作為癌癥標志物的結腸癌相關的轉錄物1(ccat-1)的制作方法

專利名稱：：作為癌癥標志物的結腸癌相關的轉錄物1(ccat-1)的制作方法
技術領域：
：本發明涉及癌癥標志物CCAT-I和CCAT-I在癌癥診斷和成像中的用途。
背景技術：
：結腸和直腸的腺癌(CRC)是每年在世界范圍內影響超過一百萬人的常見疾病(1)。目前的CRC篩選主要是基于大便潛血檢驗，而診斷是基于結腸鏡檢查和組織活檢。目前的篩選程序對于降低CRC-相關的死亡率具有一些作用(2)，但是需要更準確的篩選和診斷形式。化療劑單獨或與靶向治療聯合改善了轉移性患者的中位數存活率，并降低了經歷CRC的完全切除和處于復發的高風險的患者(具有淋巴結轉移灶或不利的組織學的患者，(3))中的疾病復發。盡管CRC治療有大的進展，但是約50%的診斷患有CRC的患者將在診斷后5年內死于疾病。在正常組織中不表達的CRC-特異性分子是用于治療的潛在靶標。現在幾乎沒有在CRC中獨特表達而在正常組織中不表達的分子標志物。使用cDNA陣列的普查沒有鑒定可用于診斷和用作治療靶標的CRC相關的分子標志物。發明概述本發明是基于在癌細胞特別是結腸、直腸癌中特異性表達的獨特核酸轉錄物的鑒定、分離和測序。根據其獨特表達譜，該分子被稱為結腸癌相關的轉錄物1(CCAT-I)0該分子的完整序列公開于下文，并被命名為SEQIDNO:1。隨后，還發現CCAT-I在肺癌中表達。因此，通過其第一方面，本發明提供診斷癌癥或癌前病變的方法，包括測量生物樣品中SEQIDNO.l(CCAT-l)或其片段的表達水平；其中生物樣品中SEQIDNO.l(CCAT-l)或其片段的表達指示癌癥或癌前病變。在一種實施方案中，所述方法還包括將在生物樣品中測量的所述表達水平與標準進行比較，其中生物樣品中SEQIDNO.l(CCAT-l)或其片段的更高的表達水平指示癌癥或癌前病變。在一種實施方案中，本發明的方法包括(a)從獲自受治療者的生物樣品中分離核酸；(b)將能夠識別CCAT-I的探針與所述核酸在允許形成雜交復合體的條件下雜交；禾口(C)將雜交復合體形成與標準進行比較；其中生物樣品中更高水平的雜交復合體指示癌癥或癌前病變。在另一種實施方案中，本發明的方法包括(a)從獲自受治療者的生物樣品中分離核酸；(b)在所述分離的核酸中擴增CCAT-I或其任何片段；(c)顯現CCAT-I擴增產物；禾口(d)將CCAT-I擴增產物的量與標準進行比較；其中更高水平的CCAT-I擴增產物的存在指示癌癥或癌前病變。在具體實施方案中，所述擴增通過使用CCAT-I特異性探針的聚合酶鏈式反應(PCR)進行。在優選的實施方案中，所述PCR是實時定量PCR。根據本發明的術語癌癥或癌前病變的診斷還涵蓋癌癥或癌前病變的分期，以及體內成像。根據本發明的一種實施方案，所述標準是通過測量未患癌癥的受治療者中CCAT-I的表達水平而確定的。在另一種實施方案中，所述標準是通過測量所述同一受治療者的非癌組織中CCAT-I的表達水平而確定的。根據本發明的某些實施方案，所述癌癥選自以下組成的組結腸癌、直腸癌、肺癌和所述癌癥的轉移灶，包括微轉移灶(micro-metastase)。根據另一種實施方案，本發明的方法診斷的癌前病變是腺瘤性息肉。根據本發明的某些實施方案，所述生物樣品選自以下組成的組組織、血液、尿、糞便和骨髓樣品。優選地所述生物樣品是組織活檢。組織活檢可獲自例如結腸、直腸、肝、肺和淋巴結。在另一種實施方案中，CCAT-I表達水平是通過原位雜交測量的。在另一方面，本發明提供一種分離的寡核苷酸，其包含SEQIDN0:I(CCAT-I)或其互補序列的至少8個連續核苷酸，優選地用作探針或引物。在一個具體實施方案中，寡核苷酸探針包含SEQIDNO:5。根據某些實施方案，本發明的分離的寡核苷酸意圖用于檢測生物樣品中的CCAT-I表達。根據某些實施方案，本發明的分離的寡核苷酸意圖用于診斷癌癥。在另一方面，本發明提供一種用于檢測生物樣品中CCAT-I的表達的方法，包括(a)從所述生物樣品分離核酸；(b)將本發明的寡核苷酸探針與所述核酸在允許形成雜交復合體的條件下雜交；禾口(c)將雜交復合體形成與標準進行比較，其中生物樣品中更高水平的雜交復合體指示樣品中CCAT-I的表達。在一種實施方案中，所述方法還包括在雜交之前擴增所述生物樣品中轉錄的核酸。在另一方面，本發明提供一種分離的核酸，其包含與SEQIDNO:1具有至少85%同源性的CCAT-I或其片段。在一種實施方案中，所述分離的核酸包含SEQIDNO:1或其片段的核酸序列。在一種實施方案中，所述核酸是mRNA。在另一種實施方案中，所述核酸是cDNA。在另一方面，本發明提供組合物，包括藥物組合物，其包含如上所述的本發明的分離的寡核苷酸、分離的寡核苷酸探針或分離的核酸。在具體實施方案中，所述組合物被連接至基質。本發明還包括包含本發明的分離的核酸的載體，以及包含所述載體的宿主細胞。在另一方面，本發明提供一種試劑盒，其被劃分以容納用于測量獲自受治療者的生物樣品中的CCAT-I表達水平的至少一種試劑，所述至少一種試劑包含與CCAT-I轉錄物的至少一種片段雜交的至少一種寡核苷酸探針或引物。在又一方面，本發明提供一種陣列，其包含具有多種區段的基質，其中所述區段中的至少一種包含與CCAT-I或其片段雜交的探針。本發明還包括癌癥或癌前病變的成像，所述癌癥或癌前病變包括但不限于腺瘤性息肉、結腸或直腸的原發性腺癌、肺癌、淋巴結轉移灶和遠端轉移灶，通過向受治療者施用能夠識別CCAT-I的探針，其中所述探針軛合至包括但不限于放射性同位素、熒光染料、可見染料(visibledye)或納米顆粒的指示分子，并通過成像裝置檢測標記。附圖簡述為了理解本發明和查看其在實踐中可如何被實施，下面將參考附圖，僅通過非限制性實施例來描述實施方案，其中圖1是顯示商業可獲得的來自正常組織的CDNA板中CCAT-I轉錄物水平的實時PCR定量分析的圖。左側的柱代表結腸癌細胞系SK-Co-IO中的CCAT-I轉錄物水平。圖2是顯示結腸癌(黑色條)和相鄰的正常組織(白色條)中的CCAT-I轉錄物水平的實時PCR分析的圖。樣品編號顯示在X-軸。C=對照/SK-CO-IO。圖3是顯示低濃度HT-29細胞中CCAT-I的校準曲線的圖。擴增在獲自未患結腸癌的受治療者的外周血單核細胞(PBMC)中稀釋的增加濃度的HT-29結腸癌細胞中的CCAT-1。擴增的CCAT-IcDNA的相對量(RQ)顯示于y-軸，并使用單獨獲自未患結腸癌的受治療者的PBMC作為參考樣品進行計算。CCAT-IcDNA的相對量與HT-29腫瘤細胞濃度相關。最低劑量1XIO6個PBMC中5個腫瘤細胞至高達1XIO6個PBMC中500個腫瘤細胞(HT29)。圖4是顯示中間濃度的HT-29細胞的校準的圖。擴增在獲自未患結腸癌的受治療者的PBMC中稀釋的增加濃度的HT-29結腸癌細胞中的CCAT-I。擴增的CCAT-lcDNA的相對量(RQ)使用單獨獲自未患結腸癌的受治療者的PBMC作為參考樣品進行計算。CCAT-lcDNA的相對量(y-軸)與HT-29腫瘤細胞濃度相關。最低劑量1XIO6個PBMC中500個腫瘤細胞(HT29)至高達1XIO6個PBMC中10,000個腫瘤細胞(HT29)。右側的柱是僅PBMC的對照。圖5是顯示高濃度的HT-29細胞的校準的圖。擴增在獲自未患結腸癌的受治療者的PBMC中稀釋的增加濃度的HT-29結腸癌細胞中的CCAT-I。擴增的CCAT-lcDNA的相對量(RQ)顯示于y_軸，并使用單獨獲自未患結腸癌的受治療者的PBMC作為參考樣品進行計算。CCAT-lcDNA的相對量與HT-29腫瘤細胞濃度相關。最低劑量IXlO6個PBMC中1,000個腫瘤細胞至高達1XIO6個PBMC中1,000,000個腫瘤細胞(HT29)。右側的柱是對照樣品，其僅含有獲自未患結腸癌的受治療者的PMBC。圖6是顯示結腸腺瘤(腺瘤性息肉)和衍生自結腸腺癌的肝轉移灶中的CCAT-I表達的圖。410TCO-腫瘤組織、316TCO-腫瘤組織、NN=獲自具有結腸癌以外的疾病的患者的正常結腸粘膜。Pl和P2=獲自結腸的腺瘤性息肉的組織。M=獲自肝轉移灶(轉移性結腸癌)的組織。圖7是顯示通過不同的檢測方法鑒定的哨兵淋巴結(SLN)的百分比的圖，所述檢測方法包括蘇木精和伊紅染色(H&E)、免疫組織化學(IHC)和聚合酶鏈式反應(PCR)。圖8是顯示通過實時定量PCR的細胞角蛋白-20(CK20)擴增曲線的圖。圖9是顯示通過實時定量PCR(qPCR)的CCAT-I擴增曲線的圖。圖10是顯示糞便樣品中CCAT-I的qPCR結果的圖。結果顯示為CCAT-1和看家基因(GAPDH)的表達之間的關系。每個柱代表與從同一樣品擴增的GAPDHcDNA的量相比的CCAT-lcDNA的相對量(RQ)。NTC(左側的柱)顯示內部陰性對照_獲自未患結腸癌的受治療者的外周血淋巴細胞。沒有CCAT-lcDNA存在。樣品t391和t374是陽性對照-結腸組織的原發性腺癌。這些樣品顯示CCAT-I的高表達。來自健康志愿者的糞便樣品(C46-C8)。任何樣品(η=9)中都沒有CCAT-I表達。患有結腸或直腸腺癌的患者的糞便樣品(Ρ25-Ρ1)。在4/12樣品中發現了CCAT-I表達。圖11是顯示通過實時PCR定量分析測量的、九個陰性對照的外周血(健康志愿者)和兩個結腸腺癌樣品(左側的柱)中的CCAT-I表達的圖。圖12是顯示結腸癌患者的外周血樣品中的CCAT-I表達的圖。擴增的CCAT-lcDNA的相對量(RQ；顯示于y_軸)是與獲自未患結腸癌的受治療者(NC)的PBMC的對照樣品相比。圖13是顯示與HT-29相比的18個結腸直腸癌細胞系中的相對CCAT-1表達的圖。表達水平通過實時(定量)PCR確定。任何給定樣品中的相對CCAT-I表達是與HT-29結腸癌細胞系(=1)中的CCAT-I表達相比。圖14是顯示與HT-29相比的16個肺癌細胞系中的相對CCAT-1表達的圖。表達水平通過實時(定量)PCR確定。任何給定樣品中的相對CCAT-I表達是與HT-29結腸癌細胞系(=1)中的CCAT-I表達相比。圖15A顯示用作原位探針的165bp核酸序列(SEQIDNOX)；圖15B是顯示pBluescript載體的RNA印跡分析的照片。泳道1序列梯。泳道2pBluescript載體和插入序列。圖16是基于篩選的原位雜交的范例。結腸腺癌(a)和相鄰的正常粘膜(b)中的CCAT-I的比較染色。在腫瘤組織(a)中觀察到更強的CCAT-I染色，相比之下，相鄰的正常粘膜中的CCAT-I染色的強度較低。圖17是顯示健康志愿者的外周血樣品中的CCAT-I表達的圖。實施方案詳述^X如本文所用，術語“CCAT-1”指結腸癌相關的轉錄物l(ColonCancerAssociatedTranscript1)。如本文所用，術語“CCAT-1的片段”或“CCAT-1轉錄物的片段”指CCAT-I基因轉錄物的片段，其可用作寡核苷酸或核酸探針、引物或反義寡核苷酸。如本文所用，術語“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互換使用，并包括任何長度的核苷酸的聚合形式，所述核苷酸是脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其類似物。以下是多核苷酸的非限制性實例基因或基因片段、外顯子、內含子、信使RNA(mRNA)、轉移RNA(tRNA)、核糖體RNA(rRNA)、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質粒、載體、具有任何序列的分離的DNA、具有任何序列的分離的RNA、核酸探針和引物。多核苷酸可包含修飾的核苷酸，諸如甲基化核苷酸和核苷酸類似物。核苷酸的序列可被非核苷酸組分中斷。多核苷酸還可在聚合后修飾，諸如通過與標記組分軛合。該術語還包括雙鏈和單鏈分子二者。CCAT-I的“互補轉錄物”或“探針”指與CCAT-I互補的、用于檢測CCAT-I的cDNA或mRNA的至少一部分的存在的核酸分子或序列。檢測通過鑒定探針和測定的序列之間的雜交復合體進行。探針可被連接至固體支持物或可檢測的標記。探針一般是單鏈的。探針通常包含10至200個核苷酸。探針的特定性質將取決于特定的用途，并且其確定在本領域技術人員的能力范圍之內。一般而言，探針將在高嚴格性條件下與CCAT-I的cDNA或mRNA的至少一部分雜交。如本文所用，“引物”指通過與靶標雜交而結合感興趣的樣品中存在的靶標或“模板”靶標，然后促進與靶標互補的多核苷酸的聚合的短的多核苷酸。“聚合酶鏈式反應”(PCR)是其中復制拷貝是由靶標多核苷酸使用由正向引物和反向引物組成的一組引物，通常是一對引物，和作為聚合催化劑的DNA聚合酶生成的反應。應理解，引物也可用作雜交反應，諸如DNA或RNA印跡分析中的探針，例如，如SambrookJ.等人ALaboratoryManual(實驗室手冊).第2版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989中所述。如本文所用，術語“cDNA”指互補DNA。“cDNA”指分離的多核苷酸、核酸分子或其任何片段或互補序列。它可通過重組技術或合成方法起源，是雙鏈或單鏈，代表編碼和/或非編碼5’和3’序列。如本文所用，“結腸直腸癌”或“CRC”指特征為包括盲腸、升結腸、橫結腸、降結腸、乙狀結腸和直腸的腸道細胞的癌癥的醫學病癥。如本文所用，“癌前病變”或“腺瘤性息肉”指特征為結腸粘膜的惡性轉化但沒有侵入基底膜的組織學證據的醫學病癥。如本文所用，“肺癌”指特征為肺細胞的癌癥的醫學病癥。“載體”包括將插入的多核苷酸轉入宿主細胞的自我復制的核酸分子。該術語意圖包括主要功能是將核酸分子插入細胞的載體、主要功能是核酸復制的復制載體和功能為DNA或RNA的轉錄和/或翻譯的表達載體。還意圖包括提供多于一種上述功能的載體。術語“宿主細胞”涵蓋充當載體或摻入外源核酸分子諸如多核苷酸的接受者的任何單獨的細胞或細胞培養物。具體地，宿主細胞涵蓋能夠充當包含CCAT-I的至少一部分的載體的接受者的細胞。它還涵蓋由于天然的、偶然的或有意的突變而有時可能未必與原始的親代細胞在基因型或表型上相同的細胞后代。原核細胞或真核細胞適于充當本發明中的宿主細胞。宿主細胞包括但不限于細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、動物細胞，包括哺乳動物細胞，如鼠、大鼠、猿猴或人類細胞。如本文所用，“差異表達”指增加的、更高(上調的或存在的)或降低的(下調的或不存在的)基因表達，如通過生物樣品中轉錄的寡核苷酸(如mRNA)的不存在、存在或量的變化所檢測的。“更高的表達水平”涵蓋比對照樣品中檢測的表達水平或標準高至少2倍、2.5倍、3倍、5倍、10倍或更高的表達水平。該術語還指細胞或組織中有核苷酸序列的表達，而對照細胞中未檢測到表達。如本文所用，“雜交”指其中至少一種多核苷酸反應以形成經由核苷酸殘基的堿基之間的氫鍵穩定的復合體的反應。氫鍵可通過Watson-Crick堿基配對、以任何其他序列特異性方式發生。雜交反應可構成更廣泛過程中的步驟，諸如PCR反應的起始。雜交反應可在不同嚴格性的條件下進行。在嚴格性條件下，彼此具有至少60%,65%,70%,75%同一性的核酸分子保持互相雜交。高嚴格性雜交條件的非限制性實例是在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在大約45°C下雜交，然后在0.2XSSC和0.1%SDS中在50°C、在55°C或在約60°C或更高溫度下漂洗一次或多次。當雜交在兩個單鏈多核苷酸之間以反平行構型發生時，這些多核苷酸被描述為互補。能夠與本發明的核酸分子SEQNO1(CCAT)雜交的分子還包括能夠與其雜交的多核苷酸片段。在本文中，片段被理解為意指長度足以與CCAT-I轉錄物雜交的核酸分子的部分。因此，術語片段意指這些分子的序列與CCAT-I轉錄物的序列在一個或多個位置不同但仍顯示與這些序列或其部分的高度同源性。在此語境中，同源性意指至少40%的序列同一性、特別地至少60%、至少80%、至少85%、至少90%或超過95%的同一性。優選地，同源性的程度是通過將相應序列與SEQIDNO1的核苷酸序列進行比較而確定的。在被比較的序列不具有相同長度的此類情形中，同源性的程度優選地指較短的序列中與較長的序列中的核苷酸殘基相同的核苷酸殘基的百分比。同源性或同一性的程度可通過例如已知的基于計算機比對的程序諸如ClustalW來評估，ClustalW由EuropeanBioinformaticsInstitute(EBI)禾口EuropeanMolecularBiologyLaboratory(EMBL)分發。ClustalW可以從各種來源諸如例如www.ebi.ac.uk/clustalw下載。當使用ClustalW軟件包2.0版本來確定特定的序列是否與根據本發明的SEQNO1具有例如85%同一性時，比較可通過其中提供的默認設置進行。“生物樣品”在本文使用其廣泛含義，并可包括體液；細胞制品的可溶級分或培養細胞的培養基的等份；從細胞中分離或提取的染色體、細胞器或細胞膜；溶解或結合至基質的基因組DNA、RNA或cDNA；細胞；活檢，組織包括腫瘤組織、結腸直腸樣品和非結腸直腸樣品；組織印跡(tissueprint)；指紋、口腔細胞(buccalcell)、皮膚或毛發；和類似樣品。“基質”指結合核酸的任何硬質或半硬質支持物，并包括膜、過濾器、芯片、載玻片、干膠片、纖維、磁性或非磁性珠、凝膠、毛細管或其他管、平板、聚合物、納米顆粒和微顆粒，其具有多種表面形式，包括孔(well)、溝(trench)、針(pin)、槽(channel)禾口小孑L(pore)。本發明是基于對結腸癌相關的轉錄物-I(CCAT-I)的鑒定，CCAT-I是長2528堿基對(bp)并且位于染色體8q24.21上的新的非編碼RNA。發明人發現CCAT-I存在于多種癌組織和細胞系包括結腸癌、直腸癌、肺癌中和結腸的癌前病變(腺瘤性息肉)中，但在正常組織中如果有的話，以非常低的水平被檢測到，如本文所公開的。因此，CCAT-I可充當癌細胞的標志物，并且尤其可用于生物樣品中的結腸直腸癌、肺癌和癌前病變(腺瘤性息肉)的鑒定。因此，本發明提供CCAT-I或其序列的任何部分作為用于對患有結腸直腸癌(CRC)、癌前病變(腺瘤性息肉)和肺癌的患者進行診斷、分期(病理學評估)、成像和術后監測的特異性分子診斷標志物的用途。這些活動可在體外，或通過遞送用于患者中的腫瘤成像的組合物而在體內進行。檢測可使用聚合酶鏈式反應(PCR)、原位雜交技術或本領域已知的任何檢測技術實現。根據本發明的一些實施方案，提供用于篩選、診斷和分析患者和/或患者樣品以檢測CCAT-I表達的證據的組合物和方法。CCAT-I的表達暗示原發性或轉移的結腸直腸癌或原發性或轉移性肺癌。在本發明的另一方面，提供可用于顯現原發性或轉移的結腸直腸癌或原發性或轉移性肺癌細胞的組合物和方法。篩選和診斷組合物和方法可用于監測處于直腸結腸癌或肺癌的高風險組的個體，諸如那些過去已被診斷患有局部性疾病、轉移的疾病的個體，或那些在遺傳上與所述疾病關聯的個體，或那些具有過去被診斷患有癌癥的一級和二級家族成員的個體。具有結腸炎性病癥諸如潰瘍性結腸炎或克隆氏結腸炎病史的個體和具有吸煙史的個體也將被視為處于結腸直腸癌或肺癌的高風險組的個體。體外篩選和診斷組合物和方法可用于監測正在經歷或已經接受結腸直腸癌或肺癌治療的個體以確定癌癥是否被除去。篩選和診斷組合物和方法可用于監測諸如通過遺傳篩選和/或家族史被鑒定為有遺傳素因的個體。因此，可鑒定處于發展結腸直腸癌和肺癌風險的個體，并可從此類個體中分離樣品。本發明可用于診斷顯示至少一種癌癥癥狀或特征，如在相關組織中存在息肉的個體。本發明尤其可用于監測被鑒定為具有包括親屬曾患有結腸直腸癌或肺癌的家族病史的個體。同樣地，本發明尤其可用于監測接受治療并除去腫瘤或以其他方式被緩解的個體。根據本發明，提供結合CCAT-I基因轉錄物的化合物。結腸癌、直腸癌或肺癌的檢測可使用獲自癌癥患者或懷疑患有癌癥的個體的任何生物樣品進行，所述生物樣品包括但不限于，組織、血液、骨髓、糞便、尿、淋巴結或任何體液。在特異性實施方案中，所述生物樣品是取自懷疑為癌性的組織的活檢(如針吸活檢或結腸鏡檢查中取出的組織)。在具體的實施方案中，所述樣品是糞便樣品。組織樣品可通過外科技術獲得。本領域技術人員將理解可獲得用于根據本發明的分析和檢查的測試樣品的多樣性。另外，本領域技術人員將理解，對于獲得組織樣品目的，本發明可使用另外的程序。在一種實施方案中，使用血液作為生物樣品。如果是這種情況，可通過例如離心從血液樣品中分離其中包含的細胞。在優選的實施方案中，生物樣品獲自人類。在任何生物樣品中檢測到CCAT-I基因轉錄物的存在表明該生物樣品含有腫瘤細胞。組織樣品任選地通過標準技術如超聲處理、機械破碎或化學裂解勻漿。10用于外科病理學的組織切片制品可以冷凍并使用標準技術制備。對組織切片的原位雜交測定對固定的細胞進行。CCAT-I基因轉錄物的存在可使用本領域已知的多種技術來確定，例如使用特異性引物的基因轉錄物或其片段的聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和擴增產物的檢測，以及與CCAT-I特異性探針的雜交。CCAT-I基因轉錄物的存在還可使用諸如原位雜交等技術在組織切片中確定。為此，本發明提供用來在本發明的程序中鑒定CCAT-I的寡核苷酸探針和寡核苷酸引物。在另一方面，本發明提供試劑盒，其包含諸如寡核苷酸探針和寡核苷酸引物等組分。應理解，本文提供的實例不意圖限制本發明的范圍。如上文指出的，生物樣品中的CCAT-I基因轉錄物的檢測可使用聚合酶鏈式反應(PCR)技術進行。PCR是本領域已知的，并且被常規地實踐于診斷和研究兩方面。它公開于例如美國專利第4,683,202和5,075,216號。簡要而言，PCR通過提供與待擴增的靶標核苷酸序列雜交的引物來提供DNA/RNA序列的擴增。引物組通常含有兩個引物(+正向和-反向)。該反應還采用核苷酸和聚合酶。聚合酶根據與雜交的引物相鄰的序列填充互補的核苷酸。擴增循環造成所需產物的指數擴增。PCR引物是基于序列信息根據常規的方案設計的。CCAT-I轉錄物的核苷酸序列如SEQIDNO:1所列。對于PCR，通常從生物樣品中的細胞提取RNA并分析，或可選地，將RNA轉化為cDNA。此類轉化也是標準做法。當CCAT-I轉錄物存在于生物樣品中時，PCR將得到包含CCAT-I轉錄物的原始mRNA的指數拷貝。如果CCAT-I不存在，PCR將不會得到可檢測的擴增產物。適于PCR的引物一般為8-25個核苷酸長、15-30個核苷酸長或18-50個核苷酸長。典型的引物包含15-25個核苷酸。這些引物與CCAT-I轉錄物或其對應cDNA的序列相同或互補。這是這些引物與CCAT-I轉錄物或其片段雜交的原因。將之前獲自生物樣品的mRNA或其對應cDNA與引物、核苷酸和聚合酶按照已知的PCR方案混合。混合物經歷一系列溫度循環。當CCAT-I轉錄物或其對應的cDNA存在于混合物時，引物將雜交，CCAT-I轉錄物將以指數擴增。當CCAT-I轉錄物不存在時，則不會觀察到可檢測的擴增。擴增產物可通過本領域熟知的許多程序檢測，例如，通過凝膠電泳。當從生物樣品中回收到小量轉錄的多核苷酸時，PCR是有利的。本發明還提供適于旨在擴增CCAT-I轉錄物的PCR反應的多核苷酸引物。根據本發明，可以組裝用于檢測生物樣品中CCAT-I轉錄物的存在的診斷試劑盒。此類診斷試劑盒包含適于檢測CCAT-I的試劑。作為非限制性實例，此類試劑盒包含至少一種寡核苷酸探針和/或至少一種寡核苷酸引物。通常，本發明的試劑盒還包含所用試劑的容器。另外，這些試劑盒可包含核苷酸大小標志物以用于凝膠分析中來確定檢測的核酸的大小。本發明的試劑盒可另外包括進行測定的說明和方案。還可提供陽性對照和陰性對照作為試劑盒組件的一部分。在另一種實施方案中，確定樣品中是否含有表達CCAT-I的細胞是通過對從生物樣品中提取的mRNA進行RNA印跡分析。RNA印跡分析是本領域技術人員已知的方法。參見，如Sambrook等人，(1989)MolecularCloningALaboratoryManual(分子克隆實驗室手冊)，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.另外，mRNA提取、通過電泳的mRNA分離、印跡分析、探針和引物制備和雜交技術是已知的，并且進行這些技術的材料是商業可獲得的。信使RNA可通過例如使用polydT柱來提取，并且材料通過電泳分離，并，例如，轉移到硝酸纖維素紙上。標記的探針通常用于顯現固定于所述紙上的mRNA的存在。這些探針具有與CCAT-I轉錄物或其片段互補的核苷酸序列。為此，SEQIDNO:1中的序列信息可用于制備探針或分離和克隆CCAT_1轉錄物。此類探針為至少8、15、30、40或100個核苷酸的段。探針可以是DNA或RNA，它優選地為單鏈，并且通常應與SEQIDNO:1的相應片段具有至少65%的序列同源性。探針可在報道子分子的存在下使用寡標記或PCR擴增產生。含有CCAT-I的cDNA或其片段的載體可用于產生信使RNA探針，例如通過加入RNA聚合酶和標記的核苷酸。本領域技術人員可用商業可獲得的試劑盒和材料來進行這些過程。雜交的嚴格性通過許多因素諸如探針內的GC含量、溫度和鹽濃度確定。特別地，嚴格性可通過降低鹽濃度或提高雜交溫度而增加。在高嚴格性下，雜交復合體將僅在核酸高度互補時保持穩定。雜交的條件是本領域技術人員熟知的，如參見Sambrook等人，如上所述。本發明的試劑盒可因此含有有用的試劑來實施RNA印跡技術以檢測生物樣品中CCAT-I轉錄物的存在。該試劑盒任選地包含可用作探針以與轉錄的CCAT-I或其片段雜交的寡核苷酸。探針可以被放射性標記。還可任選地提供陽性對照和陰性對照以及適當的大小標志物。用于檢測CCAT-I轉錄物的存在的另一技術是通過寡核苷酸雜交。多核苷酸的雜交是本領域技術人員已知的。此方法也采用含有與CCAT-I轉錄物的核苷酸序列雜交的特異性核苷酸序列的可檢測的探針。來自生物樣品的RNA通常被固定于濾紙或類似材料。加入探針并保持在僅當探針適當地與固定的材料互補時允許雜交的條件下。這些條件應具有足夠的嚴格性以洗掉與固定的材料部分雜交的探針。在濾紙上檢測到探針表明CCAT-I轉錄物的存在。用于雜交測定的探針包含與CCAT-I基因轉錄物的序列互補的至少8、12、15、20、30、50或100個核苷酸。SEQIDNO1中公開的序列信息可被本領域技術人員用于制備本發明的探針。可優化雜交過程的條件以使樣品中不完全互補的多核苷酸造成的背景信號最小。本發明因此還包括可用作寡核苷酸雜交的探針的標記的寡核苷酸。標記的探針涵蓋放射標記的核苷酸或通過可容易獲得的系統以其它方式可檢測的探針。標記的探針通常包括通過光譜學、光化學、生物化學、免疫化學或化學手段可測量的標記。作為非限制性實例，此類標記可包含放射性物質(32P、35s、3H、125I)、熒光染料(洋地黃毒苷、熒光素、5-溴脫氧尿苷(bromodesoxyuridin)、乙酰氨基芴)、生物素、納米顆粒和類似標記。此類寡核苷酸通常在其3’和5’端標記。特別地，與CCAT-I或其序列的任何部分互補的轉錄物(例如SEQIDNo4)可被軛合至熒光探針，包括但不限于可見范圍內的熒光標簽(例如€￥3.0或€￥5.0)或近紅外范圍的探針(例如Cy5.5)，以用于體外或體內檢測或成像結腸癌或直腸癌和肺癌。另夕卜，與CCAT-I或其序列的任何部分互補的轉錄物可被軛合至或摻入到納米顆粒、微顆粒或脂質體以檢測或成像癌癥。與CCAT-I或其序列的任何部分互補的轉錄物可被軛合至放射性同位素以檢測或成像癌癥。與CCAT-I或其序列的任何部分互補的轉錄物可被軛合至合成的聚合物以檢測或成像癌癥。與CCAT-I或其序列的任何部分互補的轉錄物可被軛合至其它生物劑，包括但不限于抗體、毒素或其它肽，以檢測或成像癌癥。可裝配對進行本發明的雜交方法有用的試劑盒。這些試劑盒還提供與CCAT-I轉錄物雜交的標記的寡核苷酸。在一種實施方案中，所述標記的探針是放射標記的。還可在所述試劑盒中包括陽性對照和陰性對照以及大小標志物，諸如多核苷酸序列梯。這些試劑盒還可包含用于進行所述測定的說明。本發明的雜交技術還涵蓋原位雜交以檢測生物樣品諸如組織切片中表達CCAT-I的細胞。因此，本發明還涉及可用于進行原位雜交的探針。這些探針被設計為與生物樣品中存在的互補核酸序列雜交。可使用熒光顯微鏡來顯現熒光標志物標記的探針。為此，本發明還提供用于進行原位雜交的試劑盒。原位雜交可用于檢測組織切片中CCAT-I的mRNA序列。可使用熒光標志物來檢測對應于CCAT-I轉錄物或其互補序列的序列。本發明還涉及重組載體，包括包含CCAT-I基因轉錄物、其片段或互補序列的表達載體。本發明還涉及包含此類載體的宿主細胞，并涉及使用此類重組細胞表達CCAT-I的方法。宿主細胞的實例包括酵母細胞諸如釀酒酵母(S.cerevisiae)、昆蟲細胞諸如草地貪夜蛾(S.frugiperda)、細菌諸如大腸桿菌(E.coli)和哺乳動物細胞諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。本發明還提供一種分離的寡核苷酸，其包含CCAT-I基因轉錄物(SEQIDNO1)或其片段的序列。特別地，本發明涉及與SEQIDNO:1具有至少85%同源性的分離的寡核苷酸。本發明涉及分離的CCAT-1，包括其片段。本發明的重組表達載體可用于轉化宿主以制備用于制備本發明的分離的寡核苷酸的重組表達系統。表達載體可含有轉錄控制元件(如啟動子和增強子)。這些元件可選自多種來源，其根據它們在特定宿主中的效率選擇。使用重組DNA技術或合成技術將載體、cDNA和調節元件合并在一起。本領域技術人員可通過使用商業可獲得的表達載體引入此類包含本發明的CCAT-I多核苷酸的分子，以用于熟知的表達系統，諸如本文描述的那些。除了通過重組技術產生這些多核苷酸分子之外，還可采用自動化核酸合成儀來生產CCAT-I或其片段。此類技術是本領域技術人員熟知的。CCAT-I轉錄物、相應于CCAT-I的cDNA、其片段、寡核苷酸、以上任何的互補RNA和DNA分子以及PNA可用于檢測或測量差異的CCAT-I表達、增加的表達水平。這些測量可監測治療干預過程中的mRNA水平。其還可用于本發明的診斷程序或實際的預后確定。這些測量還可用于分期癌癥組織諸如CRC或肺癌。與差異表達相關的癌癥包括特異性結腸癌或直腸癌以及肺癌。診斷測定可使用如上文所述的雜交或擴增技術。它們可用于比較獲自患者的生物樣品與標準樣品中的基因表達，以檢測CCAT-I的差異基因表達或增加的表達水平。用于此比較的定量方法是本領域技術人員熟知的。特別地，可使用定量PCR(qPCR)或實時定量PCR(RT-qPCR)分析來定量生物樣品中的CCAT-I表達水平。簡要而言，實時定量PCR在擴增過程中提供同步的監測。隨著擴增產物隨程序繼續而積累，其被連續地檢測。定量PCR和RT-qPCR是本領域技術人員已知的程序。作為非限制性實例，標記的探針可與從獲自患者的生物樣品制備的核酸混合。將混合物保持在形成雜交復合體的條件下。特定的培養之后，漂洗樣品，并定量雜交復合體的信號量。還可將信號與標準值進行比較。與正常標準相比獲自個體的生物樣品中更高的CCAT-I信號指示癌癥(如CRC或肺癌)。為了提供用于建立CCAT-I的差異表達或增加的表達的標準，評估了正常和疾病的表達水平。使取自正常受治療者的核酸樣品和與CCAT-I互補的寡核苷酸探針在允許雜交的條件下反應。然后測量雜交復合體的量。可將以此方式獲得的標準值與獲自受測試個體的生物樣品的值進行比較。標準水平可通過測量未患癌癥的個體(稱為“正常受治療者”)中的CCAT-I表達確定。可選地，標準水平可根據生物樣品中的參考基因的表達水平確定，所述生物樣品任選地為受測試個體的生物樣品。參考基因可以是看家基因，諸如本文中示例的看家基因(如GAPDH)。因此可通過與參考基因的表達水平相比的CCAT-I表達比值的增加或以其它方式標準化的CCAT-I表達測量值的增加來鑒定生物樣品中的差異CCAT-I表達。標準還可通過比較組織與視為沒有癌癥的周圍組織(也稱為“非癌組織”或“正常組織”)中的CCAT-I水平來確定。在一些實施方案中，本發明的CCAT-I引物和/或探針可配制成多種形式，包括溶液、懸浮液、乳液或凍干粉末。制劑通過通常使用的技術滅菌。在另一方面，本發明提供一種寡核苷酸的陣列，其包含具有多個區段的基質，其中至少一個所述區段包含與CCAT-I或其片段雜交的探針。在特異性實施方案中，陣列包含本發明的探針，如SEQIDNO:5。實施例本文下面提供的實施例例證了本發明，但不意圖限制本發明的范圍。實施例1CCAT-I的發現患者、細胞系、組織和RNA結腸癌細胞系HT-29和SK-CO-IO獲自ATCC(Manassas，VA)。HT29用于制備代表性差異分析(Representationaldifferenceanalysis,RDA)實驗的待測RNA。結腸癌和相鄰的正常組織樣本獲自由LudwigInstitute維持的組織庫(#4至29)或Hadassah-Hebrew大學醫學中心的組織庫(#96-218)。所有樣品來自經歷外科腫瘤切除并簽署經設施內倫理委員會(InstitutionalReviewBoard(IRB))批準的書面知情同意書的患者。總RNA通過異硫氰酸胍/CsCl梯度純化方法或Trizol試劑(Sigma-Aldrich，St丄ouis，MO)獲得。正常組織RNA板獲自Clontech(Mountainview,CA)。RDA和cDNA克隆代表性差異分析(RDA)如先前所述地進行(4)。HT29構成待測RNA。對于驅動RNA(driver)，RNA匯集自三種正常的結腸組織。利用Tsp509I或DpnII作為限制性內切核酸酶進行三輪擴增。分離和測序第二和第三擴增循環后產生的片段。使用通過RDA鑒定的部分長度CCAT-I轉錄物在λ-ZAPII載體系統(Stratagene，LaJolla,CA)中篩選HT29cDNA文庫，由此獲得全長cDNA。CCAT-I基因轉錄物和表達從HT29cDNA文庫克隆的全長CCAT-IcDNA長2528bp。該轉錄物對應于跨越nt.1-194和195-2528的兩個外顯子，如通過針對兩個帶有約9kb的長內含子的染色體_8基因組克隆(AC027531和AC020688)的BLAST分析所揭示的。該cDNA與在畸胎癌(5)中鑒定的AK125310相同。與AK125310相比，CCAT-I缺乏其5，-端的86個核苷酸，并在3’具有附加的313個核苷酸。CCAT-I(SEQIDNO.1)的完整序列為GCCTTAATAGCTAGCTGGATGAATGTTTAACTTCTAGGCCAGGCACTACTCTGTCCCAACAATAAGCCCTGTACATTGGGAAAGGTGCCGAGACATGAACTTTGGTCTTCTCTGCAATCCATCTGGAGCATTCACTGACAACATCGACTTTGAAGTTGCACTGACCTGGCCAGCCCTGCCACTTACCAGGTTGGCTCTGTATGGCTAAGCGTTTTCTCCTAAAATCCCTTGAAAACTGTGAGAAGACCATAAGAAGATCATATCTTTAATTCTATTTCACAAGTCACACAATATTCCAATCAAATACAGATGGTTGAGAAAAGTCATCCATCTTCCCTCCCCACCCTCCCACAGCCCCTCAACCACTGCCCTGAAACTTATATGCTGTTATCCGCAGCTCCATCTGGAGCATCACAGCTACTGTCAACCCTGACGCTCTTTCTGAAAAAACACCGGATGGACATCAGAACTATTTCTTTAAGGATGTTACTGAGCCACACAGGAAAACTTGCCTTATGATTTTGAATGCACGGATCTGATTTGACTAAACATGATAACTAGAGAATCACCCAATCTACTCCCATTTTCAACTCTAAATCATCAGAGTGTCTCAAATCCAAAGCACACACAGACCAGCCTGGCCAACACGGTGAAACTCCACCCCTACTAAAAGTATAAAAATTATCCAGGTGTGGTGGCGGGCGCCTGTAATCCAAGCTACTTGGGAGTCTGGAGGCAGGAGAATCCCTTGAACCTGGGAGATGGAGGTTGCAGTGAGCAGAGATCACACCACCGCACTCTAGCCTGGGCCACAAATCAACAACAACAACAACAACAAAAAACAAAGCGCACACAGAGACTGAGGTCCTCTTTGGCATTGAGAAGATGGCTATGCAAGTCCCAACTAGCAAGTGCAAACTTCCCAGCTTCACTTCTGCCAGTGTCCCTTCACCCCTTCTCAACCCCACTGGGAGGCAGGAGGGTGCTTGACAATAACAGCCTTGGCATCACTCTGCCAGGGTGTAATAGGAACTGTTACAATTCTGAGATTCTGTGTAAGCACTGGCCTTTCTGCCTAGAATGCCTTCTCCTCTCTTTTTTAACTGCATGCTCCTATTTATCTTTCAAAGCCCGGAAAAAATAACACTGCACACGGGAAATGCTCCCTTCCTACTGCAGTCATTTAGATGACTCTATGCCATTCCATTCATTTCTCTTTCCTACCACAGAAGTGCTTTGAGATTTTGGAGTCAGACTGCTTGAACTTGAATCCTGGCCCTCTCATCAGAGACTTGACTTATTTTAGGCAAGTTATATAACCAATTTTACCTCAGTTCCTTACCCATAAAATGGGTCTAATGAGAGTACCTACCACACAGAATTTTGATGAAAACTGAATGAGATGAAGGCCTTTAAGGCAGTGGTCCCCAACCCTGGGGACACAGACAGGTACCATTTTGTGGCCTGTTAGGAACTGGGCCACACAGCAGGAGGTGAGCAGTGGGTGAGTGAGATCAGCGTTATTTACAGCTGCTCCCCATTGCTCACCTTACTGCCTGAGCTCCACCTCCTGTCAGATCAGCAGTGGCATTAAATTCTCATAGCAGCACAAACCCTGTCATGAACTGCACATGCGAGGGATCTAGGTTGTGCGCTCCTTATGAGAATCTAATGCCTAATGACCTGTCACCGTCTCCCATCACCCCTAGATGGGAGTGTCTAGTTGCAGGAAACAAGCTCAGGGCTTCCACTGATTCTACATTATGGTGAGTTGTATAATTATTTCATTATATAATACAATGTAATAATAATAGAAACACAGTGCACAACAAATGTAATGTGCTTGAATCATCCCCAAACCATCCCAGTCCACGGTCTTCCACATTTTGTCTTTTCACAAAATTGTCTTCCACAAAACTGGTCCCTGGTGCCAAAAAGGCTTGGGACCACTGCTTTAAAGCCTTTGCATAGTGCTTAGAATTGAGGGGGAAAAAAAAAACAAAAACAATGTAGCTAGTTGCTACAATCACTATATTGGTGAGTTTCAAAAGGAAAAGAATTCTGTCCCATTTATGCTTGAGCCTTGAGTTGCTAACCAAGCCTGACACAAAATTACTGTTGAAGGGATGTGTGAGTCCTAATTGAAATGAGGCCTCTTAAGGGAATTGTGGACCAAACCCCAAGCAGGCAGAAAGCCGTATCTTAATTATTGCAAGTATTTCAGGCAAGGTGTGGATGGCCATTTGAATTCAAGCAGACTAGGACCTGGGATGAGAAAGAAGGTGTGTACGTGACTTGATCTTTGAACTTTAGCTCACCATCTGGAAGAAGGCTGAGTATTCTCTGCACTCACATAGTAGCTAATGCCTACTCCCCAGCCACCCACAATTCTTTCTGTAGGAAGGCTCGCTAGAATACTTTGTGATATTGGATATTAGTTCCATATTCTACTGTGTATCTTAGTTCAACCAAATTGTAATCATCTGATATTTATTTCTTTTAATATAAATATAAGTATATTAAGTCTTAAAAAAAAAAAAAAAA實時RT-PCRIyg總RNA用于10μ反應中的反轉錄，其中2μ1用于PCR。所有實驗進行兩個重復或三個重復。PCR使用以下引物進行45個循環(變性95°C，15秒鐘；退火/延伸60°C，1分鐘)正向引物5，-TCACTGACAACATCGACTTTGAAG(SEQIDNO:2)；反向引物5，-GGAGAAAACGCTTAGCCATACAG(SEQIDNO3)；探針(SEQIDNO4)6Fam-CTGGCCAGCCCTGCCACTTACCA_Tamra。根據生產商的說明進行絕對定量(PEBiosystems,UserManual2(用戶手冊2))。GAPDH基因用作參考基因。相應地，每個樣品根據其GAPDH含量(表達水平)以及針對校準物(SK-CO-IO)被標準化。相對量通過下式確定2(AC1ccat.i-AC:1sk.cxmo)。繪制相應于含有CCAT-lcDNA的質粒DNA的稀釋液的標準曲線，并使用該曲線確定SK-CO-IO中CCAT-ImRNA的量。將此因子乘以各樣品的相對量以獲得作為fg/lOOngcDNA的CCAT-I量。所有實驗使用ABIPrism7000系統(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)進行。實施例2正常組織以及結腸和直腸的腺癌中的CCAT-I表達通過定量實時PCR檢驗了一組18種正常組織中CCAT-I的表達(圖1)。CCAT-I表達在0.008fg(骨骼肌)至腎中的402fg范圍內。與SK-CO-IO相比，正常組織中的CCAT-I水平低20-倍(腎)至超過350-倍(結腸)。相反，腫瘤組織中的平均CCAT-ImRNA水平為2090fg(p<0.0001,與正常的結腸相比)，并在280fg(27)至超過8000fg(ll)范圍內，圖2。在與腫瘤相鄰的正常組織中，平均CCAT-ImRNA水平為587fg(p=0.04，與正常的結腸相比)，并在0.1fg(N29)至6631fg(N14)范圍內，圖2。在圖2中，研究了腫瘤和相鄰的正常組織的配對樣品。實施例3外周血單核細胞(PBMC)中的CCAT-I校準曲線此研究部分的所有實驗使用ABIPrism7500系統(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)進行。為了對給定樣品中的CCAT-I含量定量測量，生成了校準曲線。結腸癌細胞系HT-29和COLO-205獲自ATCC(Manassas，VA)。外周血單核細胞(PBMC)獲自10位健康志愿者的外周血。PBMC通過菲可(Ficole)梯度方法分離，并在_70°C儲存。將PBMC和結腸癌細胞以結腸癌細胞的增加的濃度混合(1IXlO6,15X105、1IXlO5,15X10\1IXlO4,15X103、1IXlO3,1500、1100、150、110、11，和純的結腸癌細胞)。提取RNA并進行CCAT-I的實時PCR。為了研究CCAT-1的RT_PCR對檢測小群體癌細胞的敏感性，我們生成了校準曲線(圖3-5)。將增加的濃度的結腸癌細胞系(HT29)細胞與IO6個PBMC混合。癌細胞檢測的最低閾值為IO6個PBMC中5個癌細胞的濃度(圖3)。實施例4:正常結腸粘膜、前惡性(pre-malignant)粘膜、腺瘤性息肉、結腸原發性腺癌和遠端轉移灶中的CCAT-I表達將獲自由于良性疾患經歷結腸切除的患者的正常結腸粘膜樣品、與結腸腺癌位點相鄰的正常粘膜樣品、腺瘤性息肉樣品、結腸或直腸的原發性腺癌樣品以及來自肝或腹膜轉移灶的樣品在液氮中急速冷凍。從所有組織樣品中按照先前所述提取RNA并進行CCAT-I的實時定量PCR(圖6)。實施例5:結腸癌患者的血液和淋巴結中隱性轉移疾病的檢測患者年齡超過18歲的具有組織學證實的結腸原發性腺癌的患者被提供參與此研究。具有遠端轉移灶的患者或者接受在先放療或化療的患者被排除在研究外。研究方案得到InstitutionalReviewBoard(IRB,HelsinkiCommittee)Hadassah-Hebrew大學醫學中心的批準。獲得了所有研究參與人員的書面知情同意書。哨兵淋巴結定位和收獲患者經歷包括含有引流淋巴系統的正常楔形腸系膜的結腸腺癌的標準外科切除。取出外科樣本(結腸和腸系膜)之后，立即使用結核菌素注射器和針頭在腫瘤周圍的四個象限漿膜下注射(活體外)2-5ml異舒泛藍染料(PatentBlueV，France)然后在后桌(backtable)上評估腫瘤和淋巴結的總體切除，并解剖腸系膜的所有藍色結。活體外鑒定SLN之后，將沿著結的縱軸通過門(hihim)劃分的一半SLN在液氮中急速冷凍。原發性腫瘤的一小部分(整個腫瘤體積的25%)和正常粘膜的少量樣品(0.5克)相似地急速冷凍。使用單獨的儀器進行活體外SLN和原發性腫瘤切除，以使結的腫瘤細胞污染最小。病理學處理和細胞角蛋白免疫組織化學帶有附著的腸系膜的原發性腫瘤樣本和剩余的一半SLN作為分別標記的樣本被提交至Hadassah-Hebrew大學醫學中心病理學系。一旦證實結腸腺癌的診斷，福爾馬林固定、石蠟包埋的藍色結即經受大約40μm厚度的四個水平(level)的連續步驟切片，并用H&E染色。此外，在塊的第二和第四水平制備兩個未染色的載玻片以用于免疫組織化學染色，一個用于細胞角蛋白抗體染色，另一個充當陰性對照。使用親和素-生物素-過氧化物酶復合物方法對福爾馬林固定和石蠟包埋的SLN切片進行免疫組織化學。商業獲得的細胞角蛋白抗體混合物用于此研究(廣譜角蛋白(Pan-keratin)AE1/AE3，CAM5.2，35bHll,VentanaMedicalSystems,Tucson,AZ)。內源過氧化物酶通過與過氧化氫一起培養來抑制。二氨基聯苯胺四鹽酸鹽(DAB，Biogenex,SanRamon,CA)用作色原體。福爾馬林固定、石蠟包埋的扁桃體切片用作陽性對照，并將來自SLN塊的一個切片與陰性對照緩沖液一起培養。對來自SLN的每個組織塊檢查了總計四個H&E和兩個細胞角蛋白免疫染色切片。如果鑒定了展示結腸癌細胞的解剖學和細胞學特征的強烈陽性的單個細胞或細胞群集，則細胞角蛋白免疫染色被視為陽性。實施例6哨兵淋巴結中的細胞角蛋白-20、CCAT-I的RT-PCRRNA提取所有樣品(腫瘤、淋巴結、血液和正常組織)的總RNA提取通過TriReiigent方法進行。在合成cDNA之前，在凝膠上運行產物以評估RNA質量。將冷凍樣品在干冰中粉碎，使用Polytron勻漿機在Trireiigent(molecularresearchcenter,inc.,Cincinnati,oh,usa)中勻漿，并根據生產商的說明進行處理。實時RT-PCRIyg總RNA用于20μ1反應中使用隨機引物的反轉錄，其中2μ1用于PCR。所有實驗進行兩個重復。PCR進行40個循環(變性95°C，15秒鐘；退火/延伸60°C，1分鐘)，使用CK20特異性引物和Taqrnan探針(AppliedBiosystems，如所需地測定)。對于CCAT-I表達分析，使用的引物如上文所述。每種樣品根據其GAPDH含量進行標準化。針對CK20表達計算對校準物的相對定量。因為在淋巴結和外周血淋巴細胞中，CCAT-I陰性樣品即使通過實時PCR在絕對量上也是不可檢測的，所以相對量確定是無關的，并且分析的樣品僅評估為此轉錄物表達的陽性或陰性。這部分研究的所有實驗使用ABIPrism7500系統(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)進對亍。提取RNA，并對CCAT-I進行實時PCR。結腸癌患者的哨兵淋巴結中的CCAT1表達對所有腫瘤和SLN組織以及獲自無惡性腫瘤患者的2個正常淋巴結和獲自健康個體的3個PBMC樣品進行實時PCR。所有五個陰性對照中無CCAT-I的表達并且僅有痕量CK20。因此，對于CK-20值，“陽性”PCR被設置為與陰性對照值相比RNA含量高50倍，并且因為陰性對照沒有CCAT-I的擴增，我們使用具有CCAT-I含量的每個SLN作為陽性。通過H&E在7/44患者中、通過CK的IHC在14/44患者中(通過卡方檢驗，與H&E相比ρ<0.0001)和通過PCR在23/44患者中(通過卡方檢驗，與H&E相比ρ=0.006,圖6，表1)鑒定了具有CRC轉移灶的哨兵淋巴結。所有H&E陽性SLN通過CK的IHC和通過PCR也是陽性。但是，在僅通過CK的IHC為陽性的七個SLN18中，四個還是通過PCR陽性的。通過H&E和IHC為陰性的另外12個SLN通過PCR為陽性(圖7)。呈現了CK-20和CCAT-I的qPCR擴增曲線(圖8_9)。與CCAT-1相比，通過CK-20擴增了更高量的cDNA。表1通過檢測方法，SLN中CRC轉移灶的存在權利要求1.一種診斷癌癥或癌前病變的方法，包括測量生物樣品中SEQIDNO.l(CCAT-I)或其片段的表達水平；其中所述生物樣品中SEQIDNO.l(CCAT-l)或其片段的表達指示癌癥或癌前病變。2.根據權利要求1所述的診斷癌癥或癌前病變的方法，其中所述方法還包括將在所述生物樣品中測量的所述表達水平與標準進行比較，其中所述生物樣品中SEQIDNO.l(CCAT-I)或其片段的更高的表達水平指示癌癥或癌前病變。3.根據權利要求2所述的診斷癌癥或癌前病變的方法，包括(a)從獲自受治療者的生物樣品中分離核酸；(b)將能夠識別CCAT-I的探針與所述核酸在允許形成雜交復合體的條件下雜交；和(c)將雜交復合體形成與標準進行比較；其中所述生物樣品中更高水平的雜交復合體指示癌癥或癌前病變。4.根據權利要求2所述的診斷癌癥或癌前病變的方法，包括(a)從獲自受治療者的生物樣品中分離核酸；(b)在所述分離的核酸中擴增CCAT-I或其任何片段；(c)顯現CCAT-I擴增產物；和(d)將CCAT-I擴增產物的量與標準進行比較；其中更高水平的CCAT-I擴增產物的存在指示癌癥或癌前病變。5.根據權利要求4所述的方法，其中所述擴增通過使用CCAT-I特異性探針的聚合酶鏈式反應(PCR)進行。6.根據權利要求5所述的方法，其中所述PCR是實時定量PCR。7.根據權利要求2-4中任一項所述的方法，其中所述標準是通過測量未患癌癥的受治療者中CCAT-I的表達水平而確定的。8.根據權利要求2-4中任一項所述的方法，其中所述標準是通過測量所述同一受治療者的非癌組織中CCAT-I的表達水平而確定的。9.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述癌癥選自以下組成的組結腸癌、直腸癌、肺癌和所述癌癥的轉移灶。10.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述癌前病變是腺瘤性息肉。11.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述生物樣品選自以下組成的組組織、血液、尿、糞便和骨髓樣品。12.根據權利要求11所述的方法，其中所述生物樣品是組織活檢。13.根據權利要求1所述的方法，其中所述表達水平是通過原位雜交測量的。14.一種分離的寡核苷酸，包含SEQIDNO:1(CCAT-I)或其互補序列的至少8個連續核苷酸。15.根據權利要求14所述的分離的寡核苷酸，其用作探針或引物。16.根據權利要求15所述的寡核苷酸探針，其中所述探針包含SEQIDNO:5。17.根據權利要求14-16中任一項所述的分離的寡核苷酸，其用于檢測生物樣品中的CCAT-I表達。18.根據權利要求14-16所述的分離的寡核苷酸，其用于診斷癌癥。19.一種用于檢測生物樣品中CCAT-I的表達的方法，包括(a)從所述生物樣品分離核酸；(b)將權利要求15或權利要求16所述的寡核苷酸探針與所述核酸在允許形成雜交復合體的條件下雜交；和(c)將雜交復合體形成與標準進行比較，其中生物樣品中更高水平的雜交復合體指示樣品中CCAT-I的表達。20.根據權利要求19所述的方法，還包括在雜交之前擴增所述生物樣品中轉錄的核酸。21.—種分離的核酸，包含與SEQIDNO:1具有至少85%同源性的CCAT-I或其片段。22.根據權利要求21所述的分離的核酸，包含SEQIDNO:1或其片段的核酸序列。23.—種組合物，包含權利要求14、15、17或18所述的分離的寡核苷酸、權利要求16所述的分離的寡核苷酸探針、或者權利要求21或22所述的分離的核酸。24.一種載體，包含權利要求21或22所述的分離的核酸。25.—種宿主細胞，包含權利要求24所述的載體。26.根據權利要求23所述的組合物，其中所述組合物被連接至基質。27.—種試劑盒，被劃分以容納用于測量獲自受治療者的生物樣品中的CCAT-I表達水平的至少一種試劑，所述至少一種試劑包含與CCAT-I轉錄物的至少一種片段雜交的至少一種寡核苷酸探針或引物。28.—種陣列，包含具有多種區段的基質，其中所述區段中的至少一種包含與CCAT-I或其片段雜交的探針。29.—種癌癥或癌前病變的成像方法，包括(a)向受治療者施用根據權利要求15或16所述的探針；其中所述探針軛合至指示分子；和(b)通過成像裝置檢測軛合至所述探針的指示分子。30.根據權利要求29所述的方法，其中所述指示分子選自以下組成的組放射性同位素、熒光染料、可見染料或納米顆粒。全文摘要本發明涉及在癌細胞中，特別是在結腸癌、直腸癌和肺癌中以及在癌前病變中，特異性表達的稱為結腸癌相關的轉錄物1(CCAT-1)的獨特核酸轉錄物的鑒定、分離和測序。本發明由此提供通過檢測CCAT-1的表達而診斷癌癥的方法，以及用于本發明的檢測方法的分離的多核苷酸、組合物和試劑盒。文檔編號C12Q1/68GK102027128SQ200980107452公開日2011年4月20日申請日期2009年2月11日優先權日2008年2月11日發明者A·O·古雷,A·尼桑,G·里特,H·R·弗羅因德,L·J·歐德,M·羅斯泰徹爾,S·麥翠尼-羅森鮑姆,T·佩雷茨-亞布隆斯基申請人:哈達斯特醫學服務與開發有限公司,路德維格癌癥研究所