專利名稱：一種預測冠心病易感性的方法及其試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種預測冠心病(coronary artery disease, CAD)易感性的方法，具體說是通過測定人二甲基精氨酸二甲胺水解酶I(DDAHl)基因多態性位點-396D/I來預測人群對于冠心病的易感性，該方法可以用于疾病的輔助診斷、治療、和新藥研發，屬于醫學生物技術和基因診斷領域。
背景技術：
近年來，冠心病在我國的發病率和死亡率呈迅速上升趨勢，已經成為我國居民死因構成中上升最快并威脅我國公眾健康的重要疾病。傳統的危險因素如高血壓，糖尿病，超重與肥胖，吸煙與飲酒，高脂血癥等能致動脈粥樣硬化，但很多冠心病患者并無上述危險因素存在或者在上述危險因素控制較好的情況下仍然有心血管事件發生，這表明遺傳因素和 (或)環境因素可能參與了心血管事件的發生。從事心血管領域的研究人員都熟知血管壁內皮功能紊亂引起動脈粥樣硬化 (atherosclerosis, AS)是多種心腦血管疾病病理生理基礎，一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS )催化L-精氨酸轉化成一氧化氮(nitric oxide, N0)，是內皮細胞合成的一種重要的血管活性因子，具有舒張血管、抑制血小板聚集、抑制單核細胞粘附、抑制平滑肌細胞增殖、減少氧自由基產生及抑制低密度脂蛋白氧化等多種生理效應。ADMA能與L-精氨酸競爭性結合一氧化氮合酶(N0Q，抑制其活性，減少一氧化氮(NO)合成，降低NO的生理效應。ADMA代謝可通過二甲基精氨酸二甲胺水解酶(dimethyIarginine dimethylaminohydrolase, DDAH)水解。DDAH 分兩型DDAH1 和 DDAH2。DDAHl 主要分布于 nNOS表達占優勢的組織中，據推測在許多組織中DDAHl是調節血漿ADMA濃度的關鍵酶，如果其功能受損導致ADMA聚集，NO產生減少，會引起血管內皮受損，體循環血管阻力增加，肺動脈高壓等多種病理狀態的發生，增加心腦血管事件發生的危險性。DDAHl具有重要的生物學效應，其基因的遺傳變異會影響DDAHl的表達，結構和功能改變，使個體對心腦血管疾病如冠心病的易感性發生改變。其中位于DDAHl基因啟動子區-396位四個核苷酸(GCGT)插入的I/I基因型和沒有四核苷酸插入的D/D基因型對該基因轉錄有很大的差別，從而能對冠心病的易感性產生不同的影響。通過實驗我們首次發現并證明我國漢族人在冠心病形成組中的I/I基因型頻率較正常人高，對冠心病有致病效應，在校正多重心腦血管危險因子后，DDAHl I/I基因型是冠心病的一個獨立危險因素。目前進行冠心病的遺傳病因研究中，一般采用單核苷酸多態性(SNP)作為基因組標志的關聯分析方法是有效的，但傳統的PCR-酶切分析SNP的方法存在時間長、可重復性差、靈敏度低、準確率低等問題。
發明內容
本發明的第一個目的是針對現有技術的不足，提供一種Taqman探針法進行基因分型，通過非條件logistic回歸模型來準確預測冠心病易感性的方法。本發明的第二個目的是提供一種預測冠心病易感性的試劑盒。為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案一種預測冠心病易感性的方法，該方法通過提取人的外周血白細胞基因組DNA，測定受試者的DDAHl基因-396位點的基因型，通過非條件logistic回歸模型來預測受試者對冠心病的易感性。具體步驟1.提取人外周血白細胞的基因組DNA ;2.對于受試者個體中DDAHl基因多態性位點-396D/I，即序列表SEQ ID 1所示，通過序列表SEQ ID 2和3所示的F和R寡核苷酸引物序列，特異性地從上述DNA中擴增出來，并通過序列表SEQ ID 4和 5所示的Taqman探針堿基序列來實現對DDAHl基因-396位點不同的基因型的檢測；3.將受試者個體的DDAHl基因-396位點的1/1，D/I和D/D基因型引入非條件Logistic回歸分析模型中來預測冠心病的發病易感性。本發明證明，受試者攜帶DDAHl的-396I/I基因型時，冠心病易感性升高，對冠心病有致病作用。一組預測冠心病易感性的引物和探針序列(寡核苷酸序列)，能特異性的擴增出 DDAHl基因的-396位點的擴增產物，具有序列表SEQ ID 1所示的堿基序列，其中序列表SEQ ID 2和3所示的堿基序列分別為F引物序列和R引物序列；序列表SEQ ID 4和5所示為 Taqman探針混合物，以上寡核苷酸序列在一次檢測中同時使用。一種預測冠心病易感性的試劑盒，由以下試劑組成400 μ 1 2XMaster Mix 緩沖液，600μ 1 超純水，各2μ 1 100 μ M/L 的探針混合物， 各9 μ 1100 μ M/L的F和R引物混合物，F和R引物是序列表SEQ ID 2和3所示的堿基序列；taqman探針混合物是序列表SEQ ID 4和5所示的堿基序列及修飾基團；試劑盒的保存溫度為-20度。所述的iTaqman 探針序列 5，端用 FAM(6-carboxyfluorescein)或 ΗΕΧ0，7，2'， 4'，5'，7' -hexachloro-6-carboxyfluorescein)熒光染料修飾，3，用 BHQl (Black HoleQuencher 1)淬滅基團修飾。本發明具有以下優點首次闡明了 DDAHl基因多態性位點和冠心病易感性的關聯，提供了一種預測冠心病易感性的方法，該方法可用于冠心病的預防/輔助診斷和治療， 還可以用于新藥研發。本發明所采用Taqman探針技術實現對多態性位點的檢測，通過不同堿基組成的探針Tm值差異，利用探針特異性結合于多態性位點不同的基因型，來實現對不同基因型的檢測。該方法操作簡便，結果穩定，省時省力，靈敏度和特異度高。
圖1為基因分型檢測結果三種不同基因型在坐標軸中位于不同的位置，其中沿圖y軸分布為型I/I純合子，沿圖X軸分布為D/D型純合子，位于中間分布為D/I型雜合子。下面結合具體實施方式
對本發明作進一步說明，并非對發明的限定，依照本領域公知的現有技術，本發明的實施方式并不限于此，因此凡依照本公開內容所作出的本領域的等同替換，均屬于本發明的保護范圍。
具體實施例方式實施例1制備檢測冠心病易感性的試劑盒一、試劑盒成分檢測冠心病易感性的試劑盒，包含有可擴增出DDAHl基因-396D/I啟動子區的基因型的引物對，及其Taqman探針，成分和含量如下，于_20度保存表1 :PCR擴增試劑QOO人份)
權利要求
1.一種預測冠心病易感性的方法，具體步驟是a.提取人外周血白細胞的基因組DNA；b.對于受試者個體中DDAHl基因多態性位點-396D/I，即序列表SEQ ID 1所示，通過序列表SEQ ID 2和3所示的F和R寡核苷酸引物序列，特異性地從上述DNA中擴增出來， 并通過序列表SEQ ID 4和5所示的Taqman探針堿基序列來實現對DDAHl基因-396位點不同的基因型的檢測；c.將受試者個體的DDAHl基因-396位點的I/I，D/I和D/D基因型引入非條件 Logistic回歸分析模型中來預測冠心病的發病易感性。
2.一種用于制備測定權利要求1預測冠心病易感性方法的試劑盒，其特征在于由以下試劑組成400μ1 2 X Master Mix緩沖液，600 μ 1超純水，各2 μ 1 100 μ M/L的探針混合物，各9 μ 1100 μ M/L的F和R引物混合物，F和R引物是序列表SEQ ID 2和3所示的堿基序列；Taqman探針混合物是序列表SEQ ID 4和5所示的堿基序列及修飾基團；試劑盒的保存溫度為-20度。
全文摘要
本發明提供一種預測冠心病易感性的方法及其試劑盒，該方法具體步驟1.提取人外周血白細胞的基因組DNA；2.對于受試者個體中DDAH1基因多態性位點-396D/I，即序列表SEQ ID 1所示，通過序列表SEQ ID 2和3所示的F和R寡核苷酸引物序列，特異性地從上述DNA中擴增出來，并通過序列表SEQ ID 4和5所示的Taqman探針堿基序列來實現對DDAH1基因-396位點不同的基因型的檢測；3.將受試者個體的DDAH1基因-396位點的I/I，D/I和D/D基因型引入非條件Logistic回歸分析模型中來預測冠心病的發病易感性。本發明利用探針特異性結合于多態性位點不同的基因型，來實現對不同基因型的檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102154445SQ201010114268
公開日2011年8月17日 申請日期2010年2月10日 優先權日2010年2月10日
發明者丁虎, 吳斌, 汪道文 申請人:華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院