檢測含有篩選基因CaMV35S的轉基因植物及產品的基因芯片及其應用的制作方法

專利名稱：檢測含有篩選基因CaMV35S的轉基因植物及產品的基因芯片及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測含有篩選基因CaMV35S的轉基因植物及產品的基因芯片及 其應用，屬于生物芯片技術領域。
背景技術：
近年來，玉米、大豆、棉花、油菜和番茄等轉基因作物已在很多國家獲得批準種植 和生產，有的被加工成食品、飼料或用做食物添加劑。由于轉基因產品的生態安全和食用安 全一直備受爭議，40多個國家和地區相繼實施轉基因產品標識制度。各國轉基因標識制度的相繼建立，對轉基因檢測技術的靈敏度和準確性提出了嚴 格的要求，各種轉基因檢測技術也成為研究熱點。常用的轉基因檢測方法有聚合酶鏈式反 應(PCR)法，外源蛋白檢測法，基因芯片檢測技術。雖然國外對轉基因作物檢測方法研究已 有十幾年，但由于轉基因作物的種類多、數量大，一些轉基因產品經過深加工、各種條件處 理與保存后，轉基因成分部分或完全降解，所以檢測難度大。因此，需要根據科學技術的發 展不斷更新檢測方法。但不容樂觀的是，設計PCR反應引物是一個棘手的問題，必須確保反應中兩條引 物有相近的熔接溫度，引物之間不會發生相互作用，另外還要注意非特異性擴增，特別是當 非特異性擴增帶與目的帶相近時，就會出現假陽性問題，從而干擾結果的判斷。隨著GMO檢 測技術的發展情況及研究趨勢，基因芯片技術在此展示了更大的優勢。基因芯片檢測原理 是利用帶有熒光標記的樣品同探針特異雜交，從而產生陽性信號。因而非目的帶的擴增只 要不產生陽性信號，就不會干擾，而且芯片檢測不依據電泳條帶。并且基因芯片可根據任 何已知基因組序列設計特異性探針，以人工合成的方法快速制備芯片，且高度并行性、高通 量、微型化、自動化、高準確度和靈敏度等優點具有廣泛的應用前景。經對現有專利和其他文獻的檢索，尚未發現關于CaMV35S基因的基因芯片檢測技 術的專利報道。

發明內容
針對上述現有技術的不足和實際檢測的需要，本發明提供了一種能夠特異性地檢 測含篩選基因CaMV35S的轉基因植物及產品的基因芯片及其應用。本發明是通過以下技術方案實現的一種檢測含篩選基因CaMV35S的轉基因植物及產品的基因芯片，包括表面醛基 化修飾的載玻片和陣列涂布于其上的篩選基因CaMV35S探針以及核酸固定的陽性對照 (HEX)、雜交陽性對照(PC)、陽性質控探針(18S rRNA)、陰性質控探針、空白對照；其中，所述陽性對照和雜交陽性對照均為北京博奧生物技術有限公司的產品， 晶芯 核酸固定陽性對照(HEX)產品號為502000，晶芯 雜交陽性對照(PC)產品號為 503000。
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所述陽性質控探針為18S rRNA，其探針序列為NH2-(CH2)6-O-Poly(ClT) 15-ATGGTGGTGACGGGTGACGGAGAATTAGGGTTCGATTCCG ；所述陰性質控探針為SHDC-人類表達特異蛋白基因，其探針序列為NH2-(CH2)6-O-Poly(ClT) 15-ATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCC ；所述陽性質控探針和陰性質控探針序列均來源于許小丹，文思遠等(檢測及鑒定 轉基因大豆寡核苷酸芯片的制備.農業生物技術學報，2005，13 (4) 429-434)的報道；所述空白對照為點樣液為雙蒸水；所述的篩選基因CaMV35S探針序列為NH2- (CH2) 6-0-Poly(dT)15-CTATCGTTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGA。所述芯片的陣列布局為人為規定，可以任意布局，比如圖1所示的布局。所述載玻片上還可以涂布有探針對照，探針對照包括轉基因玉米Btl76轉化體特 異性探針、轉基因玉米Btll轉化體特異性探針、轉基因玉米TC1507轉化體特異性探針、轉 基因玉米MonSlO轉化體特異性探針和轉基因玉米GA21轉化體特異性探針。所述轉基因玉米Btl76轉化體特異性探針序列為NH2- (CH2) 6-0-Poly (dT) 15-TGCCCGTCACCGAGATCTGATGTTCTCTCCTCCATTGATG。所述轉基因玉米Btll轉化體特異性探針的序列為NH2- (CH2) 6-0-Poly (dT) 15-TGTATCCGCTCATGGAGGGATTCTTGGATTTTTGGTGGAG。所述轉基因玉米TC1507轉化體特異性探針的序列為NH2- (CH2) 6-0-Poly (dT) 15-GCGGAACACAAGAACGAAAGCACCTTTTCATTCTTTCATA。所述轉基因玉米MonSlO轉化體特異性探針的序列為NH2- (CH2) 6-0-Poly(dT)15-ACCTGAACGAGGACTTTCGGTAGCCTTCTTTCATTTCCGA。所述轉基因玉米GA21轉化體特異性探針的序列為NH2-(CH2) 6-0-Poly (dT)15-ATACTAACTCATATCTCTTTCTCAACAGCAGGTGGGTCCG。上述的GA21、BtlU Btl76、TC1507、和Mon810的特異性探針對照均來源于路興 波，武海斌等(轉基因玉米轉化體特異性寡核苷酸芯片檢測方法的研制.作物學報，2009， 35(8) 1432-1438)的報道。所述陽性對照、雜交陽性對照、陽性質控探針、陰性質控探針、空白對照、探針對照 的點樣濃度均為25ymol/L。所述篩選基因CaMV35S探針的點樣濃度為25 μ mol/L。本發明的基因芯片的的應用方法為提取待測植物或待測產品的基因組DNA，然 后在二重熒光PCR反應體系中擴增，然后取PCR產物，與雜交液混勻后，于PCR儀中95°C熱 變性lOmin，冰浴驟冷后加樣于芯片上的點樣區，蓋玻片封片；42°C水浴雜交2h ；雜交后，芯 片分別在42°C的洗液I和洗液II中各清洗4min，500r/min離心甩干，用晶芯 LuxScanTM IOK激光共聚焦掃描儀進行掃描，波長532nm ；PMT為850 V, Power為90 V，產生分析精度為10 μ m的16位TIFF圖像；用LuxScan3. 0軟件進行數據采集和圖像分析，分析掃描圖像 的熒光強度值以確定待測植物是否含有CaMV35S基因；所述雜交液包括3XSSC，0.2% SDS，25% 甲酰胺，5XDenhart，s，33nmol/L PC 雜 交陽性對照樣品；所述洗液I 包括:2XSSC,0. 1 XSDS ；所述洗液II 為 0. 2XSSC。所述熒光染料為Cy3_Amidite。本發明的芯片的制備原理是以含有CaMV35S的轉基因玉米Btll為陽性對照材 料，以轉基因玉米GA21、Btl76和MIR604，轉基因大豆GTS40-3-2、非轉基因玉米鄭單958、 非轉基因大豆1138-2、非轉基因棉花中49等作為對照，根據CaMV35S序列，利用Primer premierf. 0引物設計軟件設計特異性引物，并對引物進行篩選和優化。熒光標記引物在 5，端用Cy3-Amidite進行熒光標記。利用Primer premier 5. 0和Oligo 6. 0軟件設計 40mer 01igoCaMV35S備選探針，探針在5’端以氨基己烷修飾，氨基和探針序列之間以間隔 臂poly(dT15)相連，使最終探針長度為55bp。可以利用本發明設計的基因芯片對含有篩選基因CaMV35S的轉基因植物及其產 品進行特異性檢測。本發明的檢測含篩選基因CaMV35S的轉基因植物及產品的基因芯片，具有很好的 特異性，靈敏度高，為含篩選基因CaMV35S的轉基因植物及產品的檢測分析提供了基于簡 單、可靠的測定方法，可以用于轉基因植物及其產品的檢測。本發明為轉基因標識提供了一 種有用的參考，為轉基因產品的控制提供了必要的手段，可以滿足我國在進出口檢驗、種子 市場抽檢、轉基因作物監控監測等方面的檢測需求，提高我國轉基因生物的監管水平。


圖1為本發明的基因芯片陣列分布圖；其中al a5_核酸固定的陽性對照(HEX)，a6 al0、b6 bl0、c6 cl0、dl d5、d6 dl0、el e5、e6 elO-空白對照(點樣液)；bl b5_雜交陽性對照(PC) ；cl c5-CaMV35S 探針；f 1 f5，g6 glO-陽性質控探針(18S rRNA) ；f6 f 10，gl g5-陰 性質控探針(SHDC-人類表達特異蛋白基因)；圖2為本發明的實施例1中的基因芯片陣列分布圖；其中，Al A5-核酸固定的陽性對照(HEX) ；A6 A10，B6 BlO-空白對照 (點樣液)；Bl B5-雜交陽性對照(PC) ；Cl C5-CaMV35S探針；C6 C10-GA21 ；Dl D5-TC1507 ；D6 D10_Mon810 ；El E5_Btll ；E6 E10_Btl76 ；Fl F5, G6 GlO-陽性 質控探針(ISSrRNA) ；F6 F10，G1 G5-陰性質控探針(SHDC-人類表達特異蛋白基因)。圖3為篩選基因CaMV35S特異性PCR檢測示意圖； 其中M-分子量Marker ； 1-陰性對照DNA模板；2_陽性對照DNA模板；3_非轉基 因玉米鄭單958基因組DNA模板；4-非轉基因大豆1138-2基因組DNA模板；5-非轉基因棉 花中49基因組DNA模板；6-轉基因玉米Btl76基因組DNA模板；7-轉基因玉米GA21基因 組DNA模板；8-轉基因玉米MIR604基因組DNA模板；9-轉基因大豆GTS40-3-2基因組DNA 模板；10-空白對照。
圖4 (a)為篩選基因CaMV35S特異性芯片雜交信號圖；圖4(b)為非轉基因植物及其產品的芯片雜交信號圖(為圖4(a)的對照)。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明實施例1 1、引物和探針的設計引物在5’端用Cy3-Amidite進行熒光標記。引物由上海博亞生物公司合成，引物 稀釋成ΙΟμπιοΙ/L備用。利用Primer premier 5· 0 和 Oligo 6· 0 軟件根據 CaMV35S 的序列設計 40mer Oligo備選探針，設計一般原則為(1)具有較相近的TM值，上下波動范圍為5°C ； (2) GC含 量為45% 55%之間，否則將增加非特異性雜交背景；(3)重復的單一堿基連續不超過4 個；(4)探針分子最穩定二級結構配對堿基長度不大于4bp。探針在5’端以氨基己烷修飾， 氨基和探針序列之間以間隔臂poly(dT15)相連，使最終探針長度為55bp。所有探針在上海 博亞生物公司合成。2、芯片制備將探針溶解在芯片點樣液中，稀釋成25 μ mol/L,取20 μ L轉移到384孔板，用博奧 生物芯片有限公司晶芯 SmartArrayerTM-16芯片點樣儀點樣。先預點40點后再點至醛基 化玻片上，點間距為350 μ m,點樣后的芯片進行處理備用。每種樣品點樣重復5次，并同時 點有核酸固定的陽性對照(HEX)，雜交陽性對照(PC)，陽性質控探針(18S rRNA)，陰性質控 探針(SHDC-人類表達特異蛋白基因)，空白對照(點樣液)，探針對照。以保證信號的重復 性及穩定性。圖2為本實施例所制備芯片陣列示意圖，除包括篩選基因CaMV35S的特異性 探針外，還包括GA21、Bt 176、Bt 11、Mon810、及TCl507的特異性探針。3、應用方法1)應用特異性引物序列進行篩選基因CaMV35S特異性定性PCR檢測方法所引用的引物序列如下(NY/T 675-2003)CaMV35S-F 5' GCT CCT ACA AAT GCC ATC ATT GC 3'CaMV35S-R 5' GAT AGT GGG ATT GTG CGT CAT CCC 3，。用博日Biospin植物基因組DNA提取試劑盒，分別取轉基因玉米Btll、MIR604和 GA21等轉基因玉米，轉基因大豆GTS40-3-2、非轉基因玉米鄭單958、非轉基因大豆1138-2、 非轉基因棉花中49的基因組DNA為模板，應用引物進行PCR擴增。在20 μ L反應體系中 以IOOng不同來源的基因組DNA為模板，其他各組分終濃度為，PCR Buffer 2X (含有IU Taq DNA 聚合酶，IOmM Tris-HCl, pH 8. 3,50mM KCl, 1. 5mM MgCl2, 250 μ M dNTPs)，引物各 為0. 5 μ Μ。反應條件為，95°C 5min預變性，95°C 30秒，58°C 30秒，72°C 30秒，循環35次， 72°C保溫2分鐘。PCR產物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴增產物。2)利用本發明中所設計的特異性探針序列進行轉基因植物及其產品篩選基因 CaMV35S特異性基因芯片檢測方法所述的篩選基因CaMV35S探針序列為NH2- (CH2) 6-0-Poly(dT)15-CTATCGTTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCCAAAGA。
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GA21、BtlU Mon810、TC1507和Btl76的特異性探針均來源于路興波，武海斌 等(轉基因玉米轉化體特異性寡核苷酸芯片檢測方法的研制.作物學報，2009，35 (8) 1432-1438)的報道，屬公知技術，在此不再贅述。在30 μ L 二重熒光PCR反應體系中以IOOng待測植物的基因組DNA為模板，其 他各組分終濃度為，PCR Buffer 2X(含有 IU Taq DNA 聚合酶，IOmM Tris-HCl, pH 8.3， 50mM KCl, 1. 5mM MgCl2, 250 μ M dNTPs)，0. 4 μ M 上下游玉米引物，0. 04 μ M 的 18S rRNA 的 上下游引物。反應條件為，95°C 5min預變性，95°C 30秒，58°C 30秒，72°C 30秒，循環35 次，72°C保溫5分鐘。取7yL PCR產物與8μ L雜交液(3XSSC，0. 2% SDS，25%甲酰胺， 5 XDenhart's, 33nmol/L PC雜交陽性對照樣品)混勻后，于PCR儀中95°C熱變性lOmin，冰 浴驟冷后加樣于芯片上的點樣區，蓋玻片封片。42°C水浴雜交2h。雜交后，芯片分別在42°C 的洗液I(2XSSC，0. IX SDS)和洗液11(0. 2 X SSC)中各清洗4min，500r/min離心甩干，用 晶芯 LuxScanTM IOK激光共聚焦掃描儀進行掃描(波長532nm)。PMT為850 V,Power為 90 V，產生分析精度為10 μ m的16位TIFF圖像。用LuxScan3. 0軟件進行數據采集和圖像 分析。所有的反應都重復3次。以非轉基因玉米的基因組DNA作為對照。3、實驗結果1)應用特異性引物序列進行篩選基因CaMV35S特異性定性PCR檢測方法應用引物以提取的基因組為模板進行PCR擴增，結果如圖3所示。由圖可見，只有 陽性對照，含有篩選基因CaMV35S的Btl76和GTS40-3-2基因組成功擴增出特異性195bp PCR產物，而其他轉基因和非轉基因樣品做模板時都沒有擴增產物可觀察到。2)利用本發明中所設計的特異性探針序列進行篩選基因CaMV35S特異性基因芯 片檢測方法針對外源基因與玉米基因組連接區域設計相應的探針，利用二重熒光PCR產物與 芯片雜交，經反復對雜交溫度、雜交時間等條件的優化，驗證是否產生預期的有效信號。并 且無其他探針產生非特異性信號來說明探針的特異性。結果如圖4(a)、(b)所示。探針特 異性檢驗結果表明，針對轉化體特異性基因所設計的探針符合預期設計的目的，核酸固定 的陽性對照(HEX)，雜交陽性對照(PC)，陽性質控探針(18S rRNA)和篩選基因CaMV35S特 異性相應探針點樣位置均有陽性信號，而陰性質控探針(SHDC-人類表達特異蛋白基因)， 空白對照(點樣液)及其他轉基因玉米探針對照均無陽性信號出現，說明所設計的探針具 有很好的特異性，所建立的芯片檢測平臺是可靠的。以上結果可以看出，本發明為轉基因植物及其產品篩選基因CaMV35S特異性基因 芯片檢測分析提供了基于簡單、可靠的測定方法，可以用于轉基因植物及其產品篩選基因 CaMV35S的檢測。本發明為轉基因標識提供了一種有用的參考，為轉基因產品的控制提供了 必要的手段。
權利要求
一種檢測含篩選基因CaMV35S的轉基因植物及產品的基因芯片，其特征在于包括表面醛基化修飾的載玻片和陣列涂布于其上的篩選基因CaMV35S探針以及核酸固定的陽性對照、雜交陽性對照、陽性質控探針、陰性質控探針、空白對照；其中，所述陽性質控探針為18S rRNA，其探針序列為NH2 (CH2)6 O Poly(dT)15 ATGGTGGTGACGGGTGACGGAGAATTAGGGTTCGATTCCG；所述陰性質控探針為SHDC 人類表達特異蛋白基因，其探針序列為NH2 (CH2)6 O Poly(dT)15 ATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCC；所述空白對照為點樣液為雙蒸水；所述的篩選基因CaMV35S探針序列為NH2 (CH2)6 O Poly(dT)15 CTATCGTTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGA。
2.根據權利要求1所述的檢測含篩選基因CaMV35S的轉基因植物及產品的基因芯片， 其特征在于所述載玻片上還涂布有探針對照，探針對照包括轉基因玉米Btl76轉化體特 異性探針、轉基因玉米Btll轉化體特異性探針、轉基因玉米TC1507轉化體特異性探針、轉 基因玉米MonSlO轉化體特異性探針和轉基因玉米GA21轉化體特異性探針。
3.根據權利要求1或2所述的檢測含篩選基因CaMV35S的轉基因植物及產品的基因 芯片，其特征在于所述陽性對照、雜交陽性對照、陽性質控探針、陰性質控探針、空白對照、 探針對照的點樣濃度均為25 4!1101/1;所述篩選基因0^￥353特異性探針的點樣濃度為 25 μ mol/L。
4.權利要求1所述的檢測含篩選基因CaMV35S的轉基因植物及產品的基因芯片在特異 性檢測含篩選基因CaMV35S的轉基因植物及其產品中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述芯片應用的方法是提取待測植物或 待測產品的基因組DNA，然后在二重熒光PCR反應體系中擴增，然后取PCR產物，與雜交液混 勻后，于PCR儀中95°C熱變性lOmin，冰浴驟冷后加樣于芯片上的點樣區，蓋玻片封片；42°C 水浴雜交2h ；雜交后，芯片分別在42°C的洗液I和洗液II中各清洗4min，500r/min離心甩 干，用晶芯 LuxScanTM IOK激光共聚焦掃描儀進行掃描，波長532nm ；PMT為850 V，Power 為90 V，產生分析精度為10 μ m的16位TIFF圖像；用LUXScan3. 0軟件進行數據采集和 圖像分析，分析掃描圖像的熒光強度值以確定待測植物是否含有篩選基因CaMV35S ；所述 雜交液包括:3XSSC,0. 2% SDS，25%甲酰胺，5XDenhart，s，33nmol/L PC雜交陽性對照樣品；所述洗液I包括:2XSSC,0. IXSDS ； 所述洗液II為0. 2XSSC。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于所述熒光染料為Cy3-Amidite。
全文摘要
本發明公開了檢測含篩選基因CaMV35S的轉基因植物及產品的基因芯片，包括表面醛基化修飾的載玻片和陣列涂布于其上的篩選基因CaMV35S探針以及核酸固定的陽性對照(HEX)、雜交陽性對照(PC)、陽性質控探針(18S rRNA)、陰性質控探針、空白對照；所述的篩選基因CaMV35S探針序列為NH2-(CH2)6-O-Poly(dT)15-CTATCGTTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGA。本發明的檢測含篩選基因CaMV35S的轉基因植物及產品的基因芯片，具有很好的特異性，靈敏度高，為含篩選基因CaMV35S的轉基因植物及產品的檢測分析提供了基于簡單、可靠的測定方法，可以用于轉基因植物及其產品的檢測。
文檔編號C12Q1/68GK101935694SQ20101012370
公開日2011年1月5日 申請日期2010年3月15日 優先權日2010年3月15日
發明者孫紅煒, 李凡, 武海斌, 路興波, 韓偉 申請人:山東省農業科學院植物保護研究所