用于及時護理分析儀的基于微流的實驗室測試卡的制作方法

專利名稱：用于及時護理分析儀的基于微流的實驗室測試卡的制作方法
用于及時護理分析儀的基于微流的實驗室測試卡發明人薩妮·帕克·金姆、申英植、劉長庚、羅里·凱利和貝琪·陳相關申請的交叉引用本申請要求2008年12月5日提交的題目為“INTEGRATED SEMIC0NDUCT0R-NAN0SENS0R ANALYSIS SYSTEM (集成半導體-納米傳感器分析系統)”的美國臨時專利申請系列第61/120，253號的權益。背景在諸如血液、尿和其他體液的生物樣品中的抗體、蛋白、肽、核酸、適體和某些細胞類型的細胞受體或物質的檢測被用于診斷疾病、估計治療功效和許多其他目的。在當前的診斷測定需要患者拜訪醫師或出行到實驗室時，及時護理測定可由初級護理醫師在他們的辦公室進行、或由患者在其家中進行以及由保健工作者在遠程地理場所進行或對臥床的患者在醫院中進行。微流技術已被應用于解決一些常規實驗室技術缺點的嘗試中。例如，微流技術需要明顯較少量的試劑。然而，微流技術通常能夠處理明顯較少體積的生物樣品，這可能會在待檢測的特定細胞或物質的量是極為稀少或微小的量時限制靈敏度。需要的是便宜并且不需大量勞動的用于檢測生物樣品中特定物質的系統和方法。需要的是能夠在及時護理時得到快速結果的用于檢測生物樣品中的特定物質的系統和方法。需要的是極為靈敏的用于檢測生物樣品中特定物質的系統和方法。附圖簡述

圖1A-1B顯示適合用于測試卡的及時護理(POC)分析儀的一個實施方案。圖2A-2B顯示測試卡的一個實施方案的裝配圖和分解圖。圖3A顯示初級分離室的放大圖。圖IBB顯示孔的放大圖。圖4A-4B顯示捕獲通道238的一個實施方案的透視圖和剖面圖。圖5A-5B顯示粒子檢測器的一個實施方案的放大圖。圖5C顯示粒子檢測器的另一個實施方案的放大圖。圖6A-6B顯示測試卡的另一個實施方案的裝配圖和分解圖。圖7A-7B顯示測試卡的另一個實施方案的裝配圖和分解圖。圖8A-8B分別顯示初級分離層的頂側和底側的放大圖。圖9A顯示納米線傳感器的一個實施方案的放大圖。圖9B顯示納米線傳感器的示意性響應。圖9C顯示肽核酸(PNA)和巰基乙醇的混合的自裝配單層(SAM)的示意性代表圖。優選實施方案詳述圖1A-1B顯示適合用于測試卡200的及時護理(POC)分析儀100的一個實施方案。 POC分析儀100包括卡槽112、顯示器114和控制器116。卡槽112被為構造為接收測試卡 200。顯示器114顯示POC分析儀100的狀態和測試結果。控制器116打開和關閉POC分析儀100、開始和停止測試并改變顯示器114。POC分析儀100包括用于對測試卡200施加壓力的壓力裝置，例如注射器、蠕動泵或任何其他合適的泵。POC分析儀100還包括電接觸件，其被構造為與測試卡200上的相應的電接觸件匹配。測試卡200被設計為接收樣品，并然后使用POC分析儀100定量或計數樣品中的特定物質。樣品可以是全血、血漿、血清、細針抽吸物(fine needle aspirate)、骨髓樣品、 脊髓液、囊內液、關節液或滑液、子宮內膜抽吸樣品、胃樣品、眼內液、卵巢液、組織培養介質、尿或其他生物樣品或非生物樣品。在一個實施方案中，測試卡200被構造為接收全血樣品并提供樣品中循環腫瘤細胞(CTC)數目的近似計數。在同一實施方案中或其他實施方案中，測試卡200可用于提供樣品中缺少⑶45、⑶14、⑶33、⑶16、⑶對、⑶64或⑶15細胞表面標志物中任一種的白細胞數目的近似計數。在同一實施方案或其他的實施方案中，測試卡200可用于提供具有如下的特異性表面標志物的細胞的近似計數例如，癌細胞的表皮生長因子受體(EGFR)擴增、 癌干細胞的CD133或抗原特異性的T細胞受體。測試卡200可以由塑料、玻璃或任何其他合適的材料制備。測試卡200可以由一個或多個層構成。所述層可以使用環氧樹脂、熱粘合或任何其他合適的方法和/或材料被連接在一起。測試卡200可以具有大約70mm χ 55mm χ 5mm的尺度。測試卡200可以與緩沖液源(buffer supply) 一起包裝，并且可以具有電接觸件，該電接觸件被排列為有利于訪問。圖2A-2B顯示測試卡200的一個實施方案的裝配圖和分解圖。測試卡200適于接收全血樣品并提供CTC的近似計數。測試卡200由一疊層構成，包括頂層210、粒子檢測層 220、初級分離層230和廢物收集層260。依據制造和成本的考慮，這些層的功能性可以被組合或分成更少的層或更多的層。初級分離層230包括樣品入口 231。樣品入口 231能夠接收大約0. Olml至IOml的大樣品。樣品入口 231具有將阻塞機會最小化的尺寸。樣品入口 231可以具有大約0.5mm 至10mm，并且優選大約5mm的直徑。樣品入口 231可以穿過頂層210和粒子檢測層220到達初級分離層230。初級分離層230還包括與樣品入口 231流體連通的初級分離室235。初級分離層 230可以還包括與初級分離室235流體連通的捕獲通道238。圖3A顯示初級分離室235的放大圖。初級分離室235包括過濾表面236。過濾表面236包括多個合適尺寸的孔237。對于檢測全血中的CTC，孔237具有阻止CTC和較大的白細胞穿過，同時容許較小的白細胞、紅細胞、血小板、血漿和其他血液組分穿過的尺寸，或者具有大約1 μ m至30 μ m，并且優選大約16μπι的直徑。對于諸如檢測癌細胞抗原、核酸、抗體、免疫球蛋白、其他生物標志物和微生物的其他應用，孔237可以具有大約1 μ m的直徑。過濾表面236可以具有大于50%的孔隙率。孔隙率是指過濾表面236由孔237構成的部分或百分比。圖:3B顯示孔237的放大圖。孔237可以按六邊形、矩形或任何其他合適的形式排列。孔237可以是圓的、六邊形的或任何其他合適的形狀。孔237可以具有統一尺寸或不同尺寸。過濾表面236可以是大約 6mm長X 6mm寬，并且可以包括大約100,000個孔。樣品入口 231位于過濾表面236上方。樣品入口 231引導全血樣品從上述過濾表面236進入初級分離室235，并使樣品以基本上垂直于過濾表面236的方向流動。這具有增加流速并降低測試時間的作用。初級分離層230還包括與初級分離室235流體連通的緩沖液入口 232。緩沖液入口 232可以穿過頂層210和粒子檢測層220到達初級分離層230。緩沖液入口 232可以與 POC分析儀100中的壓力裝置流體連通。緩沖液入口 232引導緩沖液以基本上平行于過濾表面236的方向進入初級分離室235以產生橫過過濾層236并流向捕獲通道238的“清掃” 作用。緩沖液入口 232可以首先將緩沖液引入緩沖液槽233，該緩沖液槽233橫過過濾表面236的基本上整個側面延伸。緩沖液填充緩沖液槽233，并然后溢流到過濾表面236上。 緩沖液槽233可以具有頂，該頂位于與過濾表面236大致相同的水平。可選擇地，緩沖液入口 232可以包括緩沖液擴散器，該緩沖液擴散器將緩沖液橫過過濾表面236的基本上整個側面鋪散開。緩沖液入口 232引導緩沖液橫過過濾表面236并在緩沖液由緩沖液入口 232 流向捕獲通道238時導致過濾表面236的清掃。過濾表面236可以作為初級分離層230的一部分形成，或者可以被單獨制造，然后連接至初級分離層230。過濾表面236可以通過注射模鑄、微石板印刷術、諸如光成像、濕刻和干刻的微細加工技術、諸如輻射“拉開”的基于輻射的加工和激光燒蝕制造。“濕刻”一般是指通過與液體元件接觸進行蝕刻。“干刻”一般是指通過與氣體或等離子體接觸進行蝕刻。對于激光燒蝕，每個脈沖的激光移除一小部分的聚合材料。同步加速器傳遞高度定向的 X射線輻射，該高度定向的X射線輻射可用于解開或“拉開”諸如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA) 的丙烯酸材料的聚合物主鏈。使用這個概念，聚合物膜的暴露區域可以通過離子化輻射被 “拉開”并隨后通過溶劑浴洗印掉，所述聚合物膜的暴露區域通過具有界定期望圖式的吸收和發射部分的X射線掩模界定。對于計數CTC，靈敏度對應于樣品體積，因為，每體積的CTC數目極小。測試卡200 能夠過濾具有多達IOml或更大體積的血液樣品。這個樣品尺寸可以比通常在微流裝置中所出現的樣品尺寸大10倍。因此，這種大的樣品尺寸導致可能高10倍的靈敏度。圖4A-4B顯示捕獲通道238的一個實施方案的透視圖和剖面圖。捕獲通道238包括用結合劑處理的壁，所述結合劑選擇性地結合樣品中被特異性靶向的組分。在一個實施方案中，捕獲通道238具有用與白細胞結合的CD45抗體處理的壁。在其他實施方案中，捕獲通道238具有用可以選擇性地結合不想要的組分的抗體、適體、肽和/或小分子處理的壁。捕獲通道238寬至足以使白細胞或其他血液組分239結合捕獲通道238的壁時不會阻塞。捕獲通道238可以具有大約20μπι至ΙΟΟΟμπι，并且優選大約400μπι的寬度。捕獲通道238還長至足以增強白細胞或其他血液組分的捕獲。捕獲通道238可以具有大約0. Icm 至IOcm并且優選大約5cm的總路徑長度。捕獲通道238刻畫了增強白細胞或其他血液組分的捕獲的曲折路徑。在顯示的實施方案中，捕獲通道238刻畫了具有幾個大約90度的轉彎的螺旋樣路徑，這使得白細胞或其他血液組分與壁接觸。這些轉彎還在粒子從其流動的直徑碰撞壁和與其他粒子碰撞時產生紊流，從而引起與壁接觸的頻率增加。捕獲通道238 可以具有正方形、矩形、三角形或任何其他合適的形狀的橫截面形狀。粒子檢測器層220包括與捕獲通道238流體連通的粒子檢測器300。粒子檢測器 300能夠定量粒子物質的量或計數樣品中細胞的數目。粒子檢測器300可以是基于瓊脂的鹽橋阻抗傳感器、DADMAC鹽橋阻抗傳感器或任何其他合適的傳感器。
圖5A-5B顯示粒子檢測器300的一個實施方案的放大圖。粒子檢測器300是鹽橋阻抗傳感器，具體地是基于瓊脂的鹽橋阻抗傳感器。粒子檢測器300包括傳感器入口 301， 該傳感器入口 301接收來自捕獲通道238的樣品并將其導向主流通道302。主流通道302 可以具有大約0. 05mm至0. 5mm,并且優選大約0. Imm的寬度。粒子檢測器300還可以包括緩沖液貯器303和在主流通道302的兩側引入緩沖液的緩沖液引入通道304和305。緩沖液引入通道304和305將樣品流體動力學地集中在主流通道302的中心。這將樣品中的細胞或粒子以基本上單線排列。可選擇地，可使用單緩沖液引入通道將樣品流體動力學地集中在主流通道302的一側。粒子檢測器300還包括鹽橋室311和312，鹽橋室311和312容納瓊脂并經由連接通道313和314偶聯至主流通道302。連接通道313和314可以具有大約0. OOlmm至 0. 05mm的寬度和大約0. Olmm至0. 2mm的長度并且，優選大約0. Olmm寬且0. Imm長。電解液入口 315和316容納電解液并且與鹽橋室311和312流體連通。電解液入口 315和316 與電極325和3 偶聯。電極325和3 穿過頂層210并可以與POC分析儀100電偶聯。 電極325和3 可以由Ag/AgCl或任何其他合適的材料制成。與主流通道302流體連通的收集室319在末端收集樣品。粒子檢測器300可以包括有利于鹽橋室311和312制造的瓊脂入口 317和318。鹽橋室311和312可以通過用大約2-10%瓊脂和IM KCl (重量/體積(weight by volume)) 的瓊脂混合物填充瓊脂入口 317和318來制造。將這種瓊脂混合物加熱直至瓊脂完全溶解。 在瓊脂混合物變澄清時，其可使用，并在可使用時立即將其引入瓊脂入口 317和318。可以通過毛細管力或正壓將瓊脂混合物引入瓊脂入口 317和318。瓊脂混合物將首先填充瓊脂入口 317和318以及鹽橋室311和312。連接通道313和314很窄并且高的流動阻力將阻止瓊脂混合物流入主流通道302。連接通道313和314的尺寸由于所使用的小體積而容許瓊脂或其他聚合物在通道中更一致地填充。這使得如果像在較大的連接通道的情況下那樣在填充較多聚合物時具有差異性聚合的鹽橋的可能性較小。這可以導致測試結果更高的再現性。一旦用瓊脂混合物裝填鹽橋室311和312，便可以停止流動。可以將粒子檢測器300 儲存在室溫下直至瓊脂混合物冷卻并凝固。粒子檢測器300可以在此時將IM KCl溶液引入電解液入口 315和316后使用。基于瓊脂的鹽橋傳感器的制造不需要光刻。基于瓊脂的鹽橋傳感器的制造與大范圍的材料相容，包括軟材料，例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)。基于瓊脂的鹽橋傳感器的制造不需要作為光敏引發劑的UV和交聯劑。圖5C顯示粒子檢測器300的另一個實施方案的放大圖。粒子檢測器300是鹽橋阻抗傳感器，具體地是二烯丙基二甲基氯化銨(DADMAC)鹽橋阻抗傳感器。粒子檢測器300 包括傳感器入口 301，該傳感器入口 301接收來自捕獲通道238的樣品并將其導向主流通道302。主流通道302可以具有大約0.05mm至0.5mm，并且優選大約0. Imm的寬度。粒子檢測器300還可以包括緩沖液貯器303和在主流通道302的兩側引入緩沖液的緩沖液引入通道304和305。緩沖液引入通道304和305將樣品流體動力學地集中在主流通道302的中心。這將樣品中的細胞以基本上單線排列。可選擇地，可使用單緩沖液引入通道將樣品流體動力學地集中在主流通道302的一側。粒子檢測器300還包括容納DADMA并與主流通路302流體連通的鹽橋室321和 322。電解液入口 315和316容納電解液并且與鹽橋室311和312流體連通。電解液入口315和316與電極325和3 偶聯。電極325和3 穿過頂層216并可以與POC分析儀100 電偶聯。電極325和3 可以由Ag/AgCl或任何其他合適的材料制成。與主流通道302流體連通的收集室319在末端收集樣品。粒子檢測器300可以用標準的軟石板印刷工藝制造。基于SU-8或硅的鑄模通過用聚二甲基硅氧烷(PDMQ的光刻制造。粒子檢測器300通過用光敏引發劑和單體的預聚物混合物填充鹽橋室321和322并將其暴漏于UV而制造。預聚物混合物由下列物質構成 65%二烯丙基二甲基氯化銨水溶液、2% 2-羥基-4’-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮(光引發劑)和2% N, N'-亞甲基雙丙烯酰胺(交聯劑)。聚合后，用緩沖液(1M KCl)將剩余的預聚物混合物洗掉。對于電測量，將KCl溶液裝填到與鹽橋室321和322連接的電解液入口 315和316中并且在這種情況下通過在電極325和3 之間施加直流偏壓使KCl溶液中的陰離子Cl-離子穿過鹽橋室321和322流動。這驅動了在鹽橋室321和322之間的電流并且在細胞穿過鹽橋室321和322之間的主流通道302產生電極325與3 之間的阻抗改變時監測鹽橋室321和322之間的阻抗。激勵信號可能具有大約0. OlV至IOV交流或直流的電壓并且在使用交流時，具有50Hz至IOkHz的頻率。圖6A-6B顯示測試卡200的另一個實施方案的裝配圖和分解圖。測試卡200包括頂層210、組合層225、廢物層沈0。組合層225將粒子檢測層220和初級分離層230中存在的元件組合為組合層225。組合層225包括初級分離室235、捕獲通道238和粒子檢測器 300。樣品入口 231容許樣品被引入初級分離室235。緩沖液入口 232容許緩沖液被引入初級分離室235以及主流通道302。實施例1 循環腫瘤細胞(CTC)測試卡200可用于檢測全血中的循環腫瘤細胞(CTC)。用抗凝劑收集包含血漿、 血小板、紅細胞、白細胞和CTC的全血樣品并將其插入樣品入口 231。然后將測試卡200插入POC分析儀100。樣品到達初級分離室235并通過樣品入口 231被基本上垂直于過濾表面236引入。血漿、血小板、紅細胞和較小的白細胞穿過孔237進入廢物室沈0。孔237可以具有大約14-18 μ m，并且優選大約16 μ m的直徑。較大的白細胞和CTC太大而不能穿過孔237，并且保留在初級分離室235中。POC分析儀100可以施加大約0_50psi的壓力至樣品入口 231 1-3分鐘以促進過濾過程。緩沖液被以基本上平行于過濾表面236的方向引入初級分離室235。可以關閉樣品入口 231以阻止緩沖液逆流。緩沖液由緩沖液入口 232基本上與過濾表面236平行地進入以產生橫過過濾表面236流向捕獲通道238的“清掃”作用。緩沖液入口 232在初級分離室235的進入點的高度被降低，而橫過長度被加寬以引起緩沖液的鋪散以便在緩沖液由緩沖液入口 232流出并且緩沖液流向捕獲通道238時引起過濾表面236的完全清掃。可以使用具有約275-299毫滲摩爾/千克的重量克分子滲透濃度的磷酸鹽緩沖鹽水或其他pH緩沖液以維持正常的細胞功能和體積。這具有將過濾表面236上的白細胞和CTC“清掃”或疏通到捕獲通道238中的作用，尤其是可能部分“粘”在或留在孔237中的白細胞和CTC。同樣，POC分析儀100能夠施加壓力至緩沖液入口 232中以促進清掃過程。緩沖液攜帶未過濾的殘余白細胞和CTC穿過捕獲通道238。捕獲通道238的曲折路徑增加了白細胞與捕獲通道238的壁接觸并結合至所述壁的可能，所述壁被CD45抗體或與白細胞特異性地結合的其他捕獲劑處理過。CTC不與所述壁結合并且穿過捕獲通道238。
緩沖液將CTC運載至粒子檢測器300。CTC進入并穿過傳感器入口 301并進入主流通道302。來自緩沖液貯器303的額外的緩沖液穿過緩沖液引入通道304和305被引入主流通道302，以將CTC流體動力學地集中在主流通道302的中心。被流體動力學地集中的 CTC在連接通道313和314之間通過并且被計數。可以施加大約5mV至500mV的電壓至電極325和3 并通過POC分析儀100測量阻抗。CTC收集在收集室319中，如果期望的話，可以在此處將CTC移出測試卡以供進一步分析。實施例2 移植組織分型測試卡200可用于組織分型，其中在移植前測試預期供體和受體的組織的相容性。可以對胚胎進行組織分型以確保移植的胚胎可以是患病同胞的臍帶血干細胞供體。這種應用使用具有直徑為大約5 μ m的孔237的過濾表面236。少量來自樣品的白細胞停留在初級分離室235中并穿過捕獲通道238移動，捕獲通道238具有用已知的抗-HLA(人白細胞抗原)抗體特異性處理的壁。如果抗體識別主要組織相容性復合體(MHC) 上的表位，則白細胞結合捕獲通道238的壁并不被粒子檢測器300計數。這容許基于捕獲通道238中存在的已知抗體的特異性間接地鑒定細胞的MHC。實施例3 疾病相關的人白細胞抗原(HLA)分型測試卡200可用于檢測HLA A、B、C，它們可能在與某些人疾病狀態的關系中有用。這種應用使用具有直徑為大約5 μ m的孔237的過濾表面236。樣品中的白細胞停留在初級分離室235中并穿過捕獲通道238移動，捕獲通道238具有用特異性抗-HLA(人白細胞抗原)抗體處理的壁。如果抗體識別白細胞上的HLA抗原，則白細胞結合捕獲通道 238的壁并不被粒子檢測器300計數。這容許基于捕獲通道238中存在的已知抗體的特異性間接地鑒定細胞的HLA。實施例4 獲得性造血干細胞疾患測試卡200可用于鑒定陣發性夜間血紅蛋白尿(PNH)、獲得性造血干細胞疾患，這些疾病中血細胞丟失了某些細胞表面標志物，從而引起機體的紅細胞(RBC)的一些或全部被稱為溶血的過程破壞。測試卡200可用于檢測缺乏表面標志物⑶45、⑶14、⑶33、⑶16、 ⑶對、⑶64和⑶15的組合的血細胞。這種應用使用具有直徑為大約5 μ m的孔237的過濾表面236。捕獲通道238具有用⑶45、⑶14和/或⑶33抗體處理的壁。被PNH影響的白細胞不結合壁并穿過捕獲通道 238被粒子檢測器300計數。圖7A-7B顯示測試卡200的另一個實施方案的裝配圖和分解圖。測試卡200包括頂層210、初級分離層230、次級分離層M0、納米線傳感器層250和廢物收集層沈0。圖8A-8B顯示次級分離層MO的放大圖。次級分離層240包括通過孔237與初級分離室235流體連通的次級分離室M5。次級分離室245收集血漿、紅細胞、血小板和小于孔237的尺寸的其他血液組分。次級分離室245具有內壁241和外壁M2。內壁241具有大約400 μ m寬的開放間隙，該間隙容許粒子從次級分離室245移出并進入次級分離室245 的內壁241和外壁242之間的通道M8。通道248可被捕獲劑處理過以特異性地結合在次級分離室M5中收集的粒子。樣品穿過通道249流動，通道249可沿次級分離層MO的頂部和底部延長，然后到達納米線傳感器350。
納米線傳感器層250包括納米線傳感器350。納米線傳感器350能夠定量血漿或其他樣品中特定物質的量。圖9A顯示納米線傳感器350的一個實施方案的放大圖。納米線傳感器350是硅納米線場效應晶體管(FET)。納米線傳感器350包括基底352。納米線傳感器350還包括源極353和漏極354，它們都設置在基底352上。源極353和漏極3M可以被絕緣層覆蓋。 納米線傳感器350還包括與源極3M和漏極3M偶聯的納米線355。納米線355是半導體性的并且可以由Si、Ge、InAs, ZnO, SiGe或任何其他合適的材料制成。納米線355可以具有大約Inm至500nm，并且優選大約20nm的厚度。納米線355可以被摻雜至大約1016/cm3 至1027cm3，并且優選大約1018/cm3。納米線傳感器350還包括設置在基底352上的控制電 M 356 ο納米線傳感器350還包括控制電極356。控制電極356可以位于距納米線355大約0.01mm至1mm，并且優選大約0. 1mm。在一個實施方案中，控制電極356由Au制成，但還可以由Ag、Cu、Zn、Cd、Fe、Ni、Co或任何其他合適的材料制成。在一個實施方案中，控制電極356用對靶分子特異性的肽核酸(PNA)官能化，所述肽核酸經由例如，胺、羧酸、醛或硫醇鍵與控制電極356相連。靶分子可以是例如，含有預選的核苷酸序列的核酸分子。PNA可以包括間隔單元，例如，氨基酸連接體或例如8-氨基-3，6-二氧雜辛酸的單體或多體或在PNA 與控制電極356連接之后為PNA提供柔性的任何其他合適的間隔體。信號改變可以通過測量FET的門控響應來檢測。對控制電極356施加的電壓VCe提供FET的門控輸入。當靶分子與控制電極356結合時，控制電極356與納米線355之間的電容改變，并且相同的Vce的門控響應將不同。控制電極356可能很大，例如，5μπι χ 5μπι至500μπι χ 500μπι，優選約 50ym χ 50 μ m(長X寬)，以增加與控制電極356結合的靶分子的數目，從而增強檢測靈敏度。控制電極356可以是任何合適的厚度，例如，約IOnm至約200nm。控制電極356的增加的尺寸和控制電極356而不是納米線355的官能化，促進納米線傳感器350的靈敏度和特異性增加。納米線355和控制電極356彼此是流體連通的。在一個實施方案中，納米線355 和控制電極356被放置于微流通道357內。可選擇地，納米線355和控制電極356可以被放置在樣品室中，該樣品室中樣品是靜止的或攪拌的。控制電極356可以為與微流通道357 基本上相同的寬度或任何其他合適的尺寸或寬度。控制電極356可以被大量癌抗原的任一種官能化。控制電極356可以被與蛋白 53(p53)核酸(腫瘤抑制)或人表皮生長因子受體2、HER2/neU核酸或其他分子互補的肽核酸(PNA)官能化。控制電極可以被下列癌抗原的抗體官能化CA27. 29、癌胚抗原(CEA)、 CA15-3、前列腺特異性抗原(PSA)或其他抗原。控制電極356可以被官能化以檢測大量蛋白生物標志物的任一種。控制電極356 可以被下列抗體官能化心臟病和卒中風險因子C反應性蛋白(CRP)的抗體；診斷充血性心力衰竭(CHF)的B型利鈉肽(BNP)的抗體；測試急性心肌梗塞和骨骼肌損傷的肌酸酐激酶的抗體；測試營養狀況或肝功能的轉鐵蛋白的抗體；篩選具有心臟病和卒中風險的患者的高半胱氨酸的抗體；小的血液分子例如用于糖尿病測試的葡萄糖的抗體；或檢測急性感染存在的乙肝表面抗原(HBsAG)的抗體。控制電極356可以被大量檢測免疫球蛋白的抗體和檢測某些類型的癌、疾病、感染和免疫狀況的抗體官能化。控制電極356可以被對診斷骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血癥并評價單克隆丙種球蛋白病和淀粉樣變的特異性免疫球蛋白(gA、IgG和IgM)的抗體官能化。控制電極356可以被下列物質官能化用作臨床恢復和隨后對乙肝病毒免疫性 (subsequent immunity)指示劑的抗-乙肝的抗體；檢測與系統性紅斑狼瘡(SLE)相關的抗體的抗雙鏈DNA (抗-dsDNA)的抗體；或診斷特應性皮炎、濕疹、寄生蟲感染、變應性支氣管肺曲菌病和免疫缺陷的變應原特異性免疫球蛋白E(IgE)的抗體。控制電極356可以被檢測多種感染性疾病的大量互補性肽核酸(PNA)的任一種官能化。控制電極356可以被與下列核酸互補的PNA官能化HSV核酸、丙肝核酸、HIV-I核酸、卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii)性肺炎(PCP)核酸、細菌核酸、嗜肺性軍團病菌 (Ligionella pneumophilia)核酸或B型鏈球菌核酸。盡管上述實施例描述了使用全血作為樣品，諸如尿的其他樣品也可用于測試卡 200。例如，控制電機356可以被白蛋白的抗體官能化以檢測作為糖尿病早期標記的尿中的白蛋白。測試卡200被設計為與其他納米級裝置相比具有增強的檢測靈敏度。測試卡200 包括按照尺寸以及按照電荷分離樣品中的組分的微流裝置和基于分子的生物化學特性和物理特性檢測靶生物分子的納米線傳感器350。還描述了檢測樣品中一種或多種生物分子的存在或不存在的方法和基于受治療者的樣品中生物分子的存在而診斷受治療者的疾病狀況的方法。本文所述的方法被設計為提供改善的靈敏度以檢測皮摩爾和飛摩爾量的核酸以及檢測樣品中的生物分子。測試卡200包括微流裝置和納米線傳感器350。微流裝置包括基于至少尺寸、結構和電荷的一種或多種分離樣品中的分子的尺寸排阻結構。納米線傳感器350包括基底 352和具有預定的電流-電壓特征并且適于用作生物傳感器的門控的納米線場效應電晶體 (NW-FET)。納米線傳感器350還包括具有入口的微流通道357。納米線傳感器350包括源極353、漏極354、與源極353和漏極3M連接并被設置在源極353和漏極3M之間的納米線355、以及控制電極356，控制電極356被對形成具有預定電流-電壓特征的FET的靶分子特異性的結合位點官能化。NW-FET設置在基底352上并且在基底352與微流通道357之間。靶分子與控制電極356上的結合位點之間發生的結合事件引起NW-FET的電流-電壓特征的可檢測的改變。在優選的實施方案中，納米線355是基于硅的納米線，但是還可以是 Ge、InAs, ZnO和SiGe或任何其他半導體材料。控制電極356可以是例如，金屬控制電極， 如Au、Ag、Cu、Zn、Cd、Fe、Ni、Co或任何其他合適的元素或化合物。優選地，控制電極356 是Au。結合位點可以是例如，肽核酸(PNA)、抗體、適體、肽或經由例如，胺、羧酸、醛或硫醇鍵與控制電極356相連的對靶分子特異性的其他劑(參見，例如，圖9c)。靶分子可以是例如，含有預選的核苷酸序列的核酸分子。PNA可以包括間隔單元，例如，氨基酸連接體或例如8-氨基-3，6- 二氧雜辛酸的單體或多體或在PNA與控制電極連接之后為PNA提供柔性的任何其他合適的間隔體。信號改變可以通過測量NW-FET的門控響應來檢測。對控制電極356施加的電壓VCe提供NW-FET的門控輸入。當靶分子與控制電極356結合時，控制電極與納米線355之間的電容改變，并且對于相同的Vce的門控響應將不同。控制電極356可能很大，例如，5μ χ 5μπι至500μ χ 500 μ m，優選約50 μ m χ 50μπι(長X寬)，以增加靶分子與控制電極356的結合，從而增強檢測靈敏度。控制電極356可以是任何合適的厚度，例如，約10 μ m至約200 μ m。控制電極356的增加的尺寸和控制電極356而不是納米線 355的官能化，促進納米線傳感器355的靈敏度和特異性增加。本發明的另一實施方案是檢測樣品中、尤其是生物樣品中靶核酸分子的存在或不存在的方法，通過將樣品施用于納米線傳感器350，并檢測納米線傳感器350的信號改變， 其中信號改變是通過樣品中的靶分子與納米線傳感器350中控制電極356上的結合位點的結合誘導的。樣品可以是生物樣品，例如，血液或血漿樣品。靶分子優選是含有預選序列的 DNA分子，所述預選序列例如是腫瘤存在的特征的腫瘤源DNA序列。腫瘤源DNA可以是標志物或潛在標志物，該標志物或潛在標志物充當腫瘤存在及其進展的診斷指示劑和預后指示劑以及對治療響應的預測性指示劑。DNA可以是例如，突變K-ras并且腫瘤可以是胰臟癌， 尤其是胰腺癌。該方法還可以用于建立生物樣品中靶DNA濃度與癌狀況之間的關聯。該方法還可以用作靶DNA所來源的腫瘤的早期檢測的篩選方法或測定腫瘤進展的篩選方法。例如，該方法可用于通過下列測定來檢測非癌性胰臟損傷至癌性胰臟損傷的改變在受治療者的樣品中測定具有胰臟損傷的受治療者的樣品的額外的突變K-ras存在；或測定受治療者的樣品中在臨床上顯著的突變K-ras DNA水平之上的升高水平的突變K-ras DNA的存在。受治療者樣品中額外的突變K-ras DNA的存在或突變K-ras DNA的升高是胰臟損傷是癌或將變為癌的指示。此外，該方法可用于預測對治療的響應或選擇最適于用特定治療來治療的患者。例如，如在2008年的美國臨床腫瘤學會和歐洲腫瘤內科學會(American Society of Clinical Oncology and European Society of Medical Oncology)白勺，個生g 腸直腸癌中K-ras突變的存在一般與對抗表皮生長因子受體(EGFR)激酶的抗體如西妥昔單抗(Erbitux, Imclone, Inc.)禾口中白尼單抗(Vectibix, Amgen Inc.)的弱口向應有關。本發明的另一實施方案是用于檢測從組織樣品中分離的基因組DNA中的預選DNA 序列。基因組DNA樣品與納米線傳感器350中的控制電極356接觸，其中控制電極356被對預選DNA特異性的結合位點官能化，并且檢測電導率或電流的改變。預選DNA序列可以是例如，對病毒特異性的DNA序列，所述病毒如乙肝病毒、人免疫缺陷病毒、人乳頭瘤病毒或巨細胞病毒。場效應電晶體(FET)是三電極裝置，其包括門極、源極和漏極。FET在Paul Horowitz 禾口 Winfield Hill 的 The Art of Electronics (電子學)，第二版，Cambridge University Press，1989，第113-174頁中較詳細地描述，其整體內容通過引用并入本文。這種載流子的可用性是通過將電壓施加到被稱為門極的第三“控制電極”來控制的。通道中的電導是通過將電壓施加到門極來控制的，電壓施加到門極產生了跨通道的電場。傳感裝置包括(a)納米線355，其與源極353和漏極3M連接并且被設置在源極 353和漏極3M之間；(b)門極或控制電極356 ；以及(c)微流通道357，其任選具有流體入口和出口。源極353、漏極354、納米線355和控制電極356形成納米線傳感器350。納米線355和控制電極356物理分離并且控制電極356在微流通道357的流中。納米線傳感器 350和微流通道357設置在支撐基底352上。納米線傳感器350位于基底352和微流通道 357之間。控制電極356被對預選靶分子特異性的結合位點官能化。與控制電極356上的結合位點結合的靶分子在門處提供電壓，該電壓產生了改變納米線355的載流子分布的電場。納米線355中這種載流子分布的改變影響了電流穿過納米線355的流動，這可以通過檢測器檢測，例如，利用電壓計的ι-ν掃描。由于測量是在溶液相中進行的，通過用絕緣材料涂覆源極353和漏極3M來防止源極353與漏極3M暴露于微流通道357中的樣品。多種絕緣材料是可用的，例如氮化硅、 氧化硅以及任何其他合適的材料。氮化硅或氧化硅可以通過等離子體增強化學氣相沉積 (PECVD)被沉積在源極353和漏極3M上以提供絕緣。使用PECVD進行薄層沉積氮化硅或氧化硅的條件可以被進一步優化。納米線傳感器350還可以包括用于測量控制電極356的電容或其他特性改變的裝置。納米線傳感器350用簡單電子器件操作，優選由與納米線355連接的光刻所界定的微米尺寸的源極353和其他電子組件，如電源、放大器和電壓計。為了最小化穿過微流通道 357中含電解液的樣品的寄生電流，用諸如氮化硅或二氧化硅的絕緣材料使源極353和漏極3M絕緣。控制電極356在微流通道357的流中。由于微流通道357的小尺寸，將僅獲得小體積的樣品(通常小于1毫升)。樣品溶液通過重力或穿過微流通道357的抽吸而以固定的流速穿過微流通道357流動。可以通過注射泵、蠕動泵或任何其他合適的裝置將樣品抽吸穿過微流通道357。還可以使用壓縮的空氣或氮氣調壓器使樣品穿過微流通道357 流動。樣品還可以大約1至100 μ 1/分鐘的速率被抽吸穿過微流通道357。如本文所用，術語“納米線”如整體并入本文的美國專利第7，385，沈7號所描述的，該專利將納米線定義為細長的納米級半導體，沿其長度上的任一點具有至少一個橫截尺寸，并且在某些實施方案中，具有小于500nm的兩個正交橫截尺寸，優選小于200nm，更優選小于150nm，甚至更優選小于lOOnm，甚至更優選小于70nm，仍然更優選小于50nm，甚至更優選小于20nm，仍然更優選小于IOnm并且甚至小于5nm。在其他實施方案中，橫截尺寸可以小于2nm或lnm。在一組實施方案中，納米線具有介于0. 5nm至200nm的至少一個橫截尺寸。當納米線具有芯和外部區域時，上述尺寸關于芯的那些尺寸。細長半導體的截面可以具有任意形狀，包括但不限于環形、方形、矩形、橢圓形和管形。包括規則形狀和不規則形狀。 可以制成本發明的納米線的材料的實例的非限制性列表可顯示如下。納米管是一類可用于本發明的納米線，并且在一個實施方案中，本發明的裝置包括與納米管相當等級的線。如本文所用，“納米管”是具有挖空的芯的納米線，并且包括本領域的普通技術人員已知的那些納米管。“非納米管納米線”是不為納米管的任何納米線。在本發明的一組實施方案中，具有未修飾的表面(不包括在納米管所放置的環境中納米管中非固有的輔助反應實體)的非納米管納米線用于本文所描述的可使用納米線或納米管的發明的任何排列中。“線”一般是指具有至少半導體或金屬的電導性的任何材料。例如，術語“導電”或“導體”或“電導體” 在用于指“導電性”線或納米線時是指所述線使電荷通過其本身的能力。優選的導電材料具有低于約10_3，更優選低于約10_4，并且最優選低于約10_6或10_7ΩΠΙ的電阻率。除非另外指明，否則納米線355可包括碳納米管、納米棒、納米線、有機和無機導電聚合物和半導體聚合物以及類似物。可能不是分子線，但具有各種小的納米纖維級尺寸的其他導電或半導體元件也可在一些情況下使用，例如，無機結構，如基于主族和金屬原子的線樣硅(wire-like silicon)、含過渡金屬的線、砷化鎵、氮化鎵、磷化銦、鍺、硒化鎘結構或任何其他合適的組分。可以在不需過度實驗的情況下以本文所述的涉及納米線的技術類似的方式使大量這些和其他的納米線按對電子裝置有用的圖案在表面上生長和/或施加到表面上。納米線355應能夠形成為具有至少1 μ m,優選至少3 μ m,更優選至少5 μ m，并且更優選甚至至少長10或20 μ m的長度，并且優選地具有小于約lOOnm，更優選小于約75nm， 并且更優選小于約50nm，并且更優選小于約25nm的厚度(高和寬)。納米線355應具有至少約2 1，優選大于約10 1，并且更優選大于約1000 1的長寬比(長度比厚度)。優選地，納米線355是硅納米線(SiNW)，優選硅非納米管(實心)納米線。然而， 可以使用任何合適的材料。制造納米線355的多種方法是本領域內可用的，參見，例如，美國專利第 7，301，199號和美國專利第7，410，904號，它們通過整體引用并入本文。可以使用諸如“自下而上”法的方法，該方法是通過氣-液-固相(VLQ技術以整體材料生長納米線。這種方法產生了高品質的納米線，但是難以制備在長度和直徑方面均一的納米線。而且，它難以將納米線放置在預期位置并將其與包括電極在內的納米線傳感器350的其他組件對齊，這導致裝置與裝置之間的一致性差(Gao等人Anal Chem 2007 ;79 :3四1_7)。可以使用的其他方法是基于電子束石板印刷(Ε-bean lithography)和濕/干刻的“自上而下”技術。后面的這類方法是優選的，因為它們提供了對納米線的尺寸和位置的更多可控性，這使得高通量和自動化生產成為可能。在多種實施方案中，可以采用任何數目的不同方法來制造控制電極356，包括下列的實例和組合印刷、石板印刷、化學氣相沉積(CVD)、蝕刻、激光燒蝕、弧光放電和/或電化學方法。控制電極356可以具有下列尺寸5 μ m χ5μπι至500μπιχ 500 μ m尺寸，優選約 50μπι χ 50μπι(長X寬)或任何其他合適的尺寸。控制電極356可以是任何合適的厚度， 例如，約10 μ m至約200 μ m。用“官能劑”涂覆控制電極356的過程在本文中可稱為“官能化”并且被涂覆的控制電極被稱為“官能化的”。官能劑可以例如結合感興趣的特定化學物質和/或生物物質， 例如，硫醇基團；核酸，如二脫氧核糖核酸或“DNA”;肽核酸或“PNA”;和核糖核酸或“RNA;適體；激素；碳水化合物；蛋白；抗體；抗原；分子受體和/或細胞表面結合位點，這提供了少量生物化學實例。在本發明中，與控制電極356結合以形成結合位點的官能劑對樣品中的靶分子是特異的或互補的。例如，第一電沉積的金官能劑可以是硫醇封端的PNA官能劑或結合硫醇封端的PNA官能劑，該PNA官能劑繼而可以結合所測定的樣品中互補的DNA靶分子。控制電極356可以結合約0. Iym至約100 μ m，優選約1 μ m至約IOym PNA。SiNW和非金屬控制電極356可以用ρ型或η型摻雜劑摻雜。控制電極356的表面可以用捕獲劑，含有與諸如K-ras突變ssDNA的預選DNA序列互補的序列的PNA修飾。納米線355或控制電極356或納米線355和控制電極356 二者可以被摻雜。可以使用兩種不同的方法來摻雜納米線355和/或控制電極356以進一步優化基于旋涂摻雜劑的摻雜和離子注入。對于旋涂摻雜劑方法，將襯底用P型或η型旋涂摻雜劑溶液旋轉涂覆， 隨后是高溫擴散工藝。最終的摻雜水平可以由熱工藝的溫度和時間決定。對于離子注入， 在加速器中由多種氣體源產生高能量離子，如硼、磷或砷，并且將所述高能量離子導向襯底上。將離子注射到襯底的近表面區域內。已報道了兩種方法都能得到良好的結果(Gao等人 Anal Chem 2007 ;79 :3291-7 和 Wang 等人，Nano Lett 2006 ；6 (6) :1096-1100)。可以基于四點探針測量選擇最優的摻雜水平(參見，例如，Robert F.Pierret，‘ Semiconductor Device Fundamentals (半導體裝置基礎)，‘Addison Wesley，第 3 章，第 85-89 頁和第 3. 1. 4 節以及 Sato 等人 Journal of Surface Analysis 11 (2) 58-61 (2004)，二者均通過引用整體并入本文)。可以使用約IOw個孔或供體原子/cm3的摻雜水平作為優化的起點。可以按需要增加或降低摻雜水平。合成的肽核酸寡聚物(PNA)可以由多種來源商購獲得。在本發明中，PNA可以與控制電極356結合以形成結合位點。PNA是對樣品中的靶分子中的預選核苷酸序列特異性的/互補的，所述預選核苷酸序列例如DNA或RNA，優選ssDNA。優選地，用于本發明的PNA 具有特異性結合樣品中的靶DNA的合適的長度和序列，例如約5至約75，優選約20至約50 個核苷酸，并且與靶DNA中的預選序列80 %、85 %、90 %、95 %、99 %或100 %互補。優選地， PNA的序列與預選序列100%互補。PNA可以包括為下列序列的互補序列或它們的任一個的序列SEQ ID NO :2、3、4、5或6。優選地，靶DNA與連接至控制電極356的PNA在適于檢測靶DNA的預選序列與連接至控制電極356的PNA之間的單堿基對錯配的條件下雜交。優選地，所述條件是低鹽雜交條件，例如，IOmM Tris HCI,pH 8. 0或等同條件。可以使用不止一個納米線傳感器350，各傳感器被設計為檢測樣品中不同的靶分子。傳感裝置還可以包含不止一個NW-FET，它們的每一個被設計為檢測不同的靶分子。例如，如本文所述傳感裝置可以包括多個NW-FET，每一個包括被靶分子的結合位點官能化的控制電極356，所述靶分子含有序列SEQ ID NO :2_6之一。術語“樣品”如通過引用整體并入本文的美國專利第7，385，267號所述的，并且是指任何細胞、細胞培養基、組織或來自生物來源的液體(“生物樣品”)、或可以根據本發明評價的任何其他的生物的或非生物的介質，例如，血漿、血清或水。樣品包括但不限于取自生物體(例如，人、非人的哺乳動物、無脊椎動物、植物、真菌、藻類、細菌、病毒等)的生物樣品、取自被設計為用于人消耗的食物的樣品、包括被設計為用于動物消耗的食品如牲畜飼料的樣品、器官捐贈樣品、用于血供的樣品、來自供水的樣品、或類似樣品。樣品的一個實例是取自人或動物以確定特定核酸序列存在或不存在的樣品。優選的樣品是血液、血漿或血清樣品，優選來自患有或懷疑患有腫瘤如胰腺瘤的受治療者的血液、血漿或血清樣品。樣品可以是被勻漿化并置于溶液中的組織樣品。納米線傳感器350可以如下制造將PNA固定在電極上固定可以由X射線光電子譜(XPS)來表征。XPS是評價薄膜的化學特性以及結構特性的非原位(ex-situ)方法。還可以在HS-ssPNA固定之后測定表面上的定量分析。監測HS-ssPNA單層和含有封阻劑(巰基乙醇)的混合的自組裝PNA單層的表面覆蓋的改變。傅里葉變換紅外(FTIR)光譜提供關于分子印跡和取向的額外信息。 基于這兩個方法，可以在PNA取向以及覆蓋方面測定表面狀態。絕緣層的形成由于測量將在溶液相中進行，金屬電極要避免暴露于液體中。氮化硅和氧化硅是用于此目的的最常見的材料。優化用例如PEVCD進行的薄層沉積。使用雙層剝離(lift-off)方法來形成圖案化的絕緣層。下層被螺旋涂覆，隨后施加光刻膠。在相同的暴露和顯影條件下，下層比光刻膠更容易且更快地顯影。形成了在金屬沉積步驟期間充當掩模的懸浮光刻劑圖案以在金屬沉積之后提供環繞襯底上新形成的金屬圖案的間隙。在各向異性地形成薄層之后進行剝離的PECVD工藝之后，用氮化硅或氧化硅覆蓋金屬電極圖案。摻雜工藝至少兩種不同的摻雜方法是合適的旋涂摻雜劑方法和離子注入。摻雜之后，估計的摻雜水平通過四點探針測量來計算。測量層的薄層電阻P S。四個探針以線性方式排列。將固定的電流供給外側兩個探針，而由內側兩個探針測量維持固定電流的電壓。由電流和電壓值之間的關系，計算薄片電阻(sheet resistance) 0摻雜水平由電阻率與摻雜劑密度曲線來計算。摻雜水平的初始目標是1018/cm3。基于來自背景門控測量的 NW-FET的門控性能來調節目標摻雜水平。納米線FET裝置可以使用電子束石板印刷和多種蝕刻技術來產生納米線制件。 在納米線制造之后，通過用掃描電子顯微鏡(SEM)成像來將其表征。然后通過例如電子束石板印刷、光刻和剝離方法來界定金屬電極。同樣，用例如SEM監測圖案的尺寸和品質。用 I-V測量和回門控(back-gating)測量來測試裝置的電子性能。摻雜水平可以基于門控性能而改變。絕緣層金屬電極的全部覆蓋可以由例如SEM成像來證實。電分離也可以由例如液體中的I-V測量來檢查。實施例5 靶分子有4個顯著的K-ras點突變(下面的#1-4)與胰臟癌相關。另一點突變(下面的 #5)在胰臟癌中以極低頻率出現。靶寡核苷酸含有K-ras核酸序列的至少約20-50個核苷酸并且含有四個突變(#1-4)中的至少一個。含有K-ras核酸序列的至少約20-50個核苷酸并且含有#5突變的靶寡核苷酸充當陰性對照以增加對胰臟癌檢測的特異性。還合成了下列突變#1-5中的每一個的互補的并且含有約20-50個核苷酸的PNA。 所有合成的寡核苷酸可以購自商業來源。K-RAS編碼序列(1-60，野生型)ATG ACT GAA TAT AAA CTT GTG GTA GTT GGA GCT GGTGGC GTA GGC AAG AGT GCC TTG ACGK-RAS 編碼序列(1-60，#1-5 突變)
#編碼序列突變氣基酸突胰臟(N)大腸(N)肺(N)膽管(N)
變
1 c.34G>C (取 P.G12A 338574821
代)
2 c.35G>A (取 p.G12D 1340 1752 270 228
代)#1 :ATG ACT GM TAT AAA CTT GTG GTA GTT GGA GCT CGT GGC GTA GGC MG AGT GCC TTG ACG#2 :ATG ACT GM TAT AAA CTT GTG GTA GTT GGA GCT GAT GGC GTA GGC MG AGT GCC TTG ACG#3 :ATG ACT GM TAT AAA CTT GTG GTA GTT GGA GCT GTT GGC GTA GGC MG AGT GCC TTG ACG#4 :ATG ACT GM TAT AAA CTT GTG GTA GTT GGA GCT TGT GGC GTA GGC MG AGT
18
3C.35G>T 取代)P.G12V 829
4C.34G>T 取代)p.G12C 94
5c.38G>T 取代)p.G13D <18
1085
422
738
357 735 36
87 37 <18GCC TTG ACG#5 =ATG ACT GM TAT AAA CTT GTG GTA GTT GGA GCT GGT GAC GTA GGC MG AGT GCC TTG ACG肽核酸(PNA)固定策略已顯示PNA可以單堿基靈敏度檢測DNA(Wang等人，J. Amer Chem Soc 1996 ； 118(33) :7667-7670)并且因此金表面上的單鏈PNA分子的有序自組裝單層(SAM)展示對互補 ssDNA 的特異性識別(Briones 等人，Physical Review Letters 2004 ；93 (20) 208103)。PNA由于其與DNA的高結合親和力而在本文中被用作結合位點。使用基于硫醇的固定將PNA固定于控制電極356的表面上以形成單層，基本上如通過引用整體并入本文的 Briones等人，Phys. Rev. Lett. 93,208103(2004)所述。形成單層的條件基于PNA濃度、間隔體長度和用于在PNA固定之后封阻控制電極表面的硫醇溶液來優化，例如將PNA濃度被優化以形成合理填充的單層，例如，約0. Iym至約IOym:過高的 PNA濃度可以完全覆蓋金表面但由于位阻效應而降低結合功效。間隔體作用在納米表面上結合的特征與本體溶液中結合的特征極為不同。PNA 和多聚物中包含了降低結合的壁效應并賦予PNA更高柔性的8-氨基-3，6，- 二氧雜辛酸間隔體，例如，8-氨基_3，6，-二氧雜辛酸的二聚物和三聚物被用于確定用于結合測定的間隔體的優化長度。封阻性硫醇溶液作用為在硫醇-PNA固定之后封阻控制電極的金表面以便成功地進行后續DNA雜交，使用巰基乙醇溶液作為封阻劑。圖9C顯示了 PNA和巰基乙醇的混合 SAM的示意性代表圖。微流裝置的設計和過程起始樣品和樣品處理將樣品加入微流裝置并通過大約1 μ m尺寸的孔237將血漿與血細胞和血小板分離并使血漿進入次級分離室對5。使樣品流入或泵入通道248中，通道248具有與通道248的壁結合的硅或玻璃。將足夠的飽和促溶劑(例如，NaI和氯化胍試劑)與樣品混合并在容許DNA與玻璃表面結合的溫度下使樣品與通道248接觸足夠的時間，在25度下大約5分鐘；結合條件和時間可以進一步優化。DNA在促溶性鹽的存在下被吸附到玻璃或二氧化硅表面是首次由Vogelstein 和 Gillespie (Vogelstein 等人，Proc Natl Acad Sci USA 1979 ；76 (2) :615-619)在他們對通過玻璃粉末由瓊脂糖純化DNA片段的工作中描述的。用50% 乙醇和 50% 緩沖液(20mM Tris-HCI, pH 7. 2 ；0. 2M NaCI ；2mM EDTA)混合物洗滌結合有DNA的微流通道以移除Nal。然后用去離子水或低鹽洗脫緩沖液將DNA從硅或玻璃表面洗脫。將攜帶靶DNA至傳感裝置的洗脫緩沖液的鹽和pHT調節至例如IOmM Tris HCI，pH 8. O以適于靶DNA與結合至控制電極的PNA雜交。鹽和pH被調節的攜帶洗脫的DNA的雜交溶液穿過微流通道357流至或被泵至納米線傳感器350，在此處所述雜交溶液與被對預選靶分子特異性的肽核酸分子官能化的控制電極356接觸，并且靶DNA分子與 PNA雜交。基于硅納米線的傳感器設計/開發本發明的傳感裝置的納米線355和與靶分子結合的控制電極356是物理上分離的。納米線傳感器350的一個實施方案的示意圖顯示在圖9A中。如所圖示的，納米線傳感器350由兩個組件運行納米線355，其設置在源極353和漏極3M之間；以及控制電極 356。靶分子在適當的雜交條件下與結合至控制電極356的表面的PNA雜交。SiNW-FET通過改變的門控響應來檢測控制電極356與納米線355之間的電容改變。將電壓VCe施加至控制電極356，由遷移的離子形成了納米線355上的離子雙層。這種現象充當門控電壓并誘導納米線355中的電荷密度改變。當DNA靶分子結合控制電極356的結合位點時，控制電極356和納米線355之間的電容改變并且對于相同VeE的來自納米線355的門控響應也改變。該改變是通過測量通過納米線355的導電性檢測的，例如，通過用電壓計監測電流。圖9B顯示納米線傳感器350電導對控制電極電壓的示意性響應。基于電導線性區域線性外推至零設置域電壓；Vth。當靶分子(ssDNA)結合至控制電極356的表面時，控制電極356與納米線355表面之間的電容改變。這種電容改變改變了納米線355的域電壓， 該域電壓是納米線傳感器350的輸出信號。差異檢測方案為檢測K-ras基因中的點突變，測定了血液樣品的含單堿基突變的DNA。收集由許多生物組分構成的人血液樣品并將其與抗凝劑(例如，EDTA、檸檬酸鹽、 肝素)混合。優選EDTA抗凝的血液。收集抗凝的血液樣品并使其穿過微流裝置的尺寸排阻結構，通過使DNA與微流通道結合將樣品中的DNA與非DNA分子分離，然后如上所述洗脫結合的DNA。在其中樣品中的靶DNA與PNA雜交的條件下將含有洗脫的DNA的樣品施加至兩個納米線傳感器350 結合有對靶核酸分子特異性的PNA的第一納米線傳感器350 (樣品納米線傳感器350)；不含有靶核酸分子的結合的PNA的第二納米線傳感器350(對照納米線傳感器350)。通過取兩個納米線傳感器350的納米級的差異響應(樣品納米線傳感器 350的信號減去對照納米線傳感器350的信號)來消除以類似方式影響兩個傳感裝置的除血液樣品中的靶DNA以外的信號。一個納米線傳感器中的差異檢測和兩個Nff-FET 制備包括至少以下2組的SiNW-FET和控制電極356的可棄型一次性測試筒裝置 一組由第一 SiNW-FET和被捕獲PNA官能化的第一控制電極356 ；并且第二組是第二 SiNW FET和沒有捕獲PNA的第二控制電極356。額外的組是額外的SiNW-FET和被不同的捕獲PNA 官能化的控制電極356。SiNW-FET在兩組中是相同的(關于I-V特征和門控響應具有類似的性能)。該裝置包括共享同一入口的至少兩個微流通道。每個通道含有一個SiNW-FET。 洗脫的DNA樣品流入微流通道并且用檢測裝置檢測位于各通道中的來自SiNW-FET的信號并進行比較。本發明的其他方面對于熟練技術人員將是清楚的并且不需要在本文中重復。所采用的術語和表達用作說明術語并且不具有限制性，并且使用這些術語和表達時不旨在排除所顯示和描述的特征的任何等同形式或其部分，應認識到多種改動是可能在本發明的范圍內的。
權利要求
1.一種用于分離樣品中的組分的裝置，所述裝置包括初級分離室，其具有界定了多個孔的過濾表面；樣品入口，其與所述初級分離室流體連通，所述樣品入口被構造成將樣品以基本上垂直于所述過濾表面的方向引入所述初級分離室；其中所述過濾表面容許小于所述孔的組分穿過，并且其中所述過濾表面將大于所述孔的組分保留在所述初級分離室中；捕獲通道，其與所述初級分離室流體連通，所述捕獲通道具有被捕獲劑處理的壁，所述捕獲劑用于選擇性地結合較大組分中的被特異性靶向的至少一種；以及緩沖液入口，其與所述初級分離室流體連通，所述緩沖液入口被構造成將緩沖液以基本上平行于所述過濾表面的方向引入所述初級分離室以將所述較大組分清掃入所述捕獲通道；其中所述捕獲通道的壁在所述較大組分穿過所述捕獲通道時選擇性結合所述較大組分中的至少一種。
2.如權利要求1所述的裝置，其中所述過濾表面能夠接收大約0.01ml至IOml的樣品。
3.如權利要求1所述的裝置，其中所述過濾表面具有大約Immχ Imm至100mm χ IOOmm 的尺寸。
4.如權利要求1所述的裝置，其中所述過濾表面具有至少50%的孔隙率。
5.如權利要求1所述的裝置，其中所述樣品是全血。
6.如權利要求5所述的裝置，其中所述孔具有大約1μ m的直徑。
7.如權利要求6所述的裝置，其中較小的組分包括血漿。
8.如權利要求5所述的裝置，其中所述孔具有大約5μ m的直徑。
9.如權利要求8所述的裝置，其中所述較大組分包括白細胞。
10.如權利要求5所述的裝置，其中所述孔具有大約16μ m的直徑。
11.如權利要求10所述的裝置，其中所述較大組分包括較大的白細胞和循環腫瘤細胞 (CTC)。
12.如權利要求1所述的裝置，其中所述樣品入口具有大約0.5mm至IOmm的直徑。
13.如權利要求1所述的裝置，其中所述捕獲通道具有曲折路徑。
14.如權利要求1所述的裝置，其中所述捕獲通道具有大約20μπι至IOOOym的寬度。
15.如權利要求1所述的裝置，其中所述捕獲通道具有大約0.Icm至IOcm的長度。
16.如權利要求1所述的裝置，其中所述捕獲通道造成了多個成角度的轉彎。
17.如權利要求1所述的裝置，其中所述捕獲劑是抗體、肽、小分子或適體。
18.如權利要求1所述的裝置，其中所述緩沖液入口包括緩沖液槽，所述緩沖液槽橫跨所述過濾表面的基本上整個側面延伸，其中所述緩沖液入口被構造成將緩沖液引入所述緩沖液槽并且緩沖液槽被構造成容許緩沖液溢流到所述過濾表面上。
19.如權利要求18所述的裝置，其中所述緩沖液槽具有位于與所述過濾表面基本上同一水平的頂。
20.如權利要求1所述的裝置，其中所述緩沖液入口包括緩沖液擴散器，所述緩沖液擴散器被構造成將緩沖液橫跨所述過濾表面的基本上整個側面鋪散開。
21.一種用于分離樣品中的組分的方法，所述方法包括提供初級分離室，所述初級分離室具有界定了多個孔的過濾表面； 將樣品以基本上垂直于所述過濾表面的方向引入所述初級分離室，所述過濾表面容許小于所述孔的組分穿過，所述過濾表面將大于所述孔的組分保留在所述初級分離室中；提供與所述初級分離室流體連通的捕獲通道，所述捕獲通道具有被捕獲劑處理的壁， 所述捕獲劑用于選擇性地結合較大組分中的至少一種；以及將緩沖液以基本上平行于所述過濾表面的方向引入以將所述較大組分清掃入所述捕獲通道，所述捕獲通道的壁在所述較大組分穿過所述捕獲通道時選擇性結合所述較大組分中的至少一種。
22. 一種用于分離樣品中的組分的裝置，所述裝置包括 初級分離室，其具有界定了多個孔的過濾表面；樣品入口，其與所述初級分離室流體連通，所述樣品入口被構造成將樣品以基本上垂直于所述過濾表面的方向引入所述初級分離室；其中所述過濾表面容許小于所述孔的組分穿過，并且其中所述過濾表面將大于所述孔的組分保留在所述初級分離室中；以及緩沖液入口，其與所述初級分離室流體連通，所述緩沖液入口被構造成將緩沖液以基本上平行于所述過濾表面的方向引入所述初級分離室以將較大組分清掃離開所述過濾表
23.如權利要求22所述的裝置，還包括捕獲通道，其與所述初級分離室流體連通，所述捕獲通道被構造為接收來自所述過濾表面的所述較大組分，所述捕獲通道具有被捕獲劑處理的壁，所述捕獲劑用于選擇性地結合所述較大組分中的至少一種，所述捕獲通道的壁在所述較大組分穿過所述捕獲通道時選擇性結合所述較大組分中的至少一種。
24.一種用于定量樣品中的特定物質的量的裝置，所述裝置包括基底；源極，其與所述基底偶聯；漏極，其與所述基底偶聯，所述漏極具有低于所述源極的電勢；半導體納米線，其與所述源極和所述漏極偶聯；以及控制電極，其與所述基底偶聯，其中所述控制電極的表面的至少一部分用選擇性地結合所述物質的捕獲劑處理；其中流經所述納米線的電流的量對應于施加到所述控制電極的電壓，并且受結合到所述控制電極的所述物質的量影響。
25.如權利要求M所述的裝置，其中所述納米線具有約Inm至0.99μ m的寬度。
26.如權利要求M所述的裝置，其中所述納米線被摻雜至大約IO"5至IO^1個孔或供體原子/cm3的水平。
27.如權利要求M所述的裝置，其中所述控制電極具有大約5μπιΧ5μπι至約 500 μ mX 500 μ m的長和寬。
28.如權利要求M所述的裝置，其中所述控制電極具有大約IOnm至200nm的厚度。
29.如權利要求M所述的裝置，其中所述捕獲劑是會與生物分子結合的肽核酸(PNA)、 抗體、適體或小肽。
30.如權利要求M所述的裝置，其中所述控制電極上的所述捕獲劑形成具有大約 0. Inm至IOOnm的厚度的層。
31.一種用于定量樣品中的特定物質的量的裝置，所述裝置包括 測試室，其被構造為容納所述樣品；源極；漏極，所述漏極具有低于所述源極的電勢；半導體納米線，其至少部分地位于所述測試室中，所述半導體納米線與所述源極和所述漏極偶聯；檢測器，其用于測量流經所述納米線的電流的量；以及控制電極，其至少部分地位于所述測試室中，其中所述控制電極的表面的至少一部分用選擇性地結合所述物質的捕獲劑處理；其中流經所述納米線的電流的量對應于施加到所述控制電極的電壓，并且受結合到所述控制電極的所述物質的量影響。
32.如權利要求31所述的裝置，其中所述納米線具有約Inm至0.99μ m的寬度。
33.如權利要求31所述的裝置，其中所述納米線被摻雜至大約至IO^1個孔或供體原子/cm3的水平。
34.如權利要求31所述的裝置，其中所述控制電極具有大約5μ mX5 μ m至約 500 μ mX 500 μ m的長和寬。
35.如權利要求31所述的裝置，其中所述控制電極具有大約IOnm至200nm的厚度。
36.如權利要求31所述的裝置，其中所述捕獲劑是會與生物分子結合的肽核酸(PNA)、 抗體、適體或小肽。
37.如權利要求31所述的裝置，其中所述控制電極上的所述捕獲劑形成具有大約 0. Inm至IOOnm的厚度的層。
38.一種用于檢測樣品中的粒子的裝置，所述裝置包括 主流通道；緩沖液引入通道，其與所述主流通道流體連通，所述緩沖液引入通道能夠將緩沖液引入所述主流通道以將所述樣品中的所述粒子流體動力學地集中在所述主流通道內；第一鹽橋室和第二鹽橋室，其分別與所述主流通道的第一相對側面和第二相對側面流體連通，所述第一鹽橋室和第二鹽橋室至少部分地被瓊脂填充；第一電解液室和第二電解液室，其分別與所述第一鹽橋室和所述第二鹽橋室流體連通，所述第一電解液室和所述第二電解液室至少部分地被電解液填充；第一電極和第二電極，其分別設置在所述第一電解液室和所述第二電解液室中，所述第一電極和所述第二電極能夠分別施加激勵信號至所述第一電解液室和所述第二電解液室以及所述第一鹽橋室和所述第二鹽橋室；阻抗分析儀，其與所述第一電極和所述第二電極偶聯，用于測量所述第一鹽橋室和所述第二鹽橋室之間的阻抗；并且其中穿過所述主流通道并在所述第一鹽橋室和所述第二鹽橋室之間流動的粒子將在施加激勵信號時引起所述第一鹽橋室和所述第二鹽橋室之間阻抗的可檢測改變。
39.如權利要求38所述的裝置，其中所述第一鹽橋室和所述第二鹽橋室分別通過第一連接通道和第二連接通道與所述主流通道的所述第一相對側面和第二相對側面流體連通。
40.如權利要求38所述的裝置，其中所述第一連接通道和所述第二連接通道具有大約 0. OOlmm 至 0. 05mm 的寬度。
41.如權利要求38所述的裝置，其中所述第一連接通道和所述第二連接通道具有大約 0. OlmmM 0. 2mm 的長度。
42.如權利要求38所述的裝置，還包括第一瓊脂入口和第二瓊脂入口，其分別與所述第一鹽橋室和所述第二鹽橋室偶聯，所述第一瓊脂入口和所述第二瓊脂入口被構造為有利于用瓊脂填充所述第一鹽橋室和所述第二鹽橋室。
43.如權利要求38所述的裝置，其中所述主流通道具有大約0.05mm至0. 5mm的寬度。
44.如權利要求38所述的裝置，其中所述瓊脂是大約2-10%瓊脂和IMKCl重量/體積的混合物。
45.如權利要求38所述的裝置，其中所述激勵信號具有大約0.OlV至IOV的電壓和大約50Hz至IOkHz的頻率。
46.一種用于計數樣品中粒子數目的方法，所述方法包括 將所述粒子流體動力學地集中在主流通道中；施加激勵信號至分別與所述主流通道的第一相對側面和第二相對側面流體連通的第一鹽橋室和第二鹽橋室，所述第一鹽橋室和所述第二鹽橋室被瓊脂填充； 使所述粒子通過所述第一鹽橋室和所述第二鹽橋室之間；以及通過檢測在所述粒子通過所述第一鹽橋室和所述第二鹽橋室之間時所述第一鹽橋室和所述第二鹽橋室之間阻抗的改變來計數粒子的數目。
47.如權利要求46所述的方法，其中所述粒子被集中在所述主流通道的中心。
48.如權利要求46所述的方法，其中所述粒子被集中在所述主流通道的一側。
全文摘要
描述了基于微流的實驗室測試卡。所述測試卡用于及時護理(POC)分析儀。所述測試卡被設計為接收樣品并然后使用所述POC分析儀定量或計數所述樣品中的特定物質。所述測試卡可以由多個層構成。在一個實施方案中，所述測試卡包括具有過濾表面的初級分離室、捕獲通道和粒子檢測器。所述測試卡還可以包括納米線傳感器。
文檔編號C12M1/12GK102239409SQ200980148511
公開日2011年11月9日 申請日期2009年12月7日 優先權日2008年12月5日
發明者劉長庚, 申英植, 羅里·凱利, 薩妮·帕克·金姆, 貝琪·陳 申請人:納諾維德公司