專利名稱：：蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病pcr快速檢測方法
技術領域：
：本發明屬于生物領域。
背景技術：
：蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病，簡稱歐幼病(Europeanfoulbrood，EFB)是蜜蜂幼蟲期的一種接觸性傳染病，主要感染2日齡以下的小幼蟲，但是病程延長時封蓋幼蟲也有死亡的，在這種情況下容易與美腐病棍淆。它的病原菌不形成芽孢，較易治愈。歐幼病，廣泛發生于各養蜂國，屬于世界性病害。該病于1885年首次報道，目前廣泛發生于世界幾乎所有的養蜂生產國。我國于20世紀50年代初在廣東省首次發現，60年代初南方諸省相繼出現病害，隨后蔓延全國。該病不僅西方蜜蜂感染，東方蜜蜂尤其是中蜂也易感染，且感染后發病比西方蜜蜂嚴重得多。EFB—般只感染小于2日齡的幼蟲，通常病蟲在4-5日齡死亡。患病后，蟲體變色，失去肥胖體態。從珍珠般白色變為淡黃色、黃色、淺褐色，甚至黑褐色。剛變褐色時，通過表皮清晰可見幼蟲的氣管系統。隨著變色，幼蟲塌陷，似乎被扭曲，最后在巢房底部腐爛，干枯，成為粘性、易清除的鱗片。蟲體腐爛時有難聞的酸臭味。致病菌為蜂房蜜蜂球菌(Melissococcuspluton，M.pluton)，為蜜蜂球菌屬，該菌單個的形態為披針形，直徑0.5l.Oym，革蘭氏染色陽性，常結成鏈狀或成簇排列。主要侵害12日齡的蜜蜂幼蟲，使幼蟲在34日齡未卦蓋時大量死亡，成為蜜蜂的主要病害之一。歐洲幼蟲腐臭病的早期檢查有助于防止疾病的蔓延。面對國際嚴峻形勢，根據世界動物衛生組織對動物重大傳染病檢疫技術的有關規定，結合我國實際情況研究制訂符合國際規則的蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病檢疫規程已經成為當務之急。關于蜜蜂歐洲幼蟲腐臭的診斷方法，國內還主要根據臨床證狀來進行診斷，診斷水平還比較低。目前國內行業標準SN/T1687-2005蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病診斷方法主要基于蜂房蜜蜂球菌的形態學觀察來進行診斷，該標準是將臨床上疑似蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病的幼蟲或死亡的幼蟲進行染色直接鏡檢初步診斷為蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病，然后經分離培養后染色鏡檢，在普通光學顯微鏡下，蜂房蜜蜂球菌呈單個或成串或頭尾相間成對或成短鏈狀或成簇排列的短披針型球菌，大小為0.5mmX10mm即可判定為蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病。該方法主要依靠形態學檢查，費時較長，判斷易受主觀因素影響。
發明內容本發明目的是建立PCR檢測方法，為蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病診斷、防治、檢疫以及蜂產品病原污染檢測提供快速、準確、簡便的蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病PCR快速檢測方法。本發明步驟是a、采用CTAB法或者試劑盒法獲得歐洲幼蟲腐臭病DNA;b、歐洲幼蟲腐臭病DNA的濃度和純度的測定取5iiLDNA溶液加雙蒸水稀釋至lmL，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計分別檢測260nm和280nm處的吸光值A260和A280，使A260與A280比值在1.72.0之間；c、引物EFB1:5，-CTTTGAACGCCTTAGAGA—3'EFB2:5'-ATCATCTGTCCCACCTTA-3'EFB3:5'-TTAACCTCGCGGTCTTGCGTCTCTC-3';d、采用半巢式PCR擴增方法，根據蜂房蜜蜂球菌16SrRNA基因，設計引物EFBl和EFB2進行第一輪PCR擴增，所得PCR理論擴增產物片斷大小為486bp，此步擴增結果可以對蜂房蜜蜂球菌與其它雜菌進行區分，但卻無法對與蜂房蜜蜂球菌親源關系較近的糞腸球菌進行區分；進而再以所得擴增產物為模板設計第三條引物EFB3，其位置處于EFB1和EFB2引物中間，以EFB1和EFB3為弓|物進行第二輪PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，理論擴增片斷大小為276bp，可以特異性對與蜂房蜜蜂球菌親源關系較近的腸球菌進行有效區分；最終通過半巢式PCR擴增方法對蜜蜂幼蟲及蜂產品中的蜂房蜜蜂球菌進行特異性檢測。本發明試劑盒成份如下組分數量10xBuffer1支(lmL)dNTPsMixture(各2.5mmol/L)1支(0.2mL)EFB1(20nmol/L)1支(,l)EFB2(20nmol/L)1支(lOOul)EFB3(20nmol/L)1支(腳l)ExTaq酶(5U爾D1支(300U)TemplateDNA1支(lmL)DEPCH201支(lmL)本發明具有快速、敏感性高、特異性強等優點，可用于快速診斷歐洲蜂幼蟲腐臭，尤其對多種病原引起的混合感染的鑒別診斷更為有效。本標準的建立的PCR檢測方法，為我國歐洲蜂幼蟲腐臭診斷、防治、檢疫以及蜂產品病原污染檢測提供快速、準確、簡便的檢測方法，以期達到有效控制蜜蜂疾病，提高蜂產品質量具有重要意義。圖1是本發明16SrRNA基因PCR擴增結果；圖中1:100bpDNALadderMarker;2:蜂房蜜蜂球菌；3:空白對照；4:微孢子蟲病原；5:蜜蜂幼蟲芽孢桿菌；6:蜜蜂敗血桿菌；7:糞腸球菌圖2是本發明蜂房蜜蜂球菌結果；圖中1:100bpDNALadderMarker;2:空白對照；3:糞腸球菌；4:蜂房蜜蜂球菌。圖3是本發明酶切鑒定結果；圖中1:100bpDNALadderMarker;2:蜂房蜜蜂球菌；3:糞腸球菌。圖4是本發明敏感性檢測結果；圖中1:100bpDNALadderMarker;2:10—1;3:10—2;4:10—3;5:10—4;6:10—5;7:lO—68:空白對照。圖5是本發明PCR敏感性檢測結果；圖中1:100bpDNALadderMarker;2:IO1;3:IO2;4:IO3;5:IO4;6:IO5;7:IO6;8:IO79:IO810:IO911:陰性對照。具體實施例方式本發明具體步驟是a、采用CTAB法或者試劑盒法獲得歐洲幼蟲腐臭病DNA;b、歐洲幼蟲腐臭病DNA的濃度和純度的測定取5yLDNA溶液加雙蒸水稀釋至lmL，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計分別檢測260nm和280nm處的吸光值A260和A280，使A260與A280比值在1.72.0之間；c、引物EFB1:5'-CTTTGAACGCCTTAGAGA-3'EFB2:5'-ATCATCTGTCCCACCTTA-3'EFB3:5'—TTAACCTCGCGGTCTTGCGTCTCTC—3';d、采用半巢式PCR擴增方法，根據蜂房蜜蜂球菌16SrRNA基因，設計引物EFBl和EFB2進行第一輪PCR擴增，所得PCR理論擴增產物片斷大小為486bp，此步擴增結果可以對蜂房蜜蜂球菌與其它雜菌進行區分，但卻無法對與蜂房蜜蜂球菌親源關系較近的糞腸球菌進行區分；進而再以所得擴增產物為模板設計第三條引物EFB3，其位置處于EFB1和EFB2引物中間，以EFB1和EFB3為弓|物進行第二輪PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，理論擴增片斷大小為276bp，可以特異性對與蜂房蜜蜂球菌親源關系較近的腸球菌進行有效區分；最終通過半巢式PCR擴增方法對蜜蜂幼蟲及蜂產品中的蜂房蜜蜂球菌進行特異性檢測。病料和菌種蜂房蜜蜂球菌NCDO2443標準株由福建農林大學蜂學院提供，患蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病料由中國農科院蜂病研究所提供；微孢子蟲病原、蜜蜂幼蟲芽孢桿菌、蜜蜂敗血桿菌、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)本局技術中心實驗室保存。試劑及培養基細菌基因組DNA小量提取試劑盒(MiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionKit,Ver.2.0)、TaqHSDNA聚合酶、dNTP(各2.5mmol/L)、10Xbuffer緩沖液、6XLoadingbuffer,100bpDNALadderMarker，Hinfl限制性內切酶等購自大連寶生物工程有限公司，PCR引物由大連寶生物工程有限公司合成。培養基配制酵母浸出液10g，半胱氨酸2g，葡萄糖10g，可溶性淀粉10g，lMKH2P04P朋.6lOOmL，加入瓊脂2g，加蒸餾水lOOOmL，115。C滅菌20min。CTAB沉淀液稱取5.OgCTAB，2.3376g氯化鈉，加水溶解定溶至1L，分裝后高壓滅菌備用。實驗儀器高速冷凍離心機(SIGMA3K30，德國西格馬公司)，核酸蛋白分析儀(GeneSpecV，HitachiNaKainstrumentsCo.，Ltd.日本)，PCR擴增儀(BiometraTgradient-96，德國Biometra公司)，電泳儀(SAVANTPS500A美國)，凝膠成像系統(KodakEDAS290，美國柯達公司)，C02培養箱(ThermoLifeScience)，生化恒溫培養箱，微量移液器(0.1誦BI0HIT芬蘭)、恒溫水浴鍋等。蜜蜂樣品(包括幼蟲和成蟲)DNA的提取及純化—、CTAB法稱取約200mg用研缽磨碎的樣品轉入2mL的離心管中。加入1.3mLDNA抽提緩沖液，渦旋震蕩30s后，顛倒混合5min(注意不要使樣品結塊)，65。C水浴30min。室溫10000g離心10min，取上層溶液800iiL，加入5iiLRNaseA(10yg/mL)，37。C保溫30min。加入等體積的三氯甲烷異戊醇(24:l，v/v)，顛倒混勻lmin，室溫lOOOOg離心lOmin，取上清液600iiL，加入2倍體積的CTAB沉淀液，混勻，室溫放置30min。室溫8000g離心10min，棄上清液。加入800iiL氯化鈉(NaCl)(1.2mol/L)溶解沉淀，待沉淀溶解后室溫放置5min，加入等體積三氯甲烷異戊醇(24:1，v/v)，顛倒混勻。室溫10000g離心10min，取上清液600iiL，移入1.5mL的E卯endorf管中，加入0.6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置30min。4°C，5000g離心10min，棄上清液。70%冷乙醇200yL洗滌沉淀兩次，100%冷乙醇200yL洗滌沉淀一次，自然干燥10min。加入50iiLTE緩沖液(pH8.0)，溶解DNA沉淀。-2(TC長期保存。二、試劑盒法可根據需要選用相應的商品化試劑盒，使用時按操作說明書提取DNA。DNA濃度和純度的測定取5iiLDNA溶液加雙蒸水稀釋至lmL，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計分別檢測260nm和280nm處的吸光值A260和A280。DNA的濃度按下述公式計算c=AXNX50/1000公式中c——DNA濃度，單位為微克每微升(yg/yL);A——260nm處的吸光值；N——核酸稀釋倍數。當A260/A280比值在1.72.0之間時，適用于PCR擴增。引物設計與合成采用半巢式PCR擴增方法，根據蜂房蜜蜂球菌16SrRNA基因，設計引物EFBl和EFB2進行第一輪PCR擴增，所得PCR理論擴增產物片斷大小為486bp，此步擴增結果可以對蜂房蜜蜂球菌與其它雜菌進行區分，但卻無法對與蜂房蜜蜂球菌親源關系較近的糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)進行區分(此步糞腸球菌PCR擴增片斷大小也為486bp);進而再以所得擴增產物為模板設計第三條引物(EFB3，其位置處于EFB1和EFB2引物中間)，以EFB1和EFB3為引物進行第二輪PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，理論擴增片斷大小為276bp，可以特異性對與蜂房蜜蜂球菌親源關系較近的腸球菌(沒有擴增產物)進6行有效區分。最終通過半巢式PCR擴增方法對蜜蜂幼蟲及蜂產品中的蜂房蜜蜂球菌進行特異性檢測。表7-l蜂房蜜蜂球菌PCR引物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>PCR檢測PCR反應液須在冰盒中進行配制，配液順序為去離子水(ddH20)、10Xbuffer、dNTP、引物、Taq酶、樣品DNA。以提取的蜂球囊菌DNA為模板，每次反應均設陰性對照。反應體系如下表表7-2反應體系參數<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>應用德國Biometra公司的BiometraTgradient-96梯度PCR擴增儀進行擴增反應，其反應步驟包括預變性、變性、退火、延伸，具體參數如表7-3表7-3循環參數<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>第一輪PCR檢測特異性試驗以微孢子蟲病原、蜜蜂幼蟲芽孢桿菌、蜜蜂敗血桿菌為特異性試驗對照，以之前一檢測過的蜂房蜜蜂球菌DNA作為陽性樣品，并設ddH20作為陰性對照，在之前已建立的最佳反應條件和反應體系下進行PCR反應，1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后分析結果并拍照。第二輪PCR檢測特異性試驗以第一輪PCR擴增的產物為模板，用EFB2和EFB3為引物進行第二輪PCR擴增，蜂房蜜蜂球菌理論擴增片斷大小為276bp，屎腸球菌無特異性擴增產物，從而達到有效鑒別的目的。第一輪PCR產物的酶切鑒定針對第一輪PCR無法對蜂房蜜蜂球菌與糞腸球菌進行鑒別的問題，通過對兩株菌的PCR產物序列進行酶切位點的分析，表明可以使用Hinfl限制性酶進行酶切鑒別，蜂房蜜蜂球菌第一輪PCR產物經Hinfl酶切后理論片段大小為340bp和146bp，而糞腸球菌第一輪PCR產物經Hinfl酶切后理論片段大小為254bp、146bp和86bp三段，因此，可以也通過酶切的方法對這兩種菌第一輪PCR產物進行有效的鑒別。PCR檢測敏感性試驗在已確定陽性的幼蟲芽胞桿菌懸液用生理鹽水作1(^、1(f、l(f、l(^、10s、10e倍稀釋，每個稀釋度的菌液各取lmL分別用來進行平板計數和提取DNA。采用傾注法倒平板，在3rC正常大氣條件下培養。然后用IS0標準方法估計菌落總數，菌落數在300以上的平板應排除，將各稀釋濃度平板所對應提取的DNA用作模板，在最佳反應條件和反應體系下進行PCR檢測并觀察結果。蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病半巢式PCR檢測方法的建立與標準化第一輪PCR檢測的特異性試驗結果用所設計的引物EFB1和EFB2對蜂房蜜蜂球菌16SrRNA基因進行第一輪PCR擴增，結果如圖l所示。特異性的擴增片段在400bp與500bp之間，約為485bp。從圖1可以看出通過第一輪PCR擴增，蜂房蜜蜂球菌和糞腸球菌在約486bp處均擴增出特異性條帶，如圖1中第2和第7泳道；而在微孢子蟲病原、蜜蜂幼蟲芽孢桿菌、蜜蜂敗血桿菌未見特異性擴增條帶，表明可以通過第一輪PCR檢測達到與上述三種蜜蜂病原體鑒別診斷的目的。對于糞腸球菌還需通過后續試驗方法進一步鑒定。第二輪PCR檢測的特異性試驗結果以第一輪PCR擴增的產物為模板，用EFB2和EFB3為引物進行第二輪PCR擴增，結果如圖2所示，蜂房蜜蜂球菌可見大小為276bp特異性條帶，而屎腸球菌無特異性擴增產物，從而達到有效鑒別的目的。第一輪PCR產物的酶切鑒定用Hinfl酶對蜂房蜜蜂球菌與糞腸球菌第一輪PCR產物進行酶切鑒別，結果如圖3所示，蜂房蜜蜂球菌第一輪PCR產物經Hinfl酶切后理論片段大小為340bp和146bp，而糞腸球菌第一輪PCR產物經Hinfl酶切后理論片段大小為254bp、146bp和86bp三段，因此，可以也通過酶切的方法對這兩種菌第一輪PCR產物進行有效的鑒別。PCR檢測敏感性試驗結果在優化好的PCR反應體系和反應條件下，進行敏感性試驗。從圖4可以看出7號(106模板稀釋度)隱約擴出電泳條帶，8號(107模板稀釋度)則無電泳條帶。因此，所建立的PCR方法檢測的靈敏性可達106的模板稀釋度，相當于最低可以檢出7CFU/ml，所以該PCR方法的檢測敏感度為7CFU/ml。PCR敏感性檢測結果如圖4所示。通過將蜂房蜜蜂球菌(M.pluton)菌液依次作10倍連續梯度稀釋，進行靈敏度試驗，方法檢測限靈敏度可達到約20fg蜂房蜜蜂球菌(M.pluton)DNA，結果見圖5。根據Genebank網站公布的蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病16SrRNA基因序列設計引物EFBl和EFB2進行第一輪PCR擴增，成功擴增出486bp特異性片段，與微孢子蟲病原、蜜蜂幼蟲芽孢桿菌、蜂房蜜蜂球菌、蜜蜂敗血桿菌無交叉反應，但與糞腸球菌有交叉反應，以EFB1和EFB3為引物進行第二輪PCR擴增，可與糞腸球菌鑒別，對第一輪PCR產物用Hinfl限制性酶進行酶切可可與糞腸球菌鑒別。最終達到通過半巢式PCR擴增方法對蜜蜂幼蟲及蜂產品中的蜂房蜜蜂球菌進行特異性檢測的目的。優化出的蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病半巢式PCR方法反應體系。本發明建立的半巢式PCR檢測方法，5h內即可報告檢測結果，特異性較好，敏感性較好，靈敏度可達到約20fg蜂房蜜蜂球菌(M.pluton)DNA。EFB-EuropeanFoulbroodofHoneyBees，蜜蜂歐洲l幼蟲腐臭病。M.pluton:Melissococcuspluton，蜂房蜜蜂球菌。DNA:deoxyribo皿leicacid，脫氧核糖核酸。PCR-polymerasechainreaction,聚合酶鏈式反應。Hemi-nestedPCR:半巢式PCR。bp:basepair，堿基對。16SrRNA:16SribosomalRNA，16S核糖體RNA基因。CTAB:Hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化銨。dATP:deoxyadenosinetriphosphate,脫氧腺苷三磷酸。dTTP:deoxythymidinetriphosphate,脫氧胸苷三磷酸。dCTP:deoxycytidinetriphosphate,脫氧胞苷三磷酸。dGTP;deoxyguanosinetriphosphate,脫氧鳥苷三磷酸。本發明試劑盒成份如下<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>原理以16SrRNA的編碼基因為引物的半巢式PCR技術來鑒定蜂房蜜蜂球菌(Melissococcuspluton，M.pluton)，根據Genebank網站公布的蜜蜂蜂房蜜蜂球菌保守序列，應用DNAman軟件設計出一對引物EFB!、EFB2和EFB3，序列見附表1。通過半巢式PCR技術的改進和引物的改良，達到在蜜蜂幼蟲尚未發病的時候檢測出低含量的芽孢。設計引物EFB1和EFB2進行第一輪PCR擴增，所得PCR理論擴增產物片斷大小為486bp，此步擴增結果可以對蜂房蜜蜂球菌與其它雜菌進行區分，但卻無法對與蜂房蜜蜂球菌親源關系較近的糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)進行區分(此步糞腸球菌PCR擴增片斷大小也為486bp);進而再以所得擴增產物為模板設計第三條引物(EFB3，其位置處于EFB1和EFB2引物中間)，以EFB1和EFB3為引物進行第二輪PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，理論擴增片斷大小為276bp，可以特異性對與蜂房蜜蜂球菌親源關系較近的腸球菌(沒有擴增產物)進行有效區分。最終通過半巢式PCR擴增方法對蜜蜂幼蟲及蜂產品中的蜂房蜜蜂球菌進行特異性檢測。規格[O川]50次。試劑盒組成-20°。以下保存，保存期6個月，可進行50次檢測。適用儀器PCR儀。[one]樣品采集1.樣品的采集和前處理采樣過程中樣本間不得交叉污染，采樣及樣品前處理過程中須戴一次性手套。2.采樣工具棉拭子；剪刀、鑷子；E卯endorf管；研缽。以上取樣工具必須經121°C±2°C，15min高壓滅菌并烘干。3.保存與運送采集或處理的樣品在2°C『C條件下保存應不超過24h，長期保存須在-7(TC以下，但應避免反復凍融(凍融不超過三次)。樣品采集后，將采集的樣品密封并編號，采用保溫壺或泡沫箱加冰密封盡快運送到實驗室。樣品提取蜂房蜜蜂球菌核酸提取，按TaKaRa細菌基因組小量提取試劑盒說明書的方法提取蜂房蜜蜂球菌DNA，_201:凍存或直接進行PCR。試劑準各、加樣和PCR擴增1.加樣PCR反應液須在冰盒中進行配制，配液順序為去離子水(ddH20)、10Xbuffer、dNTP、引物、Taq酶、樣品DNA。以提取的蜂球囊菌DNA為模板，每次反應均設陰性對照。2.第一輪PCR擴增設定好反應參數95。C2min;95。C30s，61。C15s，72。C60s;40循環；72。C5min。3.第二輪PCR擴增以第一輪PCR產物為模板，進行第二輪擴增。設定好反應參數95。C2min;95。C30s，56。C15s，72。C60s;40循環；72。C5min。結果判斷1.第一輪陽性對照的特異性擴增片段為486bp，陰性對照無特異性擴增片段；第二輪陽性對照的特異性擴增片段為276bp，陰性對照無特異性擴增片段；2.第一輪PCR擴增，樣品出現特異性擴增片段為486bp，表明樣品中可能存在蜂房蜜蜂球菌，同時陰性對照無特異性擴增片段，初步判為陽性；第二輪PCR擴增，樣品出現特異性擴增片段為276bp，表明樣品中存在蜂房蜜蜂球菌，同時陰性對照無特異性擴增片段，判為陽性；3.樣品無特異性擴增片段，表明樣品中無蜂房蜜蜂球菌，陰性對照無特異性擴增片段，判為陰性。保存條件及有效期-20°〇避光保存，有一效期為8個月。注意事項1.由于陽性樣品中模板濃度相對較高，檢測過程中不得交叉污染。2.反應液分裝時應避免產生氣泡，上機前檢杳各反應管是否蓋緊，以免陽性模板泄漏污染儀器。3.試劑盒中各溶液使用前應充分融化，混勻冰低速離心。4.融化后的反應液置于冰上，并盡量避免反復凍融。5.退火溫度可根據所用儀器選擇使用最低限量時間。PCR反應引物及循環參數<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>AGTCGGTGAGGTAACCTTAGGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGAT歐洲幼蟲腐臭病EFB1和EFB3擴增序列276bpCTACACACGTGCTACAATGGGAAGTACAGAGAGACGCAAGACCGCGAGGTTAA試劑的配制Allmol/LTris-HCl緩沖液(pH8.0):稱取121.1g三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)，溶于800mL水中，攪拌，加入濃鹽酸42mL，冷卻至室溫，用稀鹽酸準確調節pH至8.0，加水定容至1L，分裝后高壓滅菌備用。A20.5mol/LEDTA(pH8.0):在800mL水中加入186.lg乙二胺四乙酸二鈉(Na廠EDTA2H20)，用磁力攪拌器劇烈攪拌，用氫氧化鈉調節溶液PH值至8.0(約需20g氫氧化鈉顆粒)，然后加水定容至1L，分裝后高壓滅菌備用。A3DNA抽提緩沖液lmol/LTris-HCl100mL0.5mol/LEDTA50mL十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)20.Og氯化鈉81.816g聚乙烯吡咯酮-40(PVP-40)20g加水定容至1L，分裝后高壓滅菌備用。A4CTAB沉淀液CTAB5.0g氯化鈉2.3376g加水溶解定溶至1L，分裝后高壓滅菌備用。A51.2mol/L氯化鈉溶液氯化鈉70.128g加水溶解定溶至1L，分裝后高壓滅菌備用。A6TE緩沖液(Tris-HCl、EDTA緩沖液):lmol/LTris-HCl緩沖液(pH8.0)10mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)2mL加水定容至1L，分裝后高壓滅菌備用。A750XTAE電泳緩沖液Tris484g冰醋酸114.2mL0.5mol/LEDTA200mL溶于水后，定溶至2L，分裝后高壓滅菌備用。序列表〈110〉吉林出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心0184]〈120〉蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病PCR快速檢測方法0185]〈160>10186]〈210>10187]〈211>180188]<212>DNA0189]〈213〉Melissococcuspluton0190]〈400>10191]CTTTGAACGCCTTAGAGA0192]〈110>吉林出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心0193]〈120〉蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病PCR快速檢測方法0194]〈160〉10195]〈210>20196]〈211>180197]〈212>DNA0198]<213>Melissococcuspluton:0199]〈400〉1:0200]CTTTGAACGCCTTAGAGA:0201]〈110〉吉林出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心:0202]〈120〉蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病PCR快速檢測方法:0203]〈160>1:0204]<210>3:0205]〈211〉18:0206]〈212>DNA:0207]〈213>Melissococcuspluton:0208]〈400>1:0209]TTAACCTCGCGGTCTTGCGTCTCTC權利要求一種蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病PCR快速檢測方法，其特征在于a、采用CTAB法或者試劑盒法獲得歐洲幼蟲腐臭病DNA；b、歐洲幼蟲腐臭病DNA的濃度和純度的測定取5μLDNA溶液加雙蒸水稀釋至1mL，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計分別檢測260nm和280nm處的吸光值A260和A280，使A260與A280比值在1.7～2.0之間；c、引物EFB15’-CTTTGAACGCCTTAGAGA-3’EFB25’-ATCATCTGTCCCACCTTA-3’EFB35’-TTAACCTCGCGGTCTTGCGTCTCTC-3’；d、采用半巢式PCR擴增方法，根據蜂房蜜蜂球菌16SrRNA基因，設計引物EFB1和EFB2進行第一輪PCR擴增，所得PCR理論擴增產物片斷大小為486bp，此步擴增結果可以對蜂房蜜蜂球菌與其它雜菌進行區分，但卻無法對與蜂房蜜蜂球菌親源關系較近的糞腸球菌進行區分；進而再以所得擴增產物為模板設計第三條引物EFB3，其位置處于EFB1和EFB2引物中間，以EFB1和EFB3為引物進行第二輪PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，理論擴增片斷大小為276bp，可以特異性對與蜂房蜜蜂球菌親源關系較近的腸球菌進行有效區分；最終通過半巢式PCR擴增方法對蜜蜂幼蟲及蜂產品中的蜂房蜜蜂球菌進行特異性檢測。2.蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病PCR快速檢測試劑盒，其特征在于其成份如下<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>全文摘要一種蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病PCR快速檢測方法，屬于生物領域。本發明目的是建立PCR檢測方法，為蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病診斷、防治、檢疫以及蜂產品病原污染檢測提供快速、準確、簡便的蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病PCR快速檢測方法。本發明具有快速、敏感性高、特異性強等優點，可用于快速診斷歐洲蜂幼蟲腐臭，尤其對多種病原引起的混合感染的鑒別診斷更為有效。本標準的建立的PCR檢測方法，為我國歐洲蜂幼蟲腐臭診斷、防治、檢疫以及蜂產品病原污染檢測提供快速、準確、簡便的檢測方法，以期達到有效控制蜜蜂疾病，提高蜂產品質量具有重要意義。文檔編號C12Q1/68GK101792799SQ201010030840公開日2010年8月4日申請日期2010年1月15日優先權日2010年1月15日發明者劉金華,孟慶峰,宋戰昀,王振國,石建平,羅雁非,肖成蕊,蔡陽申請人:吉林出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心