專利名稱：抑制運甲狀腺素蛋白表達的組合物和方法
技術領域：
本發明涉及靶向運甲狀腺素蛋白(TTR)基因的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，以及使用 dsRNA抑制TTR表達的方法。
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背景技術：
運甲狀腺素蛋白(TTR)是一種分泌的甲狀腺激素-結合蛋白。TTR結合并轉運視黃醇結合蛋白(RBP)/維生素A及血漿和腦脊液中的血清甲狀腺素(T4)。
正常序列TTR和變異序列TTR均引起淀粉樣變性。正常序列TTR在老年人中引起心臟性淀粉樣變性，稱為老年性系統性淀粉樣變性(SSA)(也稱為老年性心臟性淀粉樣變性(SCA))。SSA通常伴有許多其他器官中的微小沉淀。TTR突變加速TTR淀粉體形成過程，并且是發展臨床上重要的TTR淀粉樣變性(也稱為ATTR(淀粉樣變性-運甲狀腺素蛋白型))的最重要的危險因素。已知超過85種淀粉樣蛋白形成TTR變體引起系統性家族性淀粉樣變性。肝臟是TTR表達的主要位置。其他重要的表達位置包括脈絡叢、視網膜和胰腺。
TTR淀粉樣變性表現為多種形式。當更多地影響周圍神經系統時，該疾病稱為家族性的淀粉樣變性多神經病(FAP)。當主要涉及心臟而不是神經系統時，該疾病稱為家族性淀粉樣變性心肌病(FAC)。第三種主要類型的TTR淀粉樣變性稱為軟腦膜/CNS (中樞神經系統)淀粉樣變性。
已顯示雙鏈RNA分子(dsRNA)以稱為RNA干擾(RNAi)的高度保守調節機制阻斷基因表達。W099/3^19(Fire等)公開了利用長度為至少25個核苷酸的dsRNA抑制秀麗隱桿線蟲(C.elegans)中的基因表達。也顯示dsRNA降解其他有機體中的靶標RNA，所述其他有機體包括植物(例如參見WO 99/53050，Waterhouse等；以及WO 99/61631, Heifetz 等)、果蠅(例如參見Yang，D.，等Curr. Biol. (2000) 10 :1191-1200)和哺乳動物(參見WO 00/44895，Limmer ；和 DE 101 00 586. 5，Kreutzer 等)。
U. S. 20070207974 公開了功能性和超功能性 siRNA。U. S. 20090082300 公開了針對 TTR的反義分子。U. S.專利No. 7，250, 496公開了針對TTR的微RNA。
發明簡述 在一個實施方式中，本發明提供用于抑制運甲狀腺素蛋白(TTR)表達的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA含有有義鏈和反義鏈，所述反義鏈含有與編碼運甲狀腺素蛋白(TTR)的mRNA的一部分互補的區域，其中所述互補區域的長度小于30個核苷酸，所述反義鏈含有 SEQ ID NO :170, SEQ ID NO :450、SEQ ID NO :730 或 SEQ ID NO :1010 的 15 或更多個連續核苷酸。在一個相關實施方式中，所述有義鏈含有SEQ ID NO :169, SEQ ID NO: 449,SEQ ID NO :7 或SEQ ID NO 1009的15或更多個連續核苷酸。在另一個相關實施方式中，所述有義鏈由SEQ ID NO :449組成，所述反義鏈由SEQ ID NO :450組成。在又一個相關實施方式中，所述有義鏈由SEQ ID NO :7 組成，所述反義鏈由SEQ ID NO :730組成。 在另一個相關實施方式中，所述有義鏈由SEQ ID NO :1009組成，所述反義鏈由SEQ ID NO 1010組成。在又一個相關實施方式中，所述dsRNA含有選自表3A、3B、4、6A、6B、7和16的有義鏈和選自表3A、3B、4、6A、6B、7和16的反義鏈。
在某些實施方式中，dsRNA的反義鏈與編碼運甲狀腺素蛋白的mRNA之間的互補區域的長度是19個核苷酸。在另一個實施方式中，互補區域由SEQ ID N0:169組成。在其他實施方式中，如1 ^的各鏈的長度是19、20、21、22、23或對個核苷酸。在又一個實施方式中，各鏈的長度是21個核苷酸。
在某些實施方式中，用于抑制運甲狀腺素蛋白表達的dsRNA不在SEQ ID NO :1331 的位置637上的腺嘌呤核苷酸與SEQ ID NO :1331的位置638上的鳥嘌呤核苷酸之間切割 TTR mRNA。在其他實施方式中，dsRNA在SEQ ID NO 1331的位置636上的鳥嘌呤核苷酸與SEQ IDNO 1331的位置637上的腺嘌呤核苷酸之間切割TTR mRNA。在某些實施方式中， dsRNA與SEQ ID NO :1331的位置6 上的鳥嘌呤核苷酸和SEQ ID NO :1331的位置646上的尿嘧啶核苷酸之間的TTR mRNA退火。
在其它相關實施方式中，本發明提供用于抑制運甲狀腺素蛋白表達的上述dsRNA， 其中所述dsRNA含有一個或多個修飾核苷酸。在相關實施方式中，至少一個修飾核苷酸(或多個核苷酸)選自下組2' -0-甲基修飾核苷酸、含有5'-硫代磷酸基團的核苷酸、以及與膽固醇基衍生物或十二烷酸二癸基酰胺基相連的末端核苷酸。在另一相關實施方式中， 所述修飾核苷酸選自下組2'-脫氧-2'-氟代修飾核苷酸、2'-脫氧-修飾核苷酸、鎖核苷酸、脫堿基核苷酸、2'-氨基-修飾核苷酸、2'-烷基-修飾核苷酸、嗎啉代核苷酸、 氨基磷酸酯(phosphoramidate)、和含有非天然堿基的核苷酸。在某些實施方式中，所述 dsRNA含有至少一個2' -0-甲基修飾核苷酸。
在其他實施方式中，用于抑制運甲狀腺素蛋白表達的上述dsRNA與配體偶聯， 或配制在脂質制劑中。在某些實施方式中，所述脂質制劑可以是LNP制劑、LNPOl制劑、XTC-SNALP制劑或SNALP制劑。在相關實施方式中，XTC-SNALP制劑如下以比例為 57. 1/7. 1/34. 4/1. 4 的 XTC/DPPC/膽固醇/PEG-cDMA 使用 2，2-二亞油基-4-二甲基氨基乙基 _[1，3]_ 二氧戊環(2,2-Dilinoleyl-4-dimethylaminoethyl-[l,3]-dioxolane) (XTC) 以及比例約為7的脂質siRNA。在另一個相關實施方式中，所述dsRNA的有義鏈由SEQ ID NO :1009組成且反義鏈由SEQ ID NO 1010組成，所述dsRNA配制成如下XTC-SNALP制劑以比例為 57. 1/7. 1/34. 4/1. 4 的 XTC/DPPC/膽固醇/PEG-cDMA 使用 2，2-二亞油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊環(XTC)以及比例約為7的脂質siRNA。或者，上述dsRNA可配制成如下 LNP09 制劑使用比例為 50/10/38. 5/1. 5mol% 的 XTC/DSPC/ 膽固醇 /PE(i2(1(1(1-C14 以及比例約為11 1的脂質siRNA。在另一種變形中，所述dsRNA配制成如下LNPll 制劑使用比例為50/10/38. 5/1. 5mol %的MC3/DSPC/膽固醇/PEG2000-CH以及比例約為 11 1的脂質siRNA。在又一個實施方式中，所述dsRNA配制成LNP09制劑或LNPll制劑，并且相對于PBS對照組，在0. 3mg/kg的劑量時降低TTR mRNA水平約85到90%。在又一個實施方式中，所述dsRNA配制成LNP09制劑或LNPll制劑，并且相對于PBS對照組，在 0. lmg/kg的劑量時降低TTR mRNA水平約50%。在又一個實施方式中，所述dsRNA配制成 LNP09制劑或LNPll制劑，并且通過蛋白質印跡測定，相對于PBS對照組以劑量依賴性方式降低TTR蛋白水平。在又一個實施方式中，所述dsRNA配制成如下SNALP制劑以比例為 57. 1/7. 1/34. 4/1. 4 的 DLinDMA/DPPC/ 膽固醇 /PEG2000_cDMA 使用 DLinDMA 以及比例約為 7的脂質siRNA。
在某些實施方式中，本發明提供用于抑制運甲狀腺素蛋白表達的上述dsRNA，其中施用dsRNA至細胞導致通過實時PCR試驗測得的約95%的TTR mRNA表達的抑制，其中所述細胞是H印G2細胞或H印;3B細胞，且其中dsRNA的濃度是ΙΟηΜ。在相關實施方式中，施用dsRNA至細胞導致通過分支DNA試驗測得的約74%的TTR mRNA表達的抑制，其中所述細胞是H印G2細胞或H印;3B細胞，且其中dsRNA的濃度是ΙΟηΜ。在其他相關實施方式中， dsRNA在H印G2細胞中的IC50小于ΙΟρΜ，其中dsRNA的濃度是ΙΟηΜ。在其他相關實施方式中，dsRNA的ED50約為lmg/kg。在其他相關實施方式中，施用dsRNA能降低食蟹猴肝臟中的TTR mRNA約80%，其中dsRNA的濃度是;3mg/kg。在其他相關實施方式中，通過IFN-α 和TNF- α ELISA試驗測定，施用dsRNA不導致人外周血單核細胞(PBMC)的免疫刺激活性。 在其他相關實施方式中，施用dsRNA降低肝臟TTR mRNA水平約97%或血清TTR蛋白水平約90%，其中dsRNA的濃度是6mg/kg。在其他相關實施方式中，施用dsRNA降低肝臟TTR mRNA水平或血清TTR蛋白水平直到22天，其中dsRNA的濃度是6mg/kg或:3mg/kg。在其他相關實施方式中，當以lmg/kg或;3mg/kg施用于需要治療的受試者時，dsRNA抑制血清TTR 蛋白水平直到治療后第14天。在其他相關實施方式中，通過實時PCR測定，濃度為0. InM 的dsRNA使HepIBB細胞中的TTR表達降低98. 9%。在其他相關實施方式中，通過實時PCR 測定，濃度為IOnM的dsRNA使IfepIBB細胞中的TTR表達降低99. 4%。
在其他實施方式中，本發明提供用于抑制運甲狀腺素蛋白(TTR)表達的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA含有有義鏈和反義鏈，所述反義鏈含有與編碼運甲狀腺素蛋白(TTR)的mRNA的一部分互補的區域，其中所述互補區域的長度小于30個核苷酸，且其中所述dsRNA含有選自表3A、3B、4、6A、6B、7和16的有義鏈和選自表3A、3B、4、6A、6B、7和16 的反義鏈。
在另一個實施方式中，本發明提供用于抑制運甲狀腺素蛋白(TTR)表達的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA含有反義鏈，所述反義鏈含有與SEQ ID NO :1331的核苷酸 618-648的15-30個核苷酸互補的區域，且其中所述反義鏈與SEQ ID NO :1331的位置6 上的鳥嘌呤堿基配對。
在某些實施方式中，本發明提供含有以上簡述中所述任何dsRNA的細胞。在某些其他實施方式中，本發明提供含有編碼以上簡述中所述任何dsRNA的至少一條鏈的核苷酸序列的載體。在某些實施方式中，該載體處于細胞中。
在其他實施方式中，本發明提供用于抑制TTR基因表達的藥物組合物，其含有以上簡述中描述的任何dsRNA和藥學可接受的載體。在相關實施方式中，本發明提供用于抑制TTR基因表達的藥物組合物，其含有dsRNA和SNALP制劑，其中所述dsRNA包含長度小于30個核苷酸的反義鏈，所述反義鏈包含SEQ ID NO :170, SEQ ID NO :450、SEQ ID NO: 730或SEQ ID NO :1010的15或更多個連續核苷酸，且其中所述SNALP制劑包含各自比例為 57. 1/7. 1/34. 4/1. 4 的 DlinDMA、DPPC、膽固醇和 PEG2000_cDMA。
在又一個實施方式中，本發明提供抑制細胞中TTR表達的方法，所述方法包括 (a)使細胞與以上簡述中描述的任何dsRNA接觸；和(b)將步驟(a)得到的細胞保持足以獲得TTR基因的mRNA轉錄物降解的時間，從而抑制細胞中TTR基因的表達。
在又一個實施方式中，本發明提供由TTR表達介導的疾病的治療方法，包括將治療有效量的上述簡述中描述的任何dsRNA施用于需要這種治療的人。在相關實施方式中， 所述dsRNA以約0. 01,0. 1,0. 5,1. 0,2. 5或5. Omg/kg施用于人。在又一個相關實施方式中， 所述dsRNA以約1.0mg/kg施用于人。在又一個相關實施方式中，所治療的人患有運甲狀腺素蛋白淀粉樣變性和/或肝臟疾病。在相關實施方式中，給該人進一步提供肝臟移植。在又一個實施方式中，施用dsRNA能降低人類肝臟的TTR mRNA約80%，其中dsRNA的濃度是 :3mg/kg。在其他相關實施方式中，通過IFN- α和TNF- α ELISA試驗測定，施用dsRNA不會導致人類的免疫刺激活性。在又一個相關實施方式中，施用dsRNA降低肝臟TTR mRNA水平約97%或血清TTR蛋白水平約90%，其中dsRNA的濃度是6mg/kg。在又一個相關實施方式中，施用dsRNA降低肝臟TTR mRNA水平和/或血清TTR蛋白水平直到22天，其中dsRNA的濃度是6mg/kg或:3mg/kg。在又一個相關實施方式中，所述dsRNA配制成如下LNP09制劑 使用比例為50/10/38. 5/1. 5m0l%的XTC/DSPC/膽固醇/PEG2000-CH以及比例約為11 1 的脂質siRNA。在又一個相關實施方式中，所述dsRNA配制成如下LNPll制劑使用比例為50/10/38. 5/1. 5mol %的MC3/DSPC/膽固醇/PEG2000-CH以及比例約為11:1的脂質siRNA。在又一個實施方式中，所述dsRNA配制成LNP09制劑或LNPll制劑，并且相對于PBC對照組，在0. ;3mg/kg的劑量時降低TTR mRNA水平約85到90%。在又一個實施方式中，所述dsRNA配制成在LNP09制劑或LNPll制劑，并且相對于PBC對照組，在0. lmg/kg 的劑量時降低TTR mRNA水平約50%。在又一個實施方式中，所述dsRNA配制成LNP09制劑或LNPll制劑，并且通過蛋白質印跡測定，相對于PBC對照組以劑量依賴性方式降低TTR蛋白水平。在另一個相關實施方式中，當以lmg/kg或;3mg/kg施用于人類時，dsRNA抑制血清 TTR蛋白水平直到治療后第14天。在又一個實施方式中，所述dsRNA配制成如下SNALP制劑以比例為 57. 1/7. 1/34. 4/1. 4 的 DLinDMA/DPPC/ 膽固醇 /PEG2000_cDMA 使用 DlinDMA 以及比例約為7的脂質siRNA。
在另一個實施方式中，本發明提供dsRNA在治療由TTR表達介導的疾病中的用途， 包括將治療有效量的上述簡述中描述的任何dsRNA施用于需要這種治療的人。在相關實施方式中，所述dsRNA以約0.01、0. 1、0.5、1.0、2.5或5.011^/1^施用于人。在特別相關的實施方式中，所述dsRNA以約1. Omg/kg施用于人。在又一個相關實施方式中，所治療的人患有運甲狀腺素蛋白淀粉樣變性和/或肝臟疾病。在本發明用途的又一個實施方式中，給所治療的人進一步提供肝臟移植。
在又一個實施方式中，本發明提供dsRNA在抑制細胞中TTR表達的方法中的用途，所述方法包括(a)使細胞與以上簡述中描述的dsRNA接觸；和(b)將步驟(a)得到的細胞保持足以獲得TTR基因的mRNA轉錄物降解的時間，從而抑制細胞中TTR基因的表達。
本發明的一個或更多個實施方式的細節在以下詳述中闡明。本發明的其他特征、 目標和優點將從說明書、附圖和權利要求書中變得明顯。
圖1是轉染TTR siRNA后，培養的人類PBMC中TNF α禾P IFN α的水平圖。
圖2Α和2Β分別是H印G2細胞中AD-183M和AD_183^的劑量響應曲線。
圖3是H印G2細胞中AD-18246的劑量響應曲線。
圖4A和圖4B分別顯示靜脈濃注施用以LNPOl配制的TTR-dsRNA(AD_18324、 AD-18328 和 AD-18246)的轉基因 H129-mTTR-K0/iN0S_K0/hTTR 小鼠中肝臟 mRNA 和血漿蛋白質水平的抑制。
圖5是靜脈輸注以SNALP配制的TTR-dsRNA(AD-183M和AD_183^) 15分鐘后，非人靈長類動物肝臟中的TTR mRNA水平的測定值的匯總圖。
圖6A和圖6B分別顯示靜脈濃注施用SNALP-183^的轉基因小鼠中的人V30M TTR 肝臟mRNA和血清蛋白水平的抑制。測定組平均值，對PBS對照組標準化，然后繪圖。誤差棒代表標準偏差。顯示SNALP-1955和SNALP_183^組相對于PBS的組平均值的降低百分比。(***p < 0. 001，單向方差分析，具有Dunn事后檢驗)。
圖7A和圖7B分別顯示單次靜脈濃注施用SNALP_183^后22天內，轉基因小鼠中的人V30M TTR肝臟mRNA和血清蛋白水平的降低持久性。測定組平均值，TTR/GAPDH mRNA水平對第0天的水平標準化并繪圖。計算并顯示SNALP-183^組在各時間點相對于 SNALP-1955的標準化TTR mRNA水平的降低百分比。(***p < 0. 001，單向方差分析，具有Dunn 事后檢驗)。
圖8顯示單次15分鐘靜脈輸注SNALP_183^后的14天內，非人靈長類動物中TTR 血清蛋白水平的時間進程。
圖9顯示靜脈濃注施用SNALP-183^后，人V30M TTR/HSF-1敲除小鼠的多種組織中的TTR-免疫反應性的降低。E，食道；S，胃；II，腸/十二指腸；14，腸/結腸；N，神經；D, 背根神經節。
圖10顯示15分鐘靜脈輸注XTC-SNALP_183^后，非人靈長類動物肝臟中TTR mRNA水平的測定值。
圖IlA和IlB分別顯示15分鐘靜脈輸注LNP09_183^或LNPl 1-183 后，非人靈長類動物肝臟中TTR mRNA和血清蛋白水平的測定值。圖IlC顯示15分鐘靜脈輸注0. ^ig/ kg LNP09-18328后的觀天內TTR血清蛋白水平較之PBS對照組的時間進程。
圖 12 顯示人 TTR mRNA (參考 kq. NM_000371. 3，SEQ ID NO :1331)的序列。
圖13A和1 分別是人類和大鼠TTR mRNA的序列。圖13A是人類TTR mRNA (參考 kq. NM_000371. 2，SEQ ID NO :1329)的序列。圖 13B 是大鼠 TTR mRNA(參考 kq. ΝΜ_012681. 1，SEQ ID NO :1330)的序列。
圖 14 顯示 NM_000371. 3、NM_000371. 2 和 AD_183^ 的核苷酸比對。
圖15說明與家族性淀粉樣變性神經病、家族性淀粉樣變性心肌病和CNS淀粉樣變性有關的TTR癥狀和突變。
圖16顯示用SNALP-18534進行不同輸注時間的肝臟中TTR mRNA水平的降低。各組動物(η = 4/組)經過15分鐘或1、2、或3小時輸注，施用lmg/kg的SNALP-18534。48小時后，處死大鼠并獲得肝臟。使用Quantigene bDNA試驗從肝臟溶解產物中測定TTR和GAPDH mRNA水平。計算各動物的TTR比GAPDH mRNA水平的比例。測定組平均值并對PBS對照組標準化，然后繪圖。誤差棒代表標準偏差。(_p<0. 001，單向方差分析，具有Bonferroni 事后檢驗，相對于PBS)。
圖17顯示15分鐘靜脈輸注LNP07-185;34或LNP08-185;34后大鼠肝臟中TTR mRNA 水平的測定值。
圖 18 顯示 15 分鐘靜脈輸注 LNP09-185;34 或 LNP11_185;34 后，Sprague-Dawley 大鼠肝臟中內源TTR mRNA水平的體內抑制。各組動物(n = 4/組)經過15分鐘輸注靜脈施用 0. 01,0. 03,0. 1 或 0. 3mg/kg 的 LNP09_18534、LNP_11-18534 ；或 PBS。48 小時后，處死動物并獲得肝臟。使用Quantigene bDNA試驗從肝臟活檢組織溶解產物中測定TTR和GAPDH mRNA水平。計算各動物的TTR比GAPDH mRNA水平的比例。測定組平均值并對PBS對照組標準化，然后繪圖。誤差棒代表標準偏差。
發明詳述 本發明提供dsRNA和利用dsRNA抑制細胞或哺乳動物中TTR基因表達的方法，其中dsRNA靶向TTR基因。本發明也提供用于治療哺乳動物中由TTR基因表達所引起的病理學病癥和疾病例如TTR淀粉樣變性的組合物和方法。dsRNA通過稱為RNA干擾(RNAi)的過程引導mRNA的序列特異性降解。
本發明組合物的dsRNA包括RNA鏈(反義鏈)，其具有長度小于30個核苷酸、通常長度為19-M個核苷酸的區域，且該區域和TTR基因的mRNA轉錄物的至少一部分基本上互補。使用這些dsRNA使得涉及與哺乳動物中TTR表達有關的病理學的基因的mRNA的靶向降解成為可能。極低劑量的TTR dsRNA特別可以特異且有效地介導RNAi，導致TTR基因表達的顯著抑制。使用基于細胞的試驗，本發明人證明靶向TTR的dsRNA可以特異且有效地介導RNAi，導致TTR基因表達的顯著抑制。因此，含有這些dsRNA的方法和組合物可用于治療可由下調TTR介導的病理過程，例如治療肝臟疾病或TTR淀粉樣變性，例如FAP。
含有TTR dsRNA的方法和組合物可用于治療由TTR表達介導的病理過程，例如 TTR淀粉樣變性。在一個實施方式中，治療由TTR表達介導的疾病的方法包括將治療有效量的靶向TTR的dsRNA施用于需要這種治療的人。在一個實施方式中，dsRNA以約0. 01、 0.1,0.5,1.0、2、2·5、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 或25mg/kg施用于人。
以下詳細說明公開了如何制備并使用包含dsRNA的組合物抑制TTR基因表達，以及用于治療由該基因表達所引起的疾病和病癥的組合物和方法。本發明的藥物組合物包含具有反義鏈的dsRNA和藥學可接受的載體，所述反義鏈含有長度小于30個核苷酸、通常長度為19-M個核苷酸的互補區域，且該區域和TTR基因的RNA轉錄物的至少一部分基本上互補。本發明的組合物也包含具有反義鏈的dsRNA，所述反義鏈含有長度小于30個核苷酸、 通常長度為19-M個核苷酸的互補區域，且該區域和TTR基因的RNA轉錄物的至少一部分基本上互補。
dsRNA 的有義鏈可以包括 SEQ ID NO 169,SEQ ID NO :449、SEQ ID NO :729 或 SEQ ID NO 1009的15、16、17、18、19、20、21或更多個連續核苷酸。dsRNA的反義鏈可以包括SEQ ID NO :170,SEQ ID NO :450、SEQ ID NO :730 或 SEQ ID NO :1010 的 15、16、17、18、19、20、21 或更多個連續核苷酸。在一個實施方式中，dsRNA的有義鏈可由SEQ ID NO :449或其片段組成，反義鏈可以由SEQ ID NO :450或其片段組成。在一個實施方式中，dsRNA的有義鏈可由SEQ ID NO :7 或其片段組成，反義鏈可以由SEQ ID NO :730或其片段組成。在一個實施方式中，dsRNA的有義鏈可由SEQ ID NO :1009或其片段組成，反義鏈可以由SEQ ID NO 1010或其片段組成。
在一個實施方式中，dsRNA可以包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個修飾核苷酸。在一個實施方式中，修飾核苷酸可包括2' -0-甲基修飾核苷酸、含有5'-硫代磷酸基團的核苷酸、和/或與膽固醇基衍生物或十二烷酸二癸基酰胺基相連的末端核苷酸。在一個實施方式中，修飾核苷酸可包括2'-脫氧-2'-氟代修飾核苷酸、2'-脫氧-修飾核苷酸、鎖核苷酸、脫堿基核苷酸、2'-氨基-修飾核苷酸、2'-烷基-修飾核苷酸、嗎啉代核苷酸、氨基磷酸酯、和/或含有非天然堿基的核苷酸。
在一個實施方式中，dsRNA的互補區域的長度至少為10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21或更多個核苷酸。在一個實施方式中，互補區域包括SEQ ID NO :169的10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或更多個連續核苷酸。
在一個實施方式中，dsRNA的各鏈長度為 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 沈、27、觀、29、30或更多個核苷酸。在一個實施方式中，dsRNA包含選自表3A、3B、4、6A、6B、 7和16的有義鏈，或其10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21個核苷酸片段，和選自表 3A、3B、4、6A、6B、7 禾口 16 的反義鏈，或其 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或 21 個核苷酸片段。
在一個實施方式中，由實時PCR試驗測定，dsRNA施用于細胞導致約40%、45%、 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%或以上的 TTR mRNA 表達的抑制。在一個實施方式中，由實時PCR試驗測定，dsRNA施用于細胞導致約40%到45%、45%到50%、 50% 到 55%、55% 到 60%、60% 到 65%、65% 到 70%、70% 到 75%、75% 到 80%、80% 到 85%、85%到90%、90%到95%或以上的TTR mRNA表達的抑制。在一個實施方式中，由分支 DNA 試驗測定，dsRNA 施用于細胞導致約 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、 80%、90%、95%或以上的TTR mRNA表達的抑制。在一個實施方式中，由分支DNA試驗測定，dsRNA 施用于細胞導致約 40%到 45%,45%IlJ 50%、50%到 55%、55%到 60%、60%到 65%,65%IlJ 70%、70%到 75%、75%到 80%、80%到 85%、85%到 90%、90%到 95%或以上的TTR mRNA表達的抑制。
在一個實施方式中，dsRNA的 IC50 小于 0. 01ρΜ、0. ΙρΜ、1ρΜ、5ρΜ、10pM、IOOpM 或 ΙΟΟΟρΜ。在一個實施方式中，dsRNA 的 ED50 約為 0. 01、0· 1、1、5 或 10mg/kgo 在一個實施方式中，施用dsRNA可以降低食蟹猴中的TTR mRNA約40 %、45 %、 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%或以上。在一個實施方式中，施用 dsRNA 可以降低肝臟 TTR mRNA 水平約 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、 95% 或以上，或血清 TTR 蛋白水平約 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 90%、95%或以上。在一個實施方式中，施用dsRNA降低肝臟TTR mRNA水平和/或血清TTR蛋白水平直到 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25
或更多天。
在一個實施方式中，dsRNA配制成 LNP 制劑并在 0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7、 0. 8、0. 9或lmg/kg劑量下相對于PBC對照組降低TTR mRNA水平約40% ,45% ,50% ,55%, 60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%或以上。在一個實施方式中，dsRNA配制成LNP制劑并通過蛋白質印跡測得相對于PBC對照組降低TTR蛋白水平約40 %、45 %、50 %、55 %、 60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%或以上。在一個實施方式中，當施用于需要治療的受試者時，dsRNA 在 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24或25mg/kg的劑量下抑制血清TTR蛋白水平直到治療后的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 或 25 天。
因此，在一些方面，含有TTR dsRNA和藥學可接受載體的藥物組合物、使用該組合物抑制TTR基因表達的方法和使用該藥物組合物治療由TTR基因表達引起的疾病的方法是本發明的特征。
I.定義 為方便起見，下文提供用于說明書、實施例和權利要求書中的某些術語和短語的意思。如果本說明書其他部分中術語的用法和本節提供的定義有著明顯的差異，采用本節的定義。
通常〃 G"、“ C"、“ A"和〃 U"各自代表分別含有鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶作為堿基的核苷酸。“T”和“dT”在本文中可互換使用，指的是核堿基是胸腺嘧啶的脫氧核糖核苷酸，例如脫氧核糖胸腺嘧啶。然而，應理解術語“核糖核苷酸”或“核苷酸”或 “脫氧核糖核苷酸”也可指下文進一步詳述的修飾核苷酸，或取代替換部分。本領域技術人員知道鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可被其他部分取代，而基本上不改變含有攜帶這種替換部分的核苷酸的寡核苷酸的堿基配對性質。例如但不限于，含有次黃嘌呤核苷作為其堿基的核苷酸可以和含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸堿基配對。因此，本發明核苷酸序列中含有尿嘧啶、鳥嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以被含有例如次黃嘌呤核苷的核苷酸替換。含有這種替換部分的序列是本發明的實施方式。
如本文所使用，“運甲狀腺素蛋白”(“TTR”)指的是細胞中的基因。TTR又名ATTR、 HsT2651、PALB、前清蛋白、TBPA和運甲狀腺素蛋白(前清蛋白，淀粉樣變性類型I)。人TTR mRNA轉錄物的序列可在NM_000371中發現。小鼠TTR mRNA序列可在NM_013697. 2中發現， 大鼠TTR mRNA的序列可在NM_012681. 1中發現。
如本文所使用，“目標序列”指的是在TTR基因的轉錄期間形成的mRNA分子的核苷酸序列的連續部分，包括為初級轉錄產物的RNA加工產物的mRNA。
如本文所使用，術語“含有序列的鏈”指的是含有由相當于使用標準核苷酸命名法描述的序列的核苷酸鏈的寡核苷酸。
如本文所使用，除非另有陳述，術語“互補”當用于相對于第二核苷酸序列描述第一核苷酸序列時，指的是含有第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一定條件下和含有第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸雜交并形成雙鏈結構的能力，如本領域技術人員所理解。這種條件例如可以是嚴格條件，其中嚴格條件可以包括400mM NaCl, 40mM PIPES pH 6. 4，ImM EDTA，50°C或70°C放置12-16小時，然后清洗。可以應用其他條件，例如有機體內可能遇到的生理學相關條件。本領域技術人員將能根據雜交核苷酸的最終應用決定最適合于兩個序列的互補性測試的這套條件。
這包括在第一和第二核苷酸序列的整個長度上使含有第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸和含有第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸堿基配對。這樣的序列在此可以稱為相對于彼此“完全互補”。然而，當第一序列在此稱為相對于第二序列“基本上互補” 時，兩個序列可以完全互補，或它們在雜交時可以形成一個或多個，但通常不超過4、3或2 個錯配堿基對，而保持在與它們的最終應用最相關的條件下雜交的能力。然而，當兩個寡核苷酸設計成在雜交時形成一個或多個單鏈突出端時，這樣的突出端時將不會被認為是關于互補性測定的錯配。例如，一種dsRNA含有一個長度為21個核苷酸的寡核苷酸和另一個長度為23個核苷酸的寡核苷酸，其中較長的寡核苷酸包含與較短的寡核苷酸完全互補的21 個核苷酸序列，則基于本文描述的目的，該dsRNA仍然可以稱為“完全互補”。
本文使用的“互補”序列也可以包括，或完全由以下堿基對形成 非-Watson-Crick堿基對和/或由非天然和修飾核苷酸形成的堿基對，只要滿足上述關于其雜交能力的要求。這種非-Watson-Crick堿基對包括但不限于G:U擺動(Wobble)或 Hoogstein堿基配對。
本文的術語“互補”、“完全互補”和“基本上互補”可相對于dsRNA的有義鏈和反義鏈之間，或dsRNA的反義鏈和目標序列之間的堿基配對使用，如將從其使用的上下文理解。
如本文所使用，與信使RNA(mRNA) “的至少一部分基本上互補”的多核苷酸指的是與包括5’ UTR、開放閱讀框(ORF)或3' UTR的目標mRNA(例如，編碼TTR的mRNA)的連續部分基本上互補的多核苷酸。例如，如果該序列與編碼TTR的mRNA的非中斷部分基本上互補，則多核苷酸和TTR mRNA的至少一部分互補。
本文使用的術語“雙鏈RNA”或“dsRNA”指的是核糖核酸分子復合物，其具有含有兩個反平行的并如上定義基本上互補的核酸鏈的雙鏈結構。通常，各鏈的大多數核苷酸是核糖核苷酸，但如本文詳細描述，每一條鏈或者兩條鏈也可以包括至少一個非核糖核苷酸， 例如，脫氧核糖核苷酸和/或修飾核苷酸。另外，如說明書中所使用，“dsRNA”可以包括對核苷酸的化學修飾，包括多個核苷酸的實質性修飾并包括本文公開或現有技術已知的所有類型的修飾。為本說明書和權利要求書的目的，“dsRNA”包括任何這樣的修飾，如siRNA型分子中使用的。
形成雙鏈結構的兩條鏈可以是一條較大的RNA分子的不同部分，或它們可以是分離的RNA分子。當這兩條鏈是一條較大分子的一部分，且因此通過形成雙鏈結構的一條鏈的3'端和相應另一條鏈的5’端之間的核苷酸的連續鏈相連時，連接的RNA鏈稱為“發夾環”。當這兩條鏈通過不同于形成雙鏈結構的一條鏈的3'端和相應另一鏈的5’端之間的核苷酸的連續鏈的手段共價相連時，該連接結構稱為“連接子”。該RNA鏈可以具有相同或不同數目的核苷酸。堿基對的最大數目是dsRNA的最短鏈的核苷酸數減去存在于雙鏈體中的任何突出端。除雙鏈結構之外，dsRNA還可以包含一個或多個核苷酸突出端。術語“siRNA” 在本文中也用于指上述的dsRNA。
如本文所使用，當dsRNA的一條鏈的3'端延伸超過另一條鏈的5'端時，或反之亦然，“核苷酸突出端”指的是未配對的核苷酸或從dsRNA的雙鏈結構中突出的核苷酸。“平的”或“平端”指的是dsRNA的這一端沒有未配對的核苷酸，S卩，沒有核苷酸突出端。“平端” dsRNA是在其全長上為雙鏈的dsRNA，S卩，在分子的任一端沒有核苷酸突出端。
術語“反義鏈”指的是包括與目標序列基本上互補的區域的dsRNA鏈。如本文所使用，術語“互補區域”指的是與一個序列，例如本文定義的目標序列，基本上互補的反義鏈上的區域。當互補區域不與目標序列完全互補時，末端區域最能容忍錯配，如果存在，錯配通常在末端區域或，例如在5'和/或3'端的6、5、4、3或2個核苷酸內。
本文所使用的術語“有義鏈”指的是含有與反義鏈區域基本上互補的區域的dsRNA 鏈。
如本文所使用，術語“SNALP”指的是穩定的核酸-脂質顆粒。SNALP代表包有減少的含水內部的脂質囊泡，所述含水內部含有核酸例如dsRNA或dsRNA由此轉錄的質粒。 SNALP例如描述在美國專利申請公布說明書Nos. 20060240093、20070135372和2008年4月 15日提交的USSN61/045，228。這些申請以引用方式合并于此。
當指dsRNA時，“引入細胞內”意思是促進攝入或者吸收到細胞內，如本領域技術人員所理解的。dsRNA的吸收或攝入可通過未受幫助的擴散或主動細胞代謝過程發生，或通過助劑或裝置發生。該術語的意思不限于體外細胞，也可以將dsRNA“引入細胞內”，其中該細胞是活的有機體的部分。在這種情況下，引入細胞內將包括遞送到有機體。例如，對于體內遞送，可將dsRNA注入組織部位或全身施用。體外引入細胞內包括本領域已知方法，例如電穿孔法和脂質轉染法。其他方法在本文描述或是本領域已知的。
當涉及TTR基因時，本文的術語“沉默”、“抑制表達”、“下調表達”、“抑制表達”等指的是TTR基因表達的至少部分抑制，表現為可以從第一細胞或細胞群中分離的mRNA的量相對于第二細胞或細胞群的減少，所述第一細胞或細胞群中TTR基因被轉錄，并且已經經過處理，以致TTR基因的表達被抑制，所述第二細胞或細胞群與第一細胞或細胞群基本上相同，但其沒有經過如此處理(對照細胞)。抑制程度通常用以下公式表示
權利要求
1.用于抑制運甲狀腺素蛋白(TTR)表達的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA含有有義鏈和反義鏈，所述反義鏈含有與編碼運甲狀腺素蛋白(TTR)的mRNA的一部分互補的區域，其中所述互補區域的長度小于30個核苷酸，所述反義鏈含有SEQ ID NO :170,SEQ ID NO :450, SEQ ID NO :730或SEQ ID NO :1010的15或更多個連續核苷酸。
2.權利要求1的dsRNA，其中所述有義鏈含有SEQID NO :169、SEQ ID NO :449、SEQ ID NO 729或SEQ ID NO :1009的15或更多個連續核苷酸。
3.權利要求1的dsRNA，其中所述有義鏈由SEQID NO :449組成，所述反義鏈由SEQ ID NO 450 組成。
4.權利要求1的dsRNA，其中所述有義鏈由SEQID NO :7 組成，所述反義鏈由SEQ ID NO 730 組成。
5.權利要求1的dsRNA，其中所述有義鏈由SEQID NO :1009組成，所述反義鏈由SEQ ID NO 1010 組成。
6.權利要求1的dsRNA，其中所述dsRNA含有選自表3A、3B、4、6A、6B、7和16的有義鏈和選自表3A、3B、4、6A、6B、7和16的反義鏈。
7.權利要求1或2或6的dsRNA，其中所述互補區域的長度是19個核苷酸。
8.權利要求1或2或6的dsRNA，其中所述互補區域由SEQID NO :169組成。
9.權利要求1或2或6的dsRNA，其中所述dsRNA的各鏈長度是19、20、21、22、23或M 個核苷酸。
10.權利要求1或2或6的dsRNA，其中各鏈長度是21個核苷酸。
11.權利要求1、2、3、4、5或6的dsRNA，其中所述dsRNA不在SEQID N0:1331的位置637上的腺嘌呤核苷酸與SEQ ID NO :1331的位置638上的鳥嘌呤核苷酸之間切割TTR mRNA。
12.權利要求1、2、3、4、5或6的dsRNA，其中所述dsRNA在SEQID NO :1331的位置636 上的鳥嘌呤核苷酸與SEQ ID NO 1331的位置637上的腺嘌呤核苷酸之間切割TTR mRNA。
13.權利要求1、2、3、4、5或6的dsRNA，其中所述dsRNA與SEQID NO 1331的位置628 上的鳥嘌呤核苷酸和SEQ ID NO :1331的位置646上的尿嘧啶核苷酸之間的TTR mRNA退火。
14.權利要求1、2、3、4、5或6的dsRNA，其中所述dsRNA含有至少一個修飾核苷酸。
15.權利要求14的dsRNA，其中至少一個所述修飾核苷酸選自下組2'-0-甲基修飾的核苷酸、含有5'-硫代磷酸基團的核苷酸、以及與膽固醇基衍生物或十二烷酸二癸基酰胺基相連的末端核苷酸。
16.權利要求14的dsRNA，其中所述修飾核苷酸選自下組2'-脫氧_2'-氟代修飾核苷酸、2'-脫氧-修飾核苷酸、鎖核苷酸、脫堿基核苷酸、2'-氨基-修飾核苷酸、 2'-烷基-修飾核苷酸、嗎啉代核苷酸、氨基磷酸酯、和含有非天然堿基的核苷酸。
17.權利要求14的dsRNA，含有至少一個2'-0-甲基修飾核苷酸。
18.權利要求1、2、3、4、5或6的dsRNA，其中所述dsRNA與配體偶聯。
19.權利要求1、2、3、4、5或6的dsRNA，其中所述dsRNA配制在脂質制劑中。
20.權利要求19的dsRNA，其中所述dsRNA配制成LNP制劑、LNPOl制劑、XTC-SNALP制劑或SNALP制劑。
21.權利要求19的dsRNA，其中所述dsRNA配制成如下XTC-SNALP制劑以比例為 57. 1/7. 1/34. 4/1. 4 的 XTC/DPPC/膽固醇/PEG-cDMA 使用 2，2-二亞油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]_ 二氧戊環(XTC)以及比例約為7的脂質siRNA。
22.權利要求19的dsRNA，其中所述有義鏈由SEQID NO 1009組成且所述反義鏈由SEQ ID NO 1010組成，所述dsRNA配制成如下XTC-SNALP制劑以比例為57. 1/7. 1/34. 4/1. 4 的XTC/DPPC/膽固醇/PEG-cDMA使用2，2- 二亞油基_4_ 二甲基氨基乙基_[1，3]- 二氧戊環(XTC)以及比例約為7的脂質SiRNA0
23.權利要求19的dsRNA，其中所述dsRNA配制成如下LNP09制劑使用比例為 50/10/38. 5/1. 5mol % 的 XTC/DSPC/ 膽固醇 /PEG2000-CH 以及比例約為 11 1 的月旨質siRNA。
24.權利要求19的dsRNA，其中所述dsRNA配制成如下LNPl1制劑使用比例為 50/10/38. 5/1. 5mol % 的 MC3/DSPC/ 膽固醇 /PEG2000-CH 以及比例約為 11 1 的月旨質siRNA。
25.權利要求19的dsRNA，其中所述dsRNA配制成LNP09制劑或LNPll制劑，并且相對于PBS對照組，在0. 3mg/kg的劑量時降低TTR mRNA水平約85到90%。
26.權利要求19的dsRNA，其中所述dsRNA配制成LNP09制劑或LNPll制劑，并且相對于PBS對照組，在0. lmg/kg的劑量時降低TTR mRNA水平約50%。
27.權利要求19的dsRNA，其中所述dsRNA配制成LNP09制劑或LNPll制劑，并且通過蛋白質印跡測定，相對于PBS對照組以劑量依賴性方式降低TTR蛋白水平。
28.權利要求19的dsRNA，其中所述dsRNA配制成如下SNALP制劑以比例為 57. 1/7. 1/34. 4/1. 4 的 DLinDMA/DPPC/ 膽固醇 /PEG2000_cDMA 使用 DLinDMA 以及比例約為 7的脂質siRNA。
29.權利要求1、2、3、4、5或6的dsRNA，其中施用所述dsRNA至細胞導致通過實時PCR 試驗測得的約95%的TTR mRNA表達抑制，其中所述細胞是H印G2細胞或HepIBB細胞，且其中dsRNA的濃度是ΙΟηΜ。
30.權利要求1、2、3、4、5或6的dsRNA，其中施用dsRNA至細胞導致通過分支DNA試驗測得的約74%的TTR mRNA表達抑制，其中所述細胞是H印G2細胞或IfepIBB細胞，且其中 dsRNA的濃度是ΙΟηΜ。
31.權利要求1、2、3、4、5或6的dsRNA，其中所述dsRNA在H印G2細胞中的IC50小于 ΙΟρΜ，且其中dsRNA的濃度是ΙΟηΜ。
32.權利要求1、2、3、4、5或6的dsRNA，其中所述dsRNA的ED50約為lmg/kg。
33.權利要求1、2、3、4、5或6的dsRNA，其中施用dsRNA降低食蟹猴肝臟中的TTRmRNA 約80%，其中dsRNA的濃度是3mg/kg。
34.權利要求1、2、3、4、5或6的dsRNA，其中通過IFN-α和TNF-aELISA試驗測定，施用dsRNA不導致人外周血單核細胞(PBMC)中的免疫刺激活性。
35.權利要求1、2、3、4、5或6的dsRNA，其中施用dsRNA降低肝臟TTRmRNA水平約97% 或血清TTR蛋白水平約90%，其中dsRNA的濃度是6mg/kg。
36.權利要求1、2、3、4、5或6的dsRNA，其中施用dsRNA降低肝臟TTRmRNA水平和/ 或血清TTR蛋白水平直到22天，其中dsRNA的濃度是6mg/kg或:3mg/kg。
37.權利要求1、2、3、4、5或6的dsRNA，其中當以lmg/kg或;3mg/kg施用于需要治療的受試者時，dsRNA抑制血清TTR蛋白水平直到治療后第14天。
38.權利要求1、2、3、4、5或6的dsRNA，其中通過實時PCR測定，濃度為0.InM的dsRNA 使H印;3B細胞中的TTR表達降低98. 9%。
39.權利要求1、2、3、4、5或6的dsRNA，其中通過實時PCR測定，濃度為IOnM的dsRNA 使H印;3B細胞中的TTR表達降低99. 4%。
40.用于抑制運甲狀腺素蛋白(TTR)表達的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA含有有義鏈和反義鏈，所述反義鏈含有與編碼運甲狀腺素蛋白(TTR)的mRNA的一部分互補的區域，其中所述互補區域的長度小于30個核苷酸，且其中所述dsRNA含有選自表3A、3B、4、 6A、6B、7和16的有義鏈和選自表3A、3B、4、6A、6B、7和16的反義鏈。
41.用于抑制運甲狀腺素蛋白(TTR)表達的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA含有反義鏈，所述反義鏈含有與SEQ ID NO 1331的核苷酸618-648的15-30個核苷酸互補的區域，且其中所述反義鏈與SEQID NO 1331的位置6 上的鳥嘌呤堿基配對。
42.含有權利要求1-41的dsRNA的細胞。
43.含有編碼權利要求1-41的dsRNA的至少一條鏈的核苷酸序列的載體。
44.含有權利要求43的載體的細胞。
45.用于抑制TTR基因表達的藥物組合物，其含有權利要求1-41的dsRNA和藥學可接受的載體。
46.用于抑制TTR基因表達的藥物組合物，其含有dsRNA和SNALP制劑，其中所述dsRNA 包含長度小于30個核苷酸的反義鏈，該反義鏈包含SEQ ID NO :170、SEQ ID NO :450、SEQ ID NO :730或SEQ IDNO 1010的15或更多個連續核苷酸，且其中所述SNALP制劑包含各自比例為 57. 1/7. 1/34. 4/1. 4 的 DlinDMA, DPPC、膽固醇禾口 PEG2000_cDMA。
47.抑制細胞中TTR表達的方法，所述方法包括(a)使細胞與權利要求1-41的dsRNA接觸；和(b)將步驟(a)得到的細胞保持足以獲得TTR基因的mRNA轉錄物降解的時間，從而抑制細胞中TTR基因的表達。
48.治療由TTR表達介導的疾病的方法，包括將治療有效量的權利要求1-41的dsRNA 施用于需要這種治療的人。
49.權利要求48所述的方法，其中所述dsRNA以約0.01、0. 1、0. 5、1. 0、2. 5或5. Omg/ kg施用于人。
50.權利要求48-49的方法，其中所述dsRNA以約1.Omg/kg施用于人。
51.權利要求48-50的方法，其中所述的人患有運甲狀腺素蛋白淀粉樣變性。
52.權利要求48-51的方法，其中所述的人患有肝臟疾病。
53.權利要求48-52的方法，其中所述的人還進行肝臟移植。
54.權利要求48-53的方法，其中施用dsRNA降低人肝臟的TTRmRNA約80%，其中dsRNA 的濃度是3mg/kg。
55.權利要求48- 的方法，其中通過IFN-α和TNF-αELISA試驗測定，施用dsRNA不會導致人的免疫刺激活性。
56.權利要求48-55的方法，其中施用dsRNA降低肝臟TTRmRNA水平約97%或血清TTR蛋白水平約90%，其中dsRNA的濃度是6mg/kg。
57.權利要求48-56的方法，其中施用dsRNA降低肝臟TTRmRNA水平和/或血清TTR 蛋白水平直到22天，其中dsRNA的濃度是6mg/kg或:3mg/kg。
58.權利要求48-57的方法，其中所述dsRNA配制成如下LNP09制劑使用比例為50/10/38. 5/1. 5mol %的XTC/DSPC/膽固醇/PEG2000-CH以及比例約為11 1的月旨質siRNA。
59.權利要求48-58的方法，其中所述dsRNA配制成如下LNPl1制劑使用比例為50/10/38. 5/1. 5mol %的MC3/DSPC/膽固醇/PEG2000-CH以及比例約為11 1的月旨質siRNA。
60.權利要求48-59的方法，其中所述dsRNA配制成LNP09制劑或LNPll制劑，并且相對于PBC對照組，在0. 3mg/kg的劑量時降低TTR mRNA水平約85%到90%。
61.權利要求48-60的方法，其中所述dsRNA配制成LNP09制劑或LNPll制劑，并且相對于PBC對照組，在0. lmg/kg的劑量時降低TTR mRNA水平約50%。
62.權利要求48-61的方法，其中所述dsRNA配制成LNP09制劑或LNPll制劑，并且通過蛋白質印跡測定，相對于PBC對照組，其以劑量依賴性方式降低TTR蛋白水平。
63.權利要求48-62的方法，其中當以lmg/kg或;3mg/kg施用于人時，dsRNA抑制血清 TTR蛋白水平直到治療后第14天。
64.權利要求48-63的方法，其中所述dsRNA配制成如下SNALP制劑以比例為 57. 1/7. 1/34. 4/1. 4 的 DLinDMA/DPPC/ 膽固醇 /PEG2000_cDMA 使用 DLinDMA 以及比例約為 7的脂質siRNA。
65.dsRNA在治療由TTR表達介導的疾病中的應用，包括將治療有效量的權利要求1_41 的dsRNA施用于需要這種治療的人。
66.權利要求65的應用，其中所述dsRNA以約0.01、0. 1、0· 5、1. 0、2· 5或5. Omg/kg施用于人。
67.權利要求65-66的應用，其中所述dsRNA以約1.Omg/kg施用于人。
68.權利要求65-67的應用，其中所述的人患有運甲狀腺素蛋白淀粉樣變性。
69.權利要求65-68的應用，其中所述的人患有肝臟疾病。
70.權利要求65-69的應用，其中所述人還進行肝臟移植。
71.dsRNA在抑制細胞中TTR表達中的應用，所述應用包括(a)使細胞與權利要求1-41的dsRNA接觸；和(b)將步驟(a)得到的細胞保持足以獲得TTR基因的mRNA轉錄物降解的時間，從而抑制細胞中TTR基因的表達。
全文摘要
本發明涉及靶向運甲狀腺素蛋白(TTR)基因的雙鏈核糖核酸(dsRNA)，以及用所述dsRNA抑制TTR表達的方法。
文檔編號C12N15/11GK102186978SQ200980141740
公開日2011年9月14日 申請日期2009年10月20日 優先權日2008年10月20日
發明者D·W·薩, G·辛克爾, R·阿爾瓦雷茲, S·米爾斯泰恩, 陳慶敏 申請人:阿爾尼拉姆醫藥品有限公司