. 20mol/L EDTA 2Na 2. 5,1/L PVP 0. 1 % TritonX-1000. 1% Eva Green 3. On mol/L LC Green 2. On mol/L 甘油 5% 最后用磷酸調pH至7. 3 其余為雙蒸水。 可采用Modulus多功能光度計、熒光酶標儀或實時定量PCR儀檢測熒光信號。
本發明所述的雙鏈核苷酸包括基因組DNA或其片斷、質粒DNA或其片斷以及人工 雙鏈序列。 以Modulus多功能光度計為例，利用LE Green混合染料對雙鏈核酸進行精確定 量，具體可包括如下步驟 1)將DNA標準品和未知樣品配制成系列濃度的50 L溶液，在每個溶液中加入 50iiL LE Green Mix，充分混合。 2)在Modulus多功能光度計上選擇藍色模塊，先測DNA標準物質的熒光值，建立標 準曲線。 3)然后對未知樣品DNA進行檢測，Modulus直接得出濃度值。
將LC Green和Eva Green按比例混合稀釋為LE Green混合染料可以在Modulus 的藍色模塊中定量雙鏈核酸的濃度，兩種染料可以優勢互補，應用LE Green染料Mix能對 至少100 ii 1樣品的雙鏈DNA直接定量。Modulus多功能光度計的檢測靈敏度為100 樣 品中50pg的DNA。即使在核酸制備過程中引入了鹽、尿素、乙醇、氯仿、去污劑、蛋白或瓊脂等常見的幾種污染物，這種檢測結果的線性仍能獲得。實驗檢測中的RNA和單鏈DNA產生 的熒光量極小，當用LEGreen染料Mix和Modulus多功能光度計進行實驗時發現相同克分 子數的單鏈DNA和RNA對定量結果幾乎沒有什么影響。
本發明所述方法的優點 1)采用LE Green染料Mix定量檢測DNA的方法操作簡單，快速。它對所有樣品的 DNA定量具有廣泛的適應性。 2)采用LE Green染料Mix定量檢測DNA的方法具有較高的靈敏度，可以檢測出 pg級的DNA模板。 3)采用LE Green染料Mix定量檢測DNA的方法操作對所有樣品的DNA定量具有 廣泛的適應性。即使在核酸制備過程中引入了鹽、尿素、乙醇、氯仿、去污劑、蛋白或瓊脂等 常見的幾種污染物，這種檢測結果的線性仍能獲得。
圖1小牛胸腺DNA濃度與熒光值標準曲線圖。
圖2小牛胸腺雙鏈核酸濃度靈敏度曲線圖。
具體實施方案 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用于說明本發明而不 用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件， 例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1基因組DNA的制備 以植物為例，采用CTAB法提取基因組DNA，稱取200mg經預處理的試樣，在液氮中 充分研磨后裝入液氮預冷的1. 5mL或2mL離心管中(不需研磨的試樣直接加入)。加入lmL 預冷至4°C的抽提液，劇烈搖動混勻后，在冰上靜置5min， fC條件下10000g離心15min，棄 上清液。加入600 ii L預熱到65°C的裂解液，充分重懸沉淀，在65t:恒溫保持40min，期間顛 倒混勻5次。室溫條件下，10000g離心10min，取上清液轉至另一新離心管中。加入L RNaseA，37。C恒溫保持30min。分別用等體積酚氯仿異戊醇(25 : 24 : 1)，反復抽提 兩次，再用氯仿/異戊醇(24 : l)抽提一次。室溫條件下，10000g離心10min，取上清液轉 至另一離心管中。加入2/3體積異戊醇，1/10體積3mol/L乙酸鈉溶液(pH5. 6) ，-20。C放置 2-3h。在4t:條件下，10000g離心15min，棄上清液，用70%乙醇洗滌沉淀一次，倒出乙醇， 晾干沉淀。加入50 ii L TE (pH8. 0)溶解沉淀，所得溶液即為樣品DNA溶液。
實施例2LE Green染料Mix制備與使用方法 LE Green染料Mix溶液的配方1如下Na2HP04 0 . 02mol/L ;NaH2P04 0 . 02mol/ L;NaCl 0.20mol/L ;EDTA 2Na 2.5mmol/L ;PVPO. 1 % ;TritonX-lOO 0. 1 % ;Eva Green 3. 0 ii mol/L ;LC Green 2. 0 y mol/L ;甘油5% ;最后用磷酸調pH至7. 3 ;其余為雙蒸水。
LE Green染料Mix溶液的配方2如下:Na2HP04 0. Olmol/L ;NaH2P04 0. Olmol/L ; NaCl 0.15mol/L ;EDTA 2Na 1.5mmol/L ;PVP 0. 05 % ;TritonX-lOO 0. 05 % ;Eva Green 2. 0 ii mol/L ;LC Green 1. 0 y mol/L ;甘油3% ;最后用磷酸調pH至7. 0 ;其余為雙蒸水。
LE Green染料Mix溶液的配方3如下Na2HP04 0 . 03mol/L ;NaH2P04 0 . 03mol/ L ;NaCl 0.25mol/L ;EDTA 2Na 3. 5mmol/L;PVPO. 2 % ;TritonX-lOO 0. 15 % ;Eva Green 4. 0 ii mol/L ;LC Green 3. 0 y mol/L ;甘油8% ;最后用磷酸調pH至7. 5 ;其余為雙蒸水。
LE Green濃縮染料是LC Green和Eva Green染料混合后的Mix溶液。溶液制備 需用塑料器皿不能用玻璃器皿，因為試劑中某些成分會吸附到玻璃器皿表面。用箔金紙包 裹或放置黑暗處避光保存。 注溶液在制備后數小時內使用檢測結果會比較好。實施例3DNA標準溶液、空白 對照液和樣品DNA溶液的制備 標準溶液的制備。小牛胸腺DNA常用來做標準曲線，制備濃度為400ng/mL的溶液。 將等體積的小牛胸腺DNA儲存液加入到的LEGreen Mix工作液中，充分混合，標準液最終濃 度200ng/ml。 空白對照液的準備。加入相同體積的樣品緩沖液到LE Green Mix工作液中，充分 混合。 樣品DNA溶液的準備。加入相同體積的樣品到LE Green Mix工作液中，充分混合。
實施例4基因組DNA樣品測定
1)建立標準曲線將終濃度濃度為12. 5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、 100ng/mL、200ng/mL的標準DNA溶
液轉到100 ill微量檢測皿中，避光室溫孵育2-5min，注意轉移過程中不要引入氣泡。點擊
"MeasureFluorescence"，樣品最終結果會顯示在功能機顯示屏上，圖1為小牛胸腺DNA濃
度與熒光值標準曲線圖。 2)校準Modulus多功能光度計 以Modulus多功能光度計為例，采用用150ng/ml標準DNA進行校準。 注單點校準精確度會更高，用一個和檢測樣品濃度相同或相近的標準樣優化系
統，例如，若檢測樣品濃度在100ng/ml，要用一個50 150ng/ml標準DNA樣。保存這次校
準以供將來使用。 3)樣品分析 樣品加入100 ii 1微量檢測皿中，點擊"Measure Fluorescence",樣品最終結果會 顯示在功能機顯示屏上，采用LE Green染料Mix溶液的配方1、配方2、配方3，測得基因組 DNA的濃度分別為155ng/ml， 163ng/ml， 159ng/ml。
實施例5準確度測定 制備小牛胸腺DNA濃度為300ng/ml的溶液。將等體積的小牛胸腺DNA儲存液加 入到的LE Green Mix工作液中，充分混合，標準液最終濃度150ng/ml。采用上述方法測定， 最終測得濃度(三次平均值)為149.8ng/ml。
實施例6靈敏度測定 制備小牛胸腺DNA濃度為6. 4ng/ml的溶液。梯度稀釋成濃度為3. 2ng/ml、l. 6ng/ ml、0. 8ng/ml、0. 4ng/ml的溶液，將等體積的小牛胸腺DNA儲存液加入到的LE Green Mix 工作液中，充分混合，終濃度為3. 2ng/ml、l. 6ng/ml、0. 8ng/ml、0. 4ng/ml、0. 2ng/ml。經 Modulus多功能光度計測定，得到圖2小牛胸腺雙鏈核酸濃度靈敏度曲線圖，靈敏度可達到 0. 4ng/ml (低于0. 4ng/ml，讀數接近于0)。
權利要求
一種LE Green染料溶液Mix，其含有下列組分Na2HPO4 0.01～0.03mol/LNaH2PO4 0.01～0.03mol/LNaCl 0.15～0.25mol/LEDTA·2Na 1.5～3.5mmol/LPVP 0.05-0.20％TritonX-100 0.05-0.15％Eva Green 2.0～4.0μmol/LLC Green 1.0～3.0μmol/L甘油 3～8％最后用磷酸調pH至7.0～7.5其余為雙蒸水。
2. 如權利要求1所述的LE Green染料溶液Mix,其含有下列組分 Na2HP04 0 . 02mol/LNaH2P04 0 . 02mol/LNaCl 0. 20mol/LEDTA 2Na2. 5,1/L PVP 0. 1 %TritonX-100 0.1% Eva Green3. Oumol/L LC Green 2. O踐ol/L甘油 5% 最后用磷酸調pH至7.3 其余為雙蒸水。
3. 權利要求1或2所述LE Green染料溶液Mix在雙鏈核苷酸定量檢測中的應用。
4. 一種雙鏈核苷酸定量檢測的方法，其包括步驟用權利要求1或2所述的采用LE Green染料Mix與待測雙鏈核苷酸溶液混合避光室溫孵育，檢測其熒光強度，通過與標準曲 線進行比對，得到待測雙鏈核苷酸溶液的濃度。
5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，孵育時間為2 5min。
6. 如權利要求4或5所述的方法，其特征在于，還包括將所述待測雙鏈核苷酸溶液配制 成系列濃度的樣品，然后分別與LE Green染料溶液Mix混合孵育。
7. 如權利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述標準曲線是以小牛胸腺DNA為標準 物建立。
8. 如權利要求4或5所述的方法，其特征在于，采用Modulus多功能光度計、熒光酶標 儀或實時定量PCR儀檢測熒光信號。
9. 如權利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述雙鏈核苷酸為基因組DNA或其片 斷、質粒DNA或其片斷或人工雙鏈序列。
全文摘要
本發明提供了LE Green混合染料及其在雙鏈核酸檢測中的應用。本發明核酸染料是由LC Green和Eva Green與適當的稀釋液配置而成。將雙鏈核酸模板(基因組DNA，質粒DNA等)與合適濃度的熒光染料LE Green Mix混合，利用Modulus分光光度計、熒光酶標儀、實時定量PCR儀等熒光檢測儀器對染料與純化的雙鏈核酸結合后所產生的熒光強度進行定量檢測。本發明和傳統的雙鏈核酸紫外測定法相比更快速、準確、穩定。且較一般的雙鏈核酸熒光測定方法特異性強，靈敏度高，能夠快速對雙鏈核酸如基因組DNA進行定量檢測。
文檔編號C12Q1/68GK101724295SQ20091024148
公開日2010年6月9日 申請日期2009年12月3日 優先權日2009年12月3日
發明者商穎, 張南, 白衛濱, 石慧, 羅云波, 許文濤, 黃昆侖 申請人:中國農業大學