Vsig4和igrp雙基因共表達重組腺病毒及其制備方法和應用的制作方法

專利名稱：Vsig4和igrp雙基因共表達重組腺病毒及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種重組腺病毒，特別涉及一種VSIG4和IGRP雙基因共表達重組腺病 毒，還涉及該重組腺病毒的制備方法和應用。
背景技術：
1型糖尿病是一種自身免疫性疾病，由于身體的免疫系統攻擊胰島β細胞破壞其 分泌胰島素的能力而引起。目前主要依賴胰島素和胰島移植進行治療，雖然能夠降低患者 的死亡率，卻存在著大量副作用。隨著研究的深入，實驗發現T細胞在免疫系統介導的1型 糖尿病的發病過程中發揮了重要作用，特異性誘導T細胞介導的免疫耐受對1型糖尿病是 一種很有希望的治療策略。在T細胞介導的免疫應答中，T細胞的活化不僅需要抗原肽與主要組織相容性復 合體(MHC)的復合刺激，而且需要Β7家族成員提供關鍵的共刺激信號。含V-set和免疫球 蛋白域4(V-set and Ig domain containing 4，VSIG4)又稱補體受體免疫球蛋白超家族分 子(Complement receptor of the immunoglobulin superfamily, CRIg),是一禾中新發現的 B7家族相關蛋白。VSIG4的mRNA高表達于成人肺、胎盤、肝和心臟等組織，但VSIG4主要局 限表達于巨噬細胞，在單核細胞中幾乎沒有表達，并且當巨噬細胞受外來刺激活化后VSIG4 表達下調。既往研究發現，VSIG4是巨噬細胞上的補體受體，可結合補體C3的降解片段C3b 和iC3b，對于病原體的吞噬起重要作用。最近研究顯示，VSIG4有抑制T細胞活化的作用， 且作用強于PD-Ls/PD-Ι途徑，是一個有力的T細胞活化負調節分子。葡萄糖-6-磷酸酶催化亞基相關蛋白(IGRP)是一種胰島特異性T細胞自身抗原， 在1型糖尿病的發病過程中起著非常關鍵的作用，患者體內有大量的IGRP特異性T細胞存 在。因此，在1型糖尿病的治療中，IGRP有可能成為誘導免疫耐受的重要分子。基因聯合治療的方式主要有兩種一是將多種分別攜帶不同基因的重組表達載體 同時轉染靶細胞，這種方式可以自由調節各重組表達載體的比例，但需要分別構建攜帶不 同基因的重組表達載體，構建工作繁瑣、費時，影響因素多；此外，由于轉染過程具有一定隨 機性，轉染后的細胞存在基因拷貝不均一的問題，既不利于目的基因的表達及后續治療，又 導致實驗結果難于評估分析；上述缺點限制了此種方式的進一步應用。二是將兩個或兩個 以上的基因由一個載體攜帶表達，這種方式可以通過多啟動子載體、多順反子載體或融合 基因等調控手段提高基因轉染效率，增加表達強度，并維持相對的表達比例，從而克服了前 一種方式的不足，近年來日益受到研究者的重視。樹突狀細胞不僅是機體內功能最強大的抗原遞呈細胞，可以有效激活初始T細胞 啟動免疫應答反應，而且樹突狀細胞本身具有調節免疫反應、誘導免疫耐受的作用。體外構 建攜帶免疫抑制分子基因的重組病毒并轉染樹突狀細胞制成樹突狀細胞疫苗，再將其回輸 體內，已廣泛應用于誘導免疫耐受等方面的治療。

發明內容
有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種VSIG4和IGRP雙基因共表達重組腺病 毒，能夠有效誘導特異性T細胞耐受，并有效抑制胰島β細胞的破壞；目的之二在于提供所 述VSIG4和IGRP雙基因共表達重組腺病毒的制備方法；目的之三在于提供所述VSIG4和 IGRP雙基因共表達重組腺病毒的應用。為達到上述目的，本發明采用如下技術方案
1、VSIG4和IGRP雙基因共表達重組腺病毒，所述重組腺病毒基因組中包含一個 VSIG4和IGRP雙基因表達盒，所述VSIG4和IGRP雙基因表達盒由上游至下游依次包含CMV 啟動子、VSIG4全長編碼基因、終止子、內部核糖體進入位點IRES、IGRP全長編碼基因和終止子。2、所述VSIG4和IGRP雙基因共表達重組腺病毒的制備方法，包括以下步驟
a、RT-PCR 擴增 VSIG4 全長 cDNA ；b、RT-PCR 擴增 IGRP 全長 cDNA ；C、將步驟a所得VSIG4全長cDNA插入pStar載體的IRES上游，步驟b所得IGRP 全長cDNA插入pStar載體的IRES下游，得重組載體pStar_VSIG4-IRES_IGRP ；d、以步驟c所得重組載體pStar-VSIG4-IRES_IGRP為模板，PCR擴增 VSIG4-IRES-IGRP片段并更換該片段兩端的酶切位點；e、將步驟d所得VSIG4-IRES-IGRP片段插入腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV的CMV 啟動子下游，得重組腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-VSIG4-IRES-IGRP ；f、將步驟e所得重組腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-VSIG4-IRES-IGRP與腺 病毒骨架載體PAdEasy-I在大腸桿菌BJ5183中進行胞內同源重組，得重組腺病毒載體 pAd-VSIG4/IGRP ；g、將重組腺病毒載體pAd-VSIG4/IGRP在293細胞中包裝成重組腺病毒Ad-VSIG4/ IGRP。進一步，步驟a的具體方法為提取人肺組織總RNA，反轉錄得到總cDNA，再以巢 式PCR擴增VSIG4全長cDNA 第一輪PCR以所得總cDNA為模板，以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示序列為上下游引物；第二輪PCR以第一輪PCR產物為模板，以SEQ ID No. 3和 SEQ ID No. 4所示序列為上下游引物；每輪PCR的循環條件參數為94°C預變性5分鐘；然 后94°C變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30個循環；最后72°C延伸10分鐘； PCR產物經純化后克隆入pT-Easy載體，得重組載體pT_VSIG4 ；進一步，步驟b的具體方法為提取人胰腺組織總RNA，反轉錄得到總cDNA，再以該 總cDNA為模板，以SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 7所示序列為上下游引物，PCR擴增IGRP全 長cDNA，PCR循環條件參數為94°C預變性5分鐘；然后94°C變性50秒，58°C退火50秒， 72°C延伸2分鐘，共30個循環；最后72°C延伸10分鐘；PCR產物經純化后克隆入pT-Easy 載體，得重組載體pT-IGRP;進一步，步驟c的具體方法為自重組載體pT-VSIG4中用Pst I和EcoR I雙 酶切出VSIG4全長cDNA，經純化后與同樣用Pst I和EcoR I雙酶切的pStar載體連接， 得重組載體pStar-VSIG4 ；再自pT-IGRP載體中用BamH I和Sal I雙酶切出IGRP全長 cDNA，經純化后與同樣用BamH I和Sal I雙酶切的pStar_VSIG4載體連接，得重組載體pStar-VSIG4-IRES-IGRP ；進一步，步驟d的具體方法為以重組載體pStar-VSIG4-IRES-IGRP為模板，以SEQ ID No.9和SEQ ID No. 10所示序列為上下游引物進行PCRjf VSIG4-IRES-IGRP片段兩端 的酶切位點更換為Sal I酶切位點和Not I酶切位點，PCR循環條件參數為94°C預變性5 分鐘；然后94°C變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30個循環；最后72°C延伸 10分鐘；PCR產物經純化后克隆入ρΤ-Easy載體，得重組載體pT_VSIG4-IRES_IGRP ；進一步，步驟e的具體方法為自重組載體pT-VSIG4-IRES-IGRP中用Sal I和Not I雙酶切出VSIG4-IRES-IGRP片段，經純化后與同樣用Sal I和Not I雙酶切的腺病毒穿梭 載體pShuttle-CMV連接，得重組腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-VSIG4-IRES-IGRP ；進一步，步驟f的具體方法為將重組腺病毒穿梭載體 pShuttle-CMV-VSIG4-IRES-IGRP用Pme I酶切線性化，再與腺病毒骨架載體pAdEasy-Ι同 時電轉化大腸桿菌BJ5183感受態細胞，進行胞內同源重組，得重組腺病毒載體pAd-VSIG4/ IGRP ；進一步，步驟g的具體方法為將人胚胎腎293細胞以40% 60%的細胞密度接 種至培養瓶中，待細胞生長至30 % 50 %融合時，采用Lipofectamine 2000試劑將重組腺 病毒載體pAd-VSIG4/IGRP轉染293細胞，待細胞出現明顯病變時離心收集細胞，用磷酸鹽 緩沖液重懸后，反復凍融使細胞裂解，離心去除細胞碎片，收集含病毒的上清液，即得重組 腺病毒 Ad-VSIG4/IGRP。3、所述VSIG4和IGRP雙基因共表達重組腺病毒在制備抗1型糖尿病的樹突狀細 胞疫苗中的應用。本發明的有益效果在于本發明將胰島特異性抗原IGRP與新型免疫抑制分子 VSIG4進行聯合表達，可以誘導IGRP特異性的淋巴細胞免疫耐受，使胰島細胞能局部性逃 逸免疫系統的識別和攻擊，而其他正常組織和器官不會受到影響。將本發明的VSIG4和 IGRP雙基因共表達重組腺病毒體外轉染樹突狀細胞再回輸糖尿病易患性NOD小鼠，結果發 現，本發明的重組腺病毒能夠降低糖尿病易患性NOD小鼠淋巴細胞的增殖能力和細胞因子 分泌能力，而且能夠延遲NOD小鼠糖尿病的發病時間并降低發病率，表明本發明的重組腺 病毒能夠有效誘導特異性T細胞耐受，并有效抑制胰島β細胞的破壞，可以用于制備抗1 型糖尿病的樹突狀細胞疫苗，在1型糖尿病治療領域具有良好的開發應用前景。同時，本發 明重組腺病毒的制備方法簡單，成本低。


為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進 一步的詳細描述，其中圖1顯示了 VSIG4全長cDNA PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果(1泳道為DNA分子 量標準，2泳道為PCR產物)；圖2顯示了 IGRP全長cDNA PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果(1泳道為DNA分子 量標準，2泳道為PCR產物)；圖3顯示了 VSIG4和IGRP雙基因共表達的免疫印跡(Western Blot)結果(1泳道 為Ad-VSIG4/IGRP病毒轉染樹突狀細胞總蛋白，2泳道為空病毒轉染樹突狀細胞總蛋白)；
圖4顯示了淋巴細胞增殖能力的檢測結果；圖5顯示了淋巴細胞分泌細胞因子能力的檢測結果；圖6顯示了 NOD小鼠糖尿病的平均發病率。
具體實施例方式以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。優選實施例中未注明 具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克 等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。一、重組腺病毒Ad_VSIG4/IGRP的制備1、VSIG4 全長 cDNA 的克隆按Trizol試劑盒說明書提取人肺組織總RNA，逆轉錄得到總cDNA，再以巢式PCR 法擴增VSIG4全長cDNA 第一輪擴增以所得總cDNA為模板，以Fl :5，-ggtagcaggaggctgga agaaag-3，(SEQ ID No. 1)禾口 Rl :5，-tcagcagatcctggcctaatgg-3‘ (SEQ ID No. 2)為上下 游引物；第二輪擴增以第一輪擴增產物為模板，以F2 :5’ -aatctgcaggccaccatggggatcttac tgggcctg-3，(SEQ ID No. 3，下劃線部分為 Pst I 酶切位點)和 R2 5‘-tacgaattcttaacaga cacttttgccctcag-3' (SEQ ID No. 4，下劃線部分為EcoR I酶切位點)為上下游引物；每輪 PCR體系為50 μ 1，循環條件參數為94°C預變性5分鐘；然后94°C變性50秒，58°C退火50 秒，72°C延伸2分鐘，共30個循環；最后72°C延伸10分鐘。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒 定、凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，與pT-Easy載體連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α 感受態細胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質粒，測序鑒定，將陽性克隆 質粒命名為pT-VSIG4。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示PCR產物在約1200bp處呈單一特異性條帶(圖1)，與預 期結果相符；測序結果顯示陽性克隆質粒的插入基因序列(SEQ ID No. 5)與GenBank登錄 號為NM_007268的VSIG4全長cDNA序列一致。2、IGRP 全長 cDNA 的克隆按Trizol試劑盒說明書提取人胰腺組織總RNA，逆轉錄得到總cDNA，再以該總 cDNA 為模板，以 F3 :5，gatc￡g^￡ccaagatgatatgggtagc-3，(SEQ ID No. 6，下劃線部分為 BamH I 酶切位點)和 R3 5' -acgc￡tcgactgtcaatgtggatccagtc-3' (SEQ IDNo. 7，下劃線部 分為Sal I酶切位點)為上下游引物，PCR擴增IGRP全長cDNA，PCR體系為50 μ 1，循環條 件參數為94°C預變性5分鐘；然后94°C變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30 個循環；最后72°C延伸10分鐘。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定、凝膠回收試劑盒切膠回 收純化后，與pT-Easy載體連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，用含有氨芐青 霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質粒，測序鑒定，將陽性克隆質粒命名為pT-IGRP。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示PCR產物在約IlOObp處呈單一特異性條帶(圖2)，與預 期結果相符；測序結果顯示陽性克隆質粒的插入基因序列(SEQ ID No. 8)與GenBank登錄 號為NM_021176的IGRP全長cDNA序列一致。3、重組載體 pStar-VSIG4-IRES_IGRP 的構建根據VSIG4和IGRP全長cDNA兩端所設計的酶切位點，首先將VSIG4全長cDNA 插入pStar載體的IRES上游，再將IGRP全長cDNA插入pStar載體的IRES下游。具體方法為先將PT-VSIG4載體用Pst I和EcoR I雙酶切，雙酶切產物經凝膠回收試劑盒切膠 回收純化后，與同樣經Pst I和EcoR I雙酶切的pStar載體連接，連接產物轉化大腸桿菌 DH5a感受態細胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質粒，Pst I和EcoR I 雙酶切鑒定，將陽性克隆質粒命名為pStar-VSIG4 ；再將pT_IGRP載體用BamH I和Sal I 雙酶切，雙酶切產物經凝膠回收試劑盒切膠回收純化后，與同樣經BamH I和Sal I雙酶切 的pStar-VSIG4載體連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，用含有氨芐青霉素 的LB平板篩選陽性克隆，提取質粒，BamH I和Sal I雙酶切鑒定，將陽性克隆質粒命名為 pStar-VSIG4-IRES-IGRP。4、重組載體 pShuttle-CMV-VSIG4-IRES_IGRP 的構建以 pStar-VSIG4-IRES_IGRP 載體為模板，以 F4 :5，-acgcgtcgacgccaccatgggg-a tctta-3' (SEQ ID No. 9，下劃線部分為 Sal I 酶切位點)和 R4 :5，-agaatcgcggccgc-tta acagacacttttgcc-3，(SEQ ID No. 10，下劃線部分為Not I酶切位點)為上下游引物，PCR 擴增VSIG4-IRES-IGRP片段并將該片段兩端的酶切位點更換為Sal I酶切位點和Not I 酶切位點，PCR體系和循環條件參數同前。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定、凝膠回收試 劑盒切膠回收純化后，與ρΤ-Easy載體連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞， 用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質粒，測序鑒定，將陽性克隆質粒命名為 PT-VSIG4-IRES-IGRP。將pT-VSIG4-IRES-IGRP載體用Sal I和Not I雙酶切，雙酶切產物經凝膠回收試 劑盒切膠回收純化后，與同樣經Sal I和Not I雙酶切的pShuttle-CMV載體連接，連接產 物轉化大腸桿菌DH5ci感受態細胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取質粒， Sal I和Not I雙酶切鑒定，將陽性克隆質粒命名為pShuttle-CMV-VSIG4-IRES-IGRP。5、重組腺病毒載體pAd_VSIG4/IGRP的構建將pShuttle-CMV-VSIG4-IRES_IGRP 載體用 Pme I 酶切線性化，再與 pAdEasy-Ι 載 體同時電轉化大腸桿菌BJ5183感受態細胞，進行胞內同源重組，用含有卡那霉素的LB平板 培養，挑取較小菌落，用含有卡那霉素的LB液體培養基培養過夜，提取質粒，Pac I酶切鑒 定，將陽性質粒命名為pAd-VSIG4/IGRP。6、重組腺病毒載體pAd_VSIG4/IGRP的包裝將人胚胎腎293細胞以40% 60%的細胞密度接種至T_25培養瓶中，待細胞生 長至30% 50%融合時棄去培養液，用Lipofectamine 2000試劑將pAd_VSIG4/IGRP載體 轉染293細胞，通過顯微鏡觀察細胞病理改變，待出現明顯細胞病變效應時離心收集細胞， 細胞沉淀用PBS重懸后，反復凍融4次使細胞裂解，離心去除細胞碎片，收集含病毒的上清 液，即得Ad-VSIG4/IGRP病毒原液；將病毒原液按1 10的比例重新感染293細胞，收集含 病毒的上清液，重復上述操作3次，得第四代重組腺病毒Ad-VSIG4/IGRP。二、重組腺病毒Ad_VSIG4/IGRP轉染樹突狀細胞疫苗的制備1、樹突狀細胞的分選取4周齡Balb/c小鼠，脫頸處死，用體積分數為75%的乙醇溶液浸泡5分鐘，無 菌條件下切開皮膚及皮下組織，分離小鼠股骨和脛骨，用濃度為0. Olmol/L的無菌PBS清洗 3 5次，剪斷股骨和脛骨兩端，用濃度為0. 01mol/L的無菌PBS反復沖洗骨髓腔，制成單 細胞懸液，1000r/min離心5分鐘去掉脂肪層，細胞用濃度為0. 01mol/L的無菌PBS重懸，再緩慢加入等體積Percoll細胞分離液，3000r/min離心30分鐘，收集單核細胞，用濃度為0. Olmol/L的無菌PBS洗滌2次，再用含血清的DMEM培養基重懸，所得單細胞懸液接種于 T-25培養瓶內，并補充粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)，置溫 度為37°C、CO2氣體體積分數為5%和飽和濕度的培養箱內培養，隔日半量換液補充細胞因 子，第7天收獲細胞，即得樹突狀細胞。2、重組腺病毒Ad_VSIG4/IGRP轉染樹突狀細胞將樹突狀細胞以細胞濃度為IXlO6個/ml接種于6孔板，按感染復數(MOI)為100 加入第四代重組腺病毒Ad-VSIG4/IGRP，感染后48小時收集細胞，用PBS洗滌并重懸，即得 Ad-VSIG4/IGRP病毒轉染樹突狀細胞。Western Blot檢測分別超聲裂解Ad_VSIG4/IGRP病毒轉染樹突狀細胞和空病毒 轉染樹突狀細胞，收集細胞總蛋白進行SDS-PAGE，電泳完畢后電轉印PVDF膜，洗膜，封閉， 加入兔抗人VSIG4或IGRP多克隆抗體，37°C孵育1小時，洗膜，再加入羊抗兔IgG，37°C孵 育1小時，洗膜，顯色。結果見圖3，Ad-VSIG4/IGRP病毒在樹突狀細胞中可以表達VSIG4和 IGRP。三、重組腺病毒Ad_VSIG4/IGRP轉染樹突狀細胞疫苗抗1型糖尿病能力檢測取2月齡糖尿病易患性NOD小鼠，隨機分為兩組實驗組和對照組，實驗組尾靜脈 回輸Ad-VSIG4/IGRP病毒轉染樹突狀細胞，連續回輸3次，每周1次，每次輸入1 X IO6個細 胞；對照組正常飼養。1、淋巴細胞增殖能力檢測末次回輸后1周，斷頸處死兩組小鼠，無菌條件下取小鼠脾臟，用100目篩網碾 磨成細胞懸液，用常規聚蔗糖-泛影葡胺分層液梯度離心法分離獲得脾淋巴細胞，用含有 體積分數為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養基調整細胞濃度為1 X IO6個/ml，接種至 96孔板，每孔100 μ 1，每組設3個復孔，每孔加入IGRP重組蛋白至終濃度為lmg/ml，置 溫度為37°C、CO2氣體體積分數為5%的培養箱內培養96小時，再每孔加入0. Iml濃度為 IXlO3U Ci/L的3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)溶液，繼續培養12小時，用PBS漂洗細胞3次， 甲醛固定10分鐘，再用溫度4°C預冷的體積分數為5%的三氯醋酸溶液漂洗3次，每孔加入 0. 5ml濃度為0. 3mol/L的NaOH溶液，60°C水浴反應30分鐘，冷卻至室溫，轉移入閃爍瓶中， 加入5ml閃爍液，用液體閃爍計數器計數每分鐘的閃爍次數(cpm)，測定DPM值(反映細胞 DNA合成速率)，重復測定3次。結果見圖4，實驗組小鼠淋巴細胞的cpm值為30000士4200，而對照組小鼠淋巴細 胞的cpm值為50000 士4900，證實Ad-VSIG4/IGRP病毒轉染樹突狀細胞疫苗能夠有效降低淋 巴細胞的增殖能力。2、淋巴細胞分泌細胞因子能力檢測末次回輸后1周，斷頸處死NOD小鼠，無菌條件下取小鼠脾臟，用100目篩網碾磨 成細胞懸液，用常規聚蔗糖-泛影葡胺分層液梯度離心法分離獲得脾淋巴細胞，用含有體 積分數為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養基調整細胞濃度為1 X IO6個/ml，接種至96 孔板，每孔100 μ 1，每組設3個復孔，每孔加入IGRP重組蛋白至終濃度為lmg/ml，置溫度為 37CO2氣體體積分數為5%的培養箱內培養96小時后，用ELISA法檢測白介素2(IL_2) 和干擾素-Y (IFN-y)的含量。
結果見圖5，實驗組小鼠淋巴細胞的IL-2和IFN-Y含量分別為45. 2士5. 7pg/ ml和38. 7 士4. 9pg/ml,而對照組小鼠淋巴細胞的的IL-2和IFN- γ含量分別為 108. 5 士 12. 7pg/ml和107. 4 士 13. 6pg/ml，證實Ad_VSIG4/IGRP病毒轉染樹突狀細胞疫苗能 有效降低淋巴細胞分泌細胞因子的能力。3、NOD小鼠糖尿病發病率檢測監測實驗組和對照組小鼠的血糖水平。結果見圖6，實驗組小鼠18周齡開始出現血糖異常，30周齡的糖尿病發病率為 40%，而對照組小鼠14周齡開始出現血糖異常，30周齡的糖尿病發病率高達80% ；證實 Ad-VSIG4/IGRP病毒轉染樹突狀細胞疫苗能夠有效延遲NOD小鼠糖尿病的發病時間，并降 低糖尿病的發病率。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通過參 照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可 以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明 的精神和范圍。序列表<110>中國人民解放軍第三軍醫大學<120>VSIG4和IGRP雙基因共表達重組腺病毒及其制備方法和應用<160>10<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物 Fl<400>1ggtagcagga ggctggaaga aag23<210>2
<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物 Rl<400>2tcagcagatc ctggcctaat gg22<210>3<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
〈223〉引物 F2〈400>3aatctgcagg ccaccatggg gatcttactg ggcctg 36<210>4〈211〉<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物 R2<400>4tacgaattct taacagacac ttttgccctc ag32<210>5<211>1200<212>DNA〈213〉 智人(homo sapiens)<400>5atggggatct tactgggcct gctactcctg gggcacctaa cagtggacac ttatggccgt 60cccatcctgg aagtgccaga gagtgtaaca ggaccttgga aaggggatgt gaatcttccc 120tgcacctatg accccctgca aggctacacc caagtcttgg tgaagtggct ggtacaacgt 180ggctcagacc ctgtcaccat ctttctacgt gactcttctg gagaccatat ccagcaggca 240aagtaccagg gccgcctgca tgtgagccac aaggttccag gagatgtatc cctccaattg 300agcaccctgg agatggatga ccggagccac tacacgtgtg aagtcacctg gcagactcct 360gatggcaacc aagtcgtgag agataagatt actgagctcc gtgtccagaa actctctgtc 420tccaagccca cagtgacaac tggcagcggt tatggcttca cggtgcccca gggaatgagg 480attagccttc aatgccaggc tcggggttct cctcccatca gttatatttg gtataagcaa 540cagactaata accaggaacc catcaaagta gcaaccctaa gtaccttact cttcaagcct 600gcggtgatag ccgactcagg ctcctatttc tgcactgcca agggccaggt tggctctgag 660cagcacagcg acattgtgaa gtttgtggtc aaagactcct caaagctact caagaccaag 720actgaggcac ctacaaccat gacatacccc ttgaaagcaa catctacagt gaagcagtcc 780tgggactgga ccactgacat ggatggctac cttggagaga ccagtgctgg gccaggaaag 840agcctgcctg tctttgccat catcctcatc atctccttgt gctgtatggt ggtttttacc 900atggcctata tcatgctctg tcggaagaca tcccaacaag agcatgtcta cgaagcagcc 960agggcacatg ccagagaggc caacgactct ggagaaacca tgagggtggc catcttcgca 1020agtggctgct ccagtgatga gccaacttcc cagaatctgg gcaacaacta ctctgatgag 1080ccctgcatag gacaggagta ccagatcatc gcccagatca atggcaacta cgcccgcctg 1140ctggacacag ttcctctgga ttatgagttt ctggccactg agggcaaaag tgtctgttaa 1200<210>6<211>29<212>DNA
〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物 F3<400>6gatcggatcc ccaagatgat atgggtagc29<210>7<211>29<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物 R3<400>7acgcgtcgac tgtcaatgtg gatccagtc 29<210>8〈211>1068<212>DNA〈213〉智人(homo sapiens)<400>8atggatttcc ttcacaggaa tggagtgctc ataattcagc atttgcagaa ggactaccga 60gcttactaca cttttctaaa ttttatgtcc aatgttggag accccaggaa tatctttttc 120atttattttc cactttgttt tcaatttaat cagacagttg gaaccaagat gatatgggta 180gcagtcattg gggattggtt aaatcttata tttaaatgga tattatttgg tcatcgacct 240tactggtggg tccaagaaac tcagatttac ccaaatcact caagtccatg ccttgaacag 300ttccctacta catgtgaaac aggtccagga agtccatctg gccatgcaat gggcgcatcc 360tgtgtctggt atgtcatggt aaccgctgcc ctgagccaca ctgtctgtgg gatggataag 420ttctctatca ctctgcacag actgacctgg tcatttcttt ggagtgtttt ttggttgatt 480caaatcagtg tctgcatctc cagagtattc atagcaacac attttcctca tcaagttatt 540cttggagtaa ttggtggcat gctggtggca gaggcctttg aacacactcc aggcatccaa 600acggccagtc tgggcacata cctgaagacc aacctctttc tcttcctgtt tgcagttggc 660ttttacctgc ttcttagggt gctcaacatt gacctgctgt ggtccgtgcc catagccaaa 720aagtggtgtg ctaaccccga ctggatccac attgacacca cgccttttgc tggactcgtg 780agaaaccttg gggtcctctt tggcttgggc tttgcaatca actcagagat gttcctcctg 840agctgccgag ggggaaataa ctacacactg agcttccggt tgctctgtgc cttgacctca 900ttgacaatac tgcagctcta ccatttcctc cagatcccga ctcacgaaga gcatttattt 960tatgtgctgt ctttttgtaa aagtgcatcc attcccctaa ctgtggttgc tttcattccc 1020tactctgttc atatgttaat gaaacaaagc ggaaagaaga gtcagtag1068<210>9<211>28<212>DNA
<213>人工序列<220><223> 引物 F4<400>9acgcgtcgac gccaccatgg ggatctta28<210>10<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物 R4<400>10agaatgcggc cgcttaacag acacttttgc c 3權利要求
VSIG4和IGRP雙基因共表達重組腺病毒，其特征在于所述重組腺病毒基因組中包含一個VSIG4和IGRP雙基因表達盒，所述VSIG4和IGRP雙基因表達盒由上游至下游依次包含CMV啟動子、VSIG4全長編碼基因、終止子、內部核糖體進入位點IRES、IGRP全長編碼基因和終止子。
2.權利要求1所述的VSIG4和IGRP雙基因共表達重組腺病毒的制備方法，其特征在 于包括以下步驟a、RT-PCR擴增 VSIG4 全長 cDNA ；b、RT-PCR擴增 IGRP 全長 cDNA ；C、將步驟a所得VSIG4全長cDNA插入pStar載體的IRES上游，步驟b所得IGRP全長 cDNA插入pStar載體的IRES下游，得重組載體pStar_VSIG4-IRES_IGRP ；d、以步驟c 所得重組載體 pStar-VSIG4-IRES-IGRP 為模板，PCR 擴增 VSIG4-1 RES-1GRP 片段并更換該片段兩端的酶切位點；e、將步驟d所得VSIG4-IRES-IGRP片段插入腺病毒穿梭載體pShuttle_CMV的CMV啟 動子下游，得重組腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-VSIG4-IRES-IGRP ；f、將步驟e所得重組腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-VSIG4-IRES-IGRP與腺病毒骨架 載體pAdEasy-Ι在大腸桿菌BJ5183中進行胞內同源重組，得重組腺病毒載體pAd_VSIG4/ IGRP ；g、將重組腺病毒載體pAd-VSIG4/IGRP在293細胞中包裝成重組腺病毒Ad_VSIG4/ IGRP。
3.根據權利要求2所述的VSIG4和IGRP雙基因共表達重組腺病毒的制備方法，其特 征在于步驟a的具體方法為提取人肺組織總RNA，逆轉錄得到總cDNA，再以巢式PCR擴增 VSIG4全長cDNA 第一輪PCR以所得總cDNA為模板，以SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示 序列為上下游引物；第二輪PCR以第一輪PCR產物為模板，以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4 所示序列為上下游引物海輪PCR的循環條件參數為94°C預變性5分鐘；然后94°C變性 50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30個循環；最后72°C延伸10分鐘；PCR產物經 純化后克隆入pT-Easy載體，得重組載體pT_VSIG4。
4.根據權利要求3所述的VSIG4和IGRP雙基因共表達重組腺病毒的制備方法，其特 征在于步驟b的具體方法為提取人胰腺組織總RNA，逆轉錄得到總cDNA，再以該總cDNA 為模板，以SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 7所示序列為上下游引物，PCR擴增IGRP全長cDNA， PCR循環條件參數為94°C預變性5分鐘；然后94°C變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2 分鐘，共30個循環；最后72°C延伸10分鐘；PCR產物經純化后克隆入pT-Easy載體，得重組 載體 pT-IGRP。
5.根據權利要求4所述的VSIG4和IGRP雙基因共表達重組腺病毒的制備方法， 其特征在于步驟c的具體方法為自重組載體pT-VSIG4中用Pst I和EcoR I雙酶 切出VSIG4全長cDNA，經純化后與同樣用Pst I和EcoR I雙酶切的pStar載體連接， 得重組載體pStar-VSIG4 ；再自pT_IGRP載體中用BamH I和Sal I雙酶切出IGRP全長 cDNA，經純化后與同樣用BamH I和SalI雙酶切的pStar_VSIG4載體連接，得重組載體 pStar-VSIG4-IRES-IGRP。
6.根據權利要求5所述的VSIG4和IGRP雙基因共表達重組腺病毒的制備方法，其特征在于步驟d的具體方法為以重組載體pStar-VSIG4-IRES-IGRP為模板，以SEQ ID No. 9 和SEQ ID No. 10所示序列為上下游引物進行PCR，將VSIG4-IRES-IGRP片段兩端的酶切位 點更換為Sal I酶切位點和Not I酶切位點，PCR循環條件參數為94°C預變性5分鐘；然 后94°C變性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分鐘，共30個循環；最后72°C延伸10分鐘； PCR產物經純化后克隆入pT-Easy載體，得重組載體pT_VSIG4-IRES_IGRP。
7.根據權利要求6所述的VSIG4和IGRP雙基因共表達重組腺病毒的制備方法，其特 征在于步驟e的具體方法為自重組載體pT-VSIG4-IRES-IGRP中用Sal I和Not I雙酶 切出VSIG4-IRES-IGRP片段，經純化后與同樣用Sal I和Not I雙酶切的腺病毒穿梭載體 pShuttIe-CMV 連接，得重組腺病毒穿梭載體 pShuttle-CMV-VSIG4-IRES_IGRP。
8.根據權利要求7所述的VSIG4和IGRP雙基因共表達重組腺病毒的制備方法，其特 征在于步驟f的具體方法為將重組腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV-VSIG4-IRES-IGRP用 Pme I酶切線性化，再與腺病毒骨架載體pAdEasy-Ι同時電轉化大腸桿菌BJ5183感受態細 胞，進行胞內同源重組，得重組腺病毒載體pAd-VSIG4/IGRP。
9.根據權利要求8所述的VSIG4和IGRP雙基因共表達重組腺病毒的制備方法，其特 征在于步驟g的具體方法為將人胚胎腎293細胞以40% 60%的細胞密度接種至培 養瓶中，待細胞生長至30% 50%融合時，采用LipofectamindOOO試劑將重組腺病毒載 體pAd-VSIG4/IGRP轉染293細胞，待細胞出現明顯病變時離心收集細胞，用磷酸鹽緩沖液 重懸后，反復凍融使細胞裂解，離心去除細胞碎片，收集含病毒的上清液，即得重組腺病毒 Ad-VSIG4/IGRP。
10.權利要求1所述的VSIG4和IGRP雙基因共表達重組腺病毒在制備抗1型糖尿病的 樹突狀細胞疫苗中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種VSIG4和IGRP雙基因共表達重組腺病毒及其制備方法和應用，該重組腺病毒基因組中包含一個VSIG4和IGRP雙基因表達盒，該表達盒由上游至下游依次包含CMV啟動子、VSIG4全長編碼基因、終止子、內部核糖體進入位點IRES、IGRP全長編碼基因和終止子；該重組腺病毒的制備方法簡單；將其體外轉染樹突狀細胞再回輸體內，能夠降低糖尿病易患性NOD小鼠淋巴細胞的增殖能力和細胞因子分泌能力，而且能夠延遲NOD小鼠糖尿病的發病時間并降低發病率，表明本發明的重組腺病毒能夠有效誘導特異性T細胞耐受，并有效抑制胰島β細胞的破壞，可用于制備抗1型糖尿病的樹突狀細胞疫苗。
文檔編號C12N7/01GK101818133SQ20091025108
公開日2010年9月1日 申請日期2009年12月29日 優先權日2009年12月29日
發明者吳玉章, 楊曌 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學