專利名稱：通過低溫保存來分離細胞類產品的方法
通過低溫保存來分離細胞類產品的方法相關申請信息本申請不是臨時申請。本申請要求基于美國臨時申請61/121，957的全部權利，該臨時申請的申請日為2008年12月12日。該臨時申請的全部內容通過援引納入本申請。
背景技術：
現代醫學中，細胞療法、再生療法和組織工程都涉及活細胞和組織的采集、擴增、 修飾和再植等技術。一種重要的例子是分離的朗氏(Langerhans)胰島細胞移植，用于治療 I型(胰島素依賴型)糖尿病。采集供體細胞的過程需要有控制地將所需的治療細胞與供體組織中不需要的其它細胞分離開來。此前，分離胰島的方法一直依賴于組織的粗切片段化，這無法將目標細胞與非所需細胞分離開來。現在，胰島移植依賴于酶法消化，這一方法能夠破壞組織的胞外基質，釋放出其中包裹的胰島，接受進一步的處理和純化。被廣泛采用的這一方法也有缺點，主要是由于難以控制消化過程來獲取最佳的活細胞量。并且，這一方法比較嚴苛，甚至有一定毒性，不可避免地會損失部分有價值的細胞。并且，這一方法要求最純的酶，這樣的酶非常昂貴，并且仍然會因批次間差異造成不穩定和不一致，妨礙此類工藝的優化和標準化。
發明概要此處揭示的方法用于分離細胞類產品，無需或減少對細胞類產品的酶法消化，轉而利用細胞易受冷凍傷害的特點，通過差異冷凍和低溫保存技術將需要的組織與不需要的組織分開。一些實施方式中，用包括以下步驟的方法來分離細胞類產品提供既有不易受冷凍傷害的所需細胞又有易受冷凍傷害的不需要細胞的組織，冷凍該組織，將該組織粉碎，將該組織升溫，將所需細胞與非所需細胞材料分離，由此獲得所需細胞類產品。某些實施方式中，用包括以下步驟的方法來分離細胞類產品對組織進行預處理以使所需細胞更不易受到冷凍傷害而非所需細胞更受到冷凍傷害，將該組織冷凍，將該組織升溫，然后將所需細胞與非所需細胞材料分離，由此獲得所需細胞類產品。某些實施方式中，用包括以下步驟的方法來分離胰島通過脈管系統(vascular system)向胰島組織輸注包含低溫保護劑(CPA)的低溫保護液，通過導管系統(ductal system)向腺泡組織輸注水溶液，將胰臟冷凍，將胰臟粉碎，將胰臟升溫，然后分離胰島。某些實施方式中，分離的胰島組織保留了足夠完好的功能，能夠用作移植源，這樣的胰島細胞是用包括以下步驟的方法分離的手術制備離體(ex vivo)胰臟用于脈管和導管插管，將制備的胰臟冷卻到4°C至7°C左右，用低溫保護劑對胰島組織進行平衡，通過導管沖洗向胰臟輸注水溶液，以此促進冷凍時大量結冰，將胰臟冷凍至-10°C至-200°C左右， 機械粉碎同時保持胰臟在冷凍狀態下，將胰臟浸在介質中融化，由此析出CPA，過濾出胰臟， 洗滌，然后梯度純化或對胰島組織進行培養。以下，通過具體實施方式
的描述了產生本發明的更多特征和優點。
圖IA和IB描繪的是為低溫分離胰島組織進行的預處理。圖IC是圖IA和IB中虛線A截面的放大圖。圖2A和2B描繪的是胰島組織存活率，作為不同冷凍速率和升溫速率下二甲亞砜 (“DMSO“)滲透率的函數。
具體實施例方式本發明實施方式提供的是分離細胞類產品的無酶或少酶方法，與主要依賴于酶消化的方法相比，本發明方法具有較高的一致性、可靠性和較低的毒性。本發明實施方式提供的方法能夠產生足量的所需細胞，這些細胞保留了足夠完好的功能，是有用的移植來源。本文所述方法的實施方式可用來分離各種細胞類產品用于治療或科研，只要所需細胞和非所需細胞已經或能夠經預處理而促進差異冷凍反應。用這樣的方法就能夠以凍結狀態保存和運輸凍結的組織，繼而能夠向終端用戶提供完好組織，降低所需細胞對于缺血性損傷的敏感性。某些實施方式中，可通過提供既有比較不易受冷凍傷害的所需細胞又有較易受冷凍傷害的非所需細胞的組織來分離細胞類產品。這樣的組織可能天然具有差異冷凍特性， 因此在損傷性冷凍過程中使得有些細胞被破壞而有些細胞被保留。例如，有些組織可能含有成核溫度即凍點溫度不同的細胞，例如，所需細胞的凍點溫度低于非所需細胞。某些實施方式中，可以通過對組織進行預處理從而使得所需細胞更不易受冷凍傷害而非所需細胞更易受冷凍傷害來分離細胞類產品。例如，給所需細胞輸注低溫保護劑 (CPA)會使得所需細胞變得更不易受到冷凍傷害，而給非所需細胞輸注不含CPA的溶液則會使非所需細胞變得更易受冷凍傷害。然后，可將該組織冷凍后粉碎，由此可從非所需細胞物質中分離出所需細胞，從而獲得細胞類產品。可將組織升溫，將所需細胞與非所需細胞物質分離，由此獲得包含所需細胞的細胞類產品。某些實施方式中，采用低溫保存(cryopreservation)來選擇性保存所需細胞而破壞非所需細胞。低溫保存是加熱與物質轉移相互偶聯的復雜過程，一般在非平衡條件下進行。簡單地冷凍細胞或組織得到的的物質通常是死的，無功能的。緩慢冷卻過程中，當胞外環境中開始結冰時，水從細胞和組織中析出。細胞外的水結冰打破了滲透壓平衡，導致水向胞外區間外滲，并在胞外結冰。持續地失水，直至達到水的跨膜擴散可以忽略不計的溫度。細胞的失水量取決于胞外結冰后的冷卻速率。低速延長了細胞水向胞外空間的滲透，由此造成更嚴重的細胞脫水。過度脫水導致一系列細胞損傷機制，統稱為“溶液效應”，包括液相水流失造成的電解質毒性濃縮增多，和細胞過度收縮造成的細胞膜損壞。快速冷凍過程中，細胞膜的透水性跟隨溫度迅速降低，由此縮短了水向外滲透的時間。水被留在細胞內，隨著由此造成的水熱力學失衡加劇，細胞質變得超冷。最后，胞內水與胞外溶液熱力學平衡導致的相變將胞內水轉變為冰。一致認為，胞內廣泛結冰與致死性細胞損傷相關。對多數細胞類型來說，存在著能夠最大程度保留細胞活力的最佳冷卻速度。這些冷卻速度引起的細胞脫水足以避免胞內結冰，但不會造成過度失水，過度失水會造成細胞因“溶液效應”而受傷。將細胞從凍存狀態升溫通常采用盡可能快的速度，以避免樣品溫度由低溫升至溶液熔點時小冰晶重結晶為較大的冰。復溫過程中的重結晶是有害的，會降低細胞活力，盡管損傷機制尚不完全明確。然而，當細胞升溫時能夠快速通過會發生重結晶的條件，活力通常較高。在生物材料冷凍后融化過程中使用CPA是已知的。有多種在用CPA，使用最廣泛的是DMS0。這些化學物質通常分為兩類(1)胞內CPA，分子量低，能透入細胞；(2)胞外CPA， 分子量高(大于或等于蔗糖的342道爾頓)，不能透過細胞。透過性CPA的主要保護模式是由CPA取代胞內水。有控制地去除胞內水對于抑制胞內致死性結冰來說至關重要。受凍組織經歷廣泛的胞外結冰，即使是原本能夠保持極佳細胞活力的過程亦是如此。雖然普通組織病理學方法無法在融化后檢出冰，低溫取代技術能夠揭示組織內冰的位置。已用這些技術發現顯著的胞外基質變形和損傷。冷凍傷害的程度取決于系統內游離水的量，和冷凍過程中這些水的結晶能力。為了說明，以下將特別描述分離胰島的實施方式。然而，本領域普通技術人員懂得，還有除胰細胞之外的其它實施方式。某些實施方式中，圖1A、1B和IC所示，方法包括預處理胰臟10，使得胰島組織16 更不易受冷凍傷害，而腺泡組織18更易受冷凍傷害。可通過區別灌注來預處理胰臟10，從而最大程度地破壞腺泡組織18而保存胰島組織16。例如，可通過脈管系統，例如通過腹腔干12和腸系膜上動脈14，給胰島組織16輸注含有CPA的低溫保護液。胰島組織16充分平衡后，可通過胰管20給腺泡組織18輸注水溶液。某些實施方式中，胰臟預處理可在受控條件下進行，從而優先平衡胰腺內的胰島組織。例如，脈管輸注可在約2°C至約35°C進行。而且，透過性CPA灌注的持續時間必須足以平衡胰島組織，但并非整個胰腺。例如，灌注可持續約20分鐘至約70分鐘，例如約25至 35分鐘，或約30分鐘。這一步驟的原則是給胰島組織提供足夠的CPA以保護其在后面的胰臟冷凍過程中免收冷凍傷害。某些實施方式中，低溫保護液將CPA包含在水溶液中，例如經緩沖的生物學介質。 舉例來說，CPA可選自DMS0、甘油、乙二醇、丙二醇、蔗糖和海藻糖。已知，DMSO是比甘油更好的CPA，約0. 5至約3. 0摩爾濃度的CPA對于盡可能減少低速冷凍生物系統中的細胞損傷往往特別有效。某些實施方式中，可給腺泡組織輸注水溶液，例如水或等滲鹽水。往胰管內逆向輸注水溶液可在如上所述對胰島組織的脈管輸注完成后立即開始。這一步驟的原則在于用水溶液浸潤腺泡組織，促進冷卻和冷凍時無低溫保護腺泡組織內廣泛的破壞性結冰。較好的是，腺泡組織輸注可在受控條件下持續，直至胰腺被水溶液浸透，例如直至看得出胰腺膨大以促進冷凍時大量結冰。例如，可在約100至約120mmHg壓力下輸注約300 至約400ml水或等滲鹽水，持續約5至約10分鐘，在控壓系統內進行。某些實施方式中，所述方法接著將胰臟冷凍。可將胰臟冷卻至零度以下 (sub-zero)，直至凍結。這一步驟的原則在于在無保護組織內形成盡可能多的結冰，促進組織破壞，利于此后胰腺解體釋放出受低溫保護的胰島組織。
某些實施方式中，可將胰臟冷凍到約-10 V至約-200 V，例如約-40 V至約-170°C，或約-80°C至約-130°C。某些實施方式中，冷凍胰臟可以約1°C /分鐘至約20°C / 分鐘的冷卻速度進行，例如約6°C /分鐘至約15°C /分鐘。某些實施方式中，冷卻速度可以是約0. 5°C /分鐘至約5°C /分鐘。胰臟冷凍速度結合迅速的升溫速度可提供獲得功能性胰島組織的最佳條件。在圖 IA顯示的例子中，以11°C /分鐘的速度冷凍，在用2摩爾濃度DMSO完全或部分平衡后迅速升溫，與之對應的是超過50%的胰島功能保留。圖IA還顯示，如果冷凍速度降至約1°C / 分鐘并升溫迅速，存活率可升高至約80%。圖IB顯示就例舉的緩慢冷凍胰島來說，緩慢升溫是不利的(約20%存活率)，不論是否用CPA完全或部分平衡胰島。某些實施方式中， 可通過將胰臟直接浸在溫熱的介質，例如浸在經滲透壓緩沖的介質中將胰臟升溫。可以理解的還有CPA平衡程度可能并不重要，尤其是向著迅速升溫結合緩慢冷卻來優化熱交換的時候。這或許是有利的，因為結合盡可能減少CPA向外泌細胞內滲透的要求來確定胰島原位完全平衡所需的條件不容易。某些實施方式中，可用液氮供應系統來冷凍胰臟。為了加強胰臟的粉碎，可將大體積升溫與液氮冷凍結合，同時增加浸在熱水浴中的壓縮空氣換熱器。這樣，就能夠融化胰腺而無需將其從工作平臺上移出。可在升溫過程中粉碎胰腺。某些實施方式中，補充低劑量消化酶可能是有利的，這有助于最終的結締組織分散，當冷凍和粉碎尚不能完全釋放粉碎后組織中的低溫保護胰島時。如果低溫下冷凍胰臟的迅速釋放被視為有利，可將探針瞬時加熱，從而僅融化包圍探針的一薄層胰臟，降低探針粘連胰臟的可能性。某些實施方式中，將胰臟粉碎，從而由解體的腺泡組織中釋放出被低溫保護的胰島組織。可在胰臟仍然凍結或其升溫時將其粉碎。某些實施方式中，所述粉碎可采用機械應力、差異膨脹誘導的熱力-機械應力、陡直溫度梯度誘導的熱力-機械應力、冷凍時體積改變誘導的熱力-機械應力，或它們的組合。熱力-機械應力是材料受凍趨于收縮的結果，可能受到三種不同作用的驅動前文所述冷凍后的體積改變，陡直溫度梯度和復合材料的差異膨脹。實際上，上述中的兩項或以上可能協同作用。后文會解釋如何利用這些作用來促進粉碎。陡直溫度梯度的作用大多數材料降溫時會收縮(一個例外是水在相變時的不規則表現)。當形成溫度梯度時，相鄰層的材料會以不同速度收縮。為了使相鄰層材料的實際收縮相互匹配就會產生機械張力，于是造成材料內的應力。當溫度梯度造成的應力超過了冷凍材料的強度，就發生斷裂。差異熱膨脹的作用即使整個器官的溫度均勻，但隨時間而變化，仍然會因不同材料收縮速度不同而發生斷裂。某些實施方式中，預處理后，冷凍胰臟有兩類主要區域被等滲溶液充滿的區域和被CPA充滿的區域，其中，由于胰臟的形態，大量的小CPA區域會被包裹在大的冷凍等滲溶液區域之內。此外，材料的不連續性，例如，在胰島表面或者結締組織與其他腺體組成之間的材料不連續性，也參與造成差異熱膨脹和收縮所致的結構破壞。固態時一當整個器官處于極低溫度一材料的不連續性對于斷裂的發展幾乎沒有作用。然而，在某些中等低溫(cryogenic temperature)，斷裂對胰島的損傷可能較小，此時，由于CPA的存在，眾多斷裂在一定程度上就像粘稠物質。玻璃化CPA的粘度隨溫度降低指數性升高，但是，高到直至玻璃轉化溫度以上10°C的粘度值應該能夠在任何實際的時間尺度(practical time scale)上讓CPA呈現好像流體或液體的狀態。就本發明而言，中等低溫的上限是純水的凍點(0°C )，下限則是CPA的玻璃轉化溫度(對DMSO來說是-123°C 左右)。例如，CPA的熱收縮率可達純水的3倍，這可能影響到應力分布，繼而影響到胰島周圍的斷裂方式。另一些實施方式中，粉碎胰臟可以通過機械粉碎凍結組織來進行。例如，這可以分兩階段進行。第一階段可以是用物理方式將胰臟碎成小片，例如用榔頭和鑿子。第二階段可以是將凍結組織的碎片浸在溫水或等滲介質中進行研磨，例如用電動碎冰機或攪拌機。這還具有在對組織進行機械研磨的同時快速升溫和稀釋低溫保護劑的作用。某些實施方式中，所述方法還包括將胰島與不需要的胰臟物質分離。分離胰島組織可以通過例如以下手段實施或它們的組合來完成過濾、密度梯度分離、組織培養。過濾可用過濾裝置進行，例如不銹鋼篩網(茶漏)。分離可以包括用含有蛋白酶抑制劑(例如 PEFABLOC )和脫氧核糖酶(例如PULMOZYMF )的介質洗滌過濾后的胰臟，由此去除來自被裂解外泌組織的有害內源性蛋白酶和DNA。某些實施方式中，可用胰島指示劑(例如雙硫腙)對過濾后的胰臟進行染色，然后在顯微鏡下檢看完整的胰島組織。分離出的胰島組織可能沒有與腺泡組織完全分離，并且，或許不是所有胰島組織都完整。例如，有些胰島組織的組織可能比較松散，這可能表明經受了胰臟回溫過程中直接浸入水性介質所致的滲透壓沖擊。某些實施方式中，可以通過以下手段避免這一問題在融化胰臟過程中或融化后，在從胰島組織中洗去CPA過程中采用等滲緩沖液。采用等滲緩沖技術能夠保護胰島組織的結構，盡可能減少透過性CPA流出時的滲透性膨脹和裂解。但同時，等滲緩沖不影響腺泡細胞的解體和裂解，因為這些細胞沒有受到CPA滲透作用的保護。為了更徹底地分離胰島組織，某些實施方式中，可將上述低溫分離方法與溫和酶消化組合來純化胰島組織。另一種方法可以是采用組織培養作為一種“清除”模式，因為低溫分離過程中受損的殘余腺泡組織會在培養中死亡或解體。以下用實施例來說明可用于本發明實施方式的不同組成(compositions)和條件。所有比例都是重量比，除非另作說明。然而，顯而易見，根據前文和后文所述，本文所揭示的內容可用多種不同的組成和來實施，并且可以具有多同不同的用途。例如，本領域技術人員很容易明白，以下實施例同樣可用于分離人的胰島，因為豬胰臟是本領域公認的人胰臟模型。豬胰臟成為有用的模型至少出于以下原因(1)豬胰臟是重要熱轉移和物質轉移參數的合適模型；(2)豬胰臟是大型動物模型；(3)豬被認為是將來臨床異種移植最有希望的胰島來源；(4)豬胰臟可經手術分成彼此獨立的可灌注的兩葉，由此可以采用同一胰臟進行比較處理，避免動物個體/組織差異的影響。實施例1手術制備豬胰臟用于全器官灌注和分葉灌注.用器官保存液原位低溫沖洗后，從供體取出胰臟，保留胰頭周圍連著的一段十二指腸以保護胰十二指腸上、下動脈。在灌注準備階段，胰臟在冰上維持于低溫狀態。保留的十二指腸段包括總膽管和胰管的開口。在切除脾臟之前先將脾側脾靜脈和脾動脈結扎。保留與胰臟相連的5-7cm長的一段大動脈，供以后器官插管進行全胰臟灌注。保留的大動脈段包括腸系膜上動脈(SMA)和腹腔干(CT)血管的開口。細心尋找和結扎胰臟胃十二指腸側和肝側邊緣所有露出的支動脈，保證整個腺體內灌注均勻且流出液僅從門靜脈流出。用十二指腸側的開口進行胰管插管，保留全部前期支管(early duct branches)，保證以后器官擴張良好以利腺體的消化和胰島的分離。要進行胰臟灌注，將一個密封圈套管(0RS，德斯·普雷恩城，伊利諾伊州)裝在從大動脈段(包括SMA和CT的開口)切下的大動脈片上，不影響SMA和CTl兩管的管腔。該插管提供胰臟和灌注系統之間的密封流動連接。將大動脈片套管與泵式輸注端口相連。要進行分葉灌注，小心地將胰臟分成胰頭葉和胰尾葉。在接近SMA的腹腔干位置將胰臟一切為二，把SMA留給尾葉。對于尾葉，直接用源自腹腔干的脾動脈插管灌注。如有必要，按照豬供體解剖所需，可以給在腸系膜上動脈上接裝第二插管以促進尾葉低位部分的灌注。對于頭葉(“C”形)灌注，直接用胃十二指腸和/或肝動脈插管灌注。頭葉灌注期間，十二指腸仍留在器官上。等分兩葉之間的門靜脈，確保灌注過程中出液順暢。用于兩葉直接插管的套管直接與泵式輸注端口相連。低溫分離豬胰島可選用的條件如下所述。用2摩爾濃度DMSO作為CPA，因為它被廣泛用于胰島的低溫保存。關于脈管輸注 CPA的模式，用密封環套管和蠕動泵進行腹腔/SMA灌注30分鐘，溫度為4°C至7°C。關于導管輸注水的模式，用注射器通過胰管向胰臟注水，直到可見的胰臟膨脹。冷凍步驟中，將埋有熱電偶的胰臟放在不銹鋼盤上，盤子被支撐在-196°C沸騰液氮的上方。該不銹鋼盤提供了冷卻大浸潤器官所需的大表面和導熱性。關于胰臟組織粉碎的模式，利用熱沖擊，即將凍結組織直接浸入溫熱介質來令組織斷裂。或者，可用電子碎冰機，用溫熱介質對組織進行機械粉碎，溫熱介質有助于迅速升溫和稀釋。上述條件下的胰島低溫分離產生的冷凍速度為11°C /分鐘，凍結胰臟內的最終溫度低于-160°C。將固體的凍結胰腺一分為二，進行不同模式的粉碎和升溫。首先，將含有熱電偶的凍結塊直接浸入溫熱(30°C )組織培養基。由此形成的升溫速度是12°C /分鐘，但無法獲得宏觀斷裂。由此可知這一升溫模式不大可能產生廣泛的熱力斷裂將組織碎成含有胰島的小碎片。第二種粉碎和升溫模式包括分兩階段機械粉碎凍結組織。首先，用榔頭和鑿子通過物理手段將凍結胰臟粉碎。接著，浸在溫熱介質中作物理研磨。結果顯示，可以對同一胰臟采用不同的冷凍條件，由此實現原位低溫保存完好胰島，同時加強周圍腺泡組織的破壞。實施例2差異冷凍技術被用來在冷凍破壞胰臟令胰島解體從而釋放出活胰島的過程中原位地選擇性保護胰島。具體地說，先手術制備離體胰臟用于脈管和導管插管。為了避免動物個體差異和限制研究所需豬的數量，采用了分葉制備，豬胰臟的手術制備使得能夠彼此獨立地進行胰頭灌注和胰尾灌注，見后文。對照(傳統酶法)和試驗(低溫分離)組可各自研究5個平行樣本。然后將胰臟冷卻至4°C至7°C，用CPA/Unisol混合物灌注30分鐘，用IOmmHg的壓力。每個胰島代表一個滲透壓平衡單元，所以，平衡會很快(大約60分鐘不到)。用一調壓系統，通過導管沖洗方式以100-120mm Hg的壓力向胰臟軟組織注入300_400ml蒸餾水或鹽水，5-10分鐘。以1-10°C /分鐘的冷凍速度立即將胰臟冷卻至-40°C或低于_140°C，凍結胰臟的同時保護胰島。凍結組織機械粉碎后裝入組織攪拌機(在此階段，保持組織的凍結狀態)。組織在攪拌機中，在蔗糖介質中，被粉碎的同時被融化。然后用不銹鋼篩網(例如茶漏)過濾產物。這一步驟去除大塊的沒有粉碎的外泌組織和纖維廢料。然后用含有 PEFABL0C 和PULM0ZYME 的介質攪拌洗滌產物，由此去除裂解的外泌組織釋放的有害內源性蛋白酶和DNA。對產物進行梯度純化和/或培養，從外泌裂解物中純化胰島。低溫分離的效率根據差異冷凍產生的胰島和胰臟碎片的大小分布來評價。這包括對產生的碎片的雙硫腙染色評定，所述碎片包括含有被包埋胰島的碎片，含有完全分離的游離胰島的碎片，和部分分離的所謂有覆蓋(mantled)胰島的碎片。該基線低溫分離技術的相對效率通過與傳統膠原酶(例如，羅氏公司(Roche)出品的LIBERASE，或Serva或 VitaCyte的膠原酶)技術的比較來判斷，比較采用本文所述的對照和現有技術中豬胰臟分離中對照的數據。某些實施方式中，評價分離和純化胰島組織的技術可以包括胰島定量，采用葡萄糖刺激胰島素分泌試驗的胰島活力和功能性活力評價。胰島質量評價按照胰島分離和純化規程，用解剖顯微鏡目鏡里的計數標線來測定胰島總數，并標化為胰島當量(IE)。胰島用雙硫腙染色、計數，然后轉化為胰島當量 (IE)。兩次重復計數的結果與計算機細胞計數器(例如IMAGEPR0 軟件)得出的數值相當。根據雙硫腙染色組織與非染色外泌組織之比評定胰島制備物的純度。胰島活度用兩項基本實驗來評價胰島活度基于的吖啶橙/碘丙啶(Α0/ΡΙ)活/ 死染色，或Syto綠/溴乙啶熒光膜完整度檢測，和基于alamarBlue 的代謝實驗。Α0/ΡΙ實驗可得出胰島完好性的半定量指標。相比之下，alamarBlue 實驗是一種體外(in vitro) 非介入性測定胰島活度的定量方法，并且，因為反應試劑無毒，該實驗可對還將接受后續檢測的胰島進行。胰島功能和結構的體外評價組織完好性和壞死的形態學檢測包括常規染色 (H&E)，電子顯微鏡檢查和細胞凋亡(TUNEL實驗)以及氧化壓力(谷胱甘肽水平)和能量 (ATP實驗)等參數。可用常規技術檢測胰島素含量及其受激分泌。實施例3本實施例代表了以酶消化補充低溫分離技術的實施方式，采用了減量(即濃度) 的膠原酶。這是因為，完全無酶低溫分離胰島可能無法完全將胰島組織從胰臟分離，某些實施方式中，溫和的酶消化與低溫分離組合能夠獲得更好的產物。因此，在冷凍腺體之前， 在導管灌注中加入低劑量膠原酶(例如羅氏公司的LIBERASE，或Serva或VitaCyte的膠原酶)的方法是有利的。用常規劑量(1.4mg/ml)的半劑量(0. 7mg/ml)和十分之一劑量 (0. 14mg/ml)進行平行實驗，測定它們在升溫后對胰島分離的影響。評定方式為如此前所述，比較胰島得率和游離、有覆蓋和被包埋胰島之比。總共9頭豬可進行每組N = 6的組間比較，詳見表1。表 1
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權利要求
1.一種分離細胞類產品的方法，包括提供含有較不易受冷凍損害的所需細胞和較易受冷凍損害的非所需細胞的組織，冷凍組織，粉碎組織，使組織升溫，和將所需細胞與非所需細胞物質分離，得到細胞類產品。
2.如權利要求1所述的方法，其中，提供含有較不易受冷凍損害的所需細胞和較易受冷凍損害的非所需細胞的組織包括對組織進行預處理使之具有這樣的特性。
3.如權利要求2所述的方法，其中，所述組織是胰臟組織，所述細胞類產品是胰島。
4.如權利要求3所述的方法，其中，預處理胰臟組織包括通過脈管系統給胰島輸注含有低溫保護劑的低溫保護液，和通過導管系統給腺泡組織輸注水溶液。
5.如權利要求3所述的方法，還包括用消化酶處理胰島。
6.如權利要求4所述的方法，其中，所述低溫保護劑選自二甲亞砜、甘油、乙二醇、丙二醇、蔗糖和海藻糖。
7.如權利要求4所述的方法，其中，所述溶液是水或等滲鹽水。
8.如權利要求2所述的方法，其中，預處理組織包括給組織輸注低溫保護液，直至所需細胞與低溫保護劑達到熱力學平衡。
9.如權利要求4所述的方法，其中，給胰島輸注低溫保護液在約2°C至約35°C進行約 20至約70分鐘。
10.如權利要求4所述的方法，其中，給腺泡組織輸注水溶液持續到胰臟組織看得見地膨脹。
11.如權利要求4所述的方法，其中，低溫保護劑在低溫保護液中的濃度約為0.5摩爾濃度至約3. 0摩爾濃度。
12.如權利要求3所述的方法，其中，冷凍胰臟組織包括將胰臟凍至約-10°C至約-200"C。
13.如權利要求3所述的方法，其中，冷凍胰臟組織的冷卻速度約1°C/分鐘至約20°C / 分鐘.
14.如權利要求3所述的方法，其中，使胰臟組織升溫的升溫速度高于約12°C/分鐘。
15.如權利要求3所述的方法，其中，使胰臟組織升溫是通過將所述直至直接浸入溫熱的經滲透壓緩沖的介質中。
16.如權利要求3所述的方法，其中，粉碎胰臟組織采用選自以下的技術機械應力、差異膨脹誘導的熱力-機械應力、陡直溫度梯度誘導的熱力-機械應力、冷凍時體積改變誘導的熱力_機械應力、和它們的組合。
17.如權利要求3所述的方法，其中，粉碎胰臟組織是在胰臟組織凍結狀態下或者胰臟組織融化狀態下完成的。
18.如權利要求4所述的方法，還包括從胰島中洗去低溫保護劑和在此期間對胰臟組織進行滲透壓緩沖。
19.如權利要求3所述的方法，還包括向胰臟組織加入濃度低于1.4mg/ml的膠原酶。
20. 一種分離保留了足夠功能完好性從而適合用作移植源的胰島組織的方法，包括 手術制備離體胰臟用于脈管插管和導管插管； 將胰臟冷卻至約2°C至約35 °C ； 用低溫保護劑平衡胰島組織；通過導管沖洗給胰臟輸注蒸餾水或鹽水，促進冷凍時廣泛結冰； 將胰臟凍至約-10°C至約_200°C ； 機械粉碎胰臟，同時保持胰臟凍結狀態； 通過浸入介質以析出低溫保護劑來融化胰臟； 過濾胰臟；用含有蛋白酶抑制劑和脫氧核糖核酸酶的介質清洗胰臟；和梯度純化或培養胰島組織。
全文摘要
分離例如胰島等細胞類產品的方法，可用于糖尿病研究和治療移植。所述方法可包括提供含有較不易受冷凍損害的所需細胞和較易受冷凍損害的非所需細胞的組織，或對組織進行預處理使之具有上述特性。所述方法可包括冷凍組織，粉碎組織，回溫組織和將所需細胞與非所需細胞物質分離，獲得細胞類產品。因此，所述方法提供了分離細胞類產品的無酶或少酶方法，與傳統方法相比具有更高的一致、可靠性，更低的毒性。所述方法能夠得到最佳量的細胞類產品，且所述產品保留了足夠的功能完好性，從而可用作移植源。
文檔編號C12N5/071GK102292433SQ200980154873
公開日2011年12月21日 申請日期2009年12月14日 優先權日2008年12月12日
發明者戴維·佩格, 麥克爾·泰勒 申請人:麥克爾·泰勒