專利名稱：一株具有雙重噬菌體抗性的l-苯丙氨酸生產菌及其選育方法
技術領域：
本發明涉及一種具有雙重噬菌體抗性的微生物及其選育方法，屬于生物工程技 術領域。
背景技術：
噬菌體污染是影響氨基酸發酵生產的關鍵因素之一。如果在生產中受到噬菌體 的污染，會影響生產率，從而影響企業效益。其來源很多，在相對較長的發酵周期中， 無論哪個環節發生污染，都會對整個過程造成影響。多年來，企業在噬菌體在生產過程 對噬菌體的防治上積累了大量的經驗，但選育抗噬菌體的生產菌株才是最有效的方法。本實驗室前期開發了 一株L-苯丙氨酸生產菌WSH-BR42 (CCTCC M 2010008)， 該菌株具有噬菌體BP-1(CCTCC M 2010054)抗性，但在實際生產中發現該菌種又受到了 噬菌體 BP_2(CCTCC M 2010055)的污染。利用誘變手段篩選抗噬菌體的菌株是選育抗性菌株的方法之一。由于現在所知 的誘變方法已有很多，其對機理方面的要求也不高，人們在對誘變方法的選用上已有了 很多的經驗。但往往用誘變手段選育菌種具有一定的盲目性，是一件耗時耗力的工作。 在篩選抗噬菌體抗性的大腸桿菌方面，本發明提出在誘變后培養階段利用噬菌體淘汰培 養的方法，就如何快速有效的獲得目的菌株而言提供了一條新的途徑。
發明內容
本發明所要解決的一個技術問題是提供一株重組大腸桿菌WSH-BR165 (pAP-B03)，該菌株具有對重組大腸桿菌易感染噬菌體BP-I (CCTCC M 2010054,
保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期2010年3月15日，地址中國武漢，武 漢大學，分類學命名為大腸桿菌噬菌體QBacteiiopMge))和BP-2的(CCTCC M 2010055，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期2010年3月15日，地址中國 武漢，武漢大學，分類學命名為大腸桿菌噬菌體(^ac—opMge))雙重抗性；含有 重組質粒，質粒上攜帶L-苯丙氨酸合成酶基因，現已保藏于中國典型培養物保藏中心， 保藏時間2010年1月18日，地址中國武漢，武漢大學，分類學命名為大腸桿菌 {Escherichia coli)，保藏編號為 CCTCC M 2010013。所述噬菌體BP-I來源于本實驗室前期開發的L-苯丙氨酸生產菌WSH_ZH06(含 重組質粒pAP_B03，CCTCC M 2010009)受到噬菌體污染的裂解液，噬菌體BP-I已 保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏時間2010年3月15日，保藏編號為CCTCCM 2010054 ；噬菌體BP-2來源于本實驗室開發的L-苯丙氨酸生產菌WSH-BR42 (含重組 質粒pAP_B03，CCTCCM 2010008)受到噬菌體污染的裂解液，WSH-BR42具有噬菌體 BP-I的抗性，但不具有噬菌體BP-2的抗性，噬菌體BP-2已保藏于中國典型培養物保藏 中心，保藏時間2010年3月15日，保藏編號為CCTCC M 2010055。
所述重組質粒為pAP_B03，其上攜帶L-苯丙氨酸合成的關鍵酶CM/PDT和 DS的基因PheAfbInaroF,其中pheA^基因來源于E.coli K12的突變株，aroF來源于 E.coli K12 (Enhanced L-phenylalanine biosynthesis by co-expression of pheAftr and aroFwt. HaiyanZhou，Xianyan Liao，Tianwen Wang, Guocheng Du，Jian Chen.Bioresource Technology)。本發明所要解決的另外一個技術問題是提供了一種紫外線誘變育種、噬菌體淘 汰培養以及分子生物學改造相結合的L-苯丙氨酸生產菌的選育方法。為解決上述技術問題，對容易受到噬菌體污染的WSH-Z06的宿主菌 (EnhancedL-phenylalanine biosynthesis by co-expression of pheAftr and aroFwt.Haiyan Zhou, XianyanLiao, Tianwen Wang, Guocheng Du，Jian Chen.Bioresource Technology)分另ll進 亍 紫外線誘變處理、噬菌體淘汰培養，篩選到一株具有BP-I和ΒΡ-2雙重抗性的大腸桿菌 宿主菌，隨后用編碼L-苯丙氨酸合成酶基因的質粒(ρΑΡ-Β03)轉化上述大腸桿菌宿主 菌，得到具有雙重噬菌體抗性的L-苯丙氨酸生產菌WSH-BR165 (ρΑΡ-Β03)。所述紫外線誘變處理，具體方法為培養WSH-Z06的宿主菌，離心、洗滌菌體后 在紫外照射10-60s進行誘變處理。所述噬菌體淘汰培養，具體方法為在紫外線誘變處理后，紅燈下在培養皿中分 別吸取一定含量菌液于裝有30mL LB培養基和各ImL效價為liTpfu/mL的噬菌體BP-I 和BP-2裂解液的三角瓶中培養6h，使得誘變后不具有噬菌體抗性的菌被淘汰，具有雙重 噬菌體抗性的菌得到富集。所述噬菌體抗性篩選，具體方法為離心、收集、培養誘變后的菌體，挑取形 態、大小、顏色各不相同的菌落逐一涂布單層平板，然后在平板的4個象限處分別各滴 加5 μ L噬菌體BP-I和ΒΡ-2的裂解液，做好標記，培養24h后，挑取在4處滴加噬菌體 的地方均沒有出現噬菌斑的菌株。所述噬菌體裂解液BP-1，取樣于受噬菌體污染的WSH-Z06(pAP_B03)發酵 液，經過分離、培養后獲得，具體方法為發酵液離心后的上清液經0.22μιη微孔濾 膜過濾除菌，取出一定上清液放入裝有肉膏蛋白胨培養基的試管中，同時加入一定量的 WSH-Z06(pAP_B03)菌懸液，培養一段時間，待長出單個噬菌斑后，用接種針穿刺法挑 取形態、大小不一的單個空斑分別接入含有敏感菌WSH-Z06的液體培養基中，37°C振蕩 培養 16-24h。所述噬菌體裂解液BP-2，取樣于受噬菌體污染的WSH-BR42(pAP_B03)發酵 液，經過分離、培養后獲得，具體方法為發酵液離心后的上清液經0.22 μ m微孔濾膜 過濾除菌，取出一定上清液放入裝有肉膏蛋白胨培養基的試管中，同時加入一定量的 WSH-BR42 (pAP-B03)菌懸液，培養一段時間，待長出單個噬菌斑后，用接種針穿刺法 挑取形態、大小不一的單個空斑分別接入含有敏感菌WSH-Z06的液體培養基中，37°C振 蕩培養16-24h。所述噬菌體抗性檢測培養基，采用肉膏蛋白胨培養基(牛肉膏5g/L，蛋白胨 10g/L，葡萄糖 10g/L，NaCl 5g/L)，pH 7.0-7.2，瓊脂 2%。所述抗噬菌體L-苯丙氨酸生產菌，其優選培養基組成為(1)種子培養基
使用LB培養基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)，pH 7.0,固體培
養基加2%的瓊脂。(2)發酵培養基(g/L)葡萄糖25，L-酪氨酸0.4，碳酸鈣12.5，七水合硫酸鎂3.0，二水合氯化鈣 0.015，磷酸二氫鉀3.0，氯化鈉1.0，硫酸銨5.0，七水合硫酸亞鐵0.075，檸檬酸鈉1.0， 硫胺素(thiamine · HCl) 0.075,硫酸卡那霉素0.04，微量元素溶液(TES) 1.5mL/L，pH 7.0。TES 溶液(g/L) Al2 (SO4) 3 · 18H20 2.0, CoSO4 · 7H20 0.75, CuSO4 · 5H20 2.5，H3BO30.5，MnSO4 · H2O 24，Na2MoO4 · 2H20 3.0，NiSO4 · 6H20 2.5， ZnSO4 · 7H20 15，用 IN 的 HCl 溶解。所述抗噬菌體L-苯丙氨酸生產菌，其發酵罐培養方法為將37°C、200rpm下培養12h的種子以10%的接種量分別接入3L發酵罐中，發 酵培養基體積為1.5L，通氣量為lvvm，攪拌轉速為400rpm，待DO降至20%，通過調節 攪拌轉速和通氣量維持DO在20%以上；溫度設定在33°C，菌體濃度達到OD61tl = 3時， 升溫至37°C，用28%氨水控制pH在7.0左右，使用流加700g/L的葡萄糖溶液的方式維 持培養基中殘余葡萄糖濃度在5g/L左右。細胞干重(DCW)的測定方法為取一定量的菌懸液置于IOmL容量瓶中，加去 離子水定容，搖勻，用722型可見分光光度計，于610nm處比色測OD值，利用細胞干重 標準曲線算得細胞干重，若測搖瓶發酵培養中的菌體濃度則在定容前加2mL 2N的鹽酸溶 解菌懸液中的碳酸鈣。L-苯丙氨酸濃度的測定方法采用氨基酸常用測定方法，高效液相色譜(HPLC) 柱前 行生化方法進行測定(Rapid, accurate, sensitive, and reproducible HPLC analysis of aminoacids.Henderson, J. W., Rieker, R.D., Bidlingmeyer, B.A., Woodward, C.， Agilent Technologies, USA, 2000)。有益效果本發明將傳統紫外誘變育種的優點與分子生物學改造的優點相結合，通過噬菌 體淘汰培養的方法，高效率地篩選并構建出一株具有噬菌體BP-1、BP-2抗性的L-苯丙 氨酸生產菌；與之前的L-苯丙氨酸生產菌株相比，可以抵抗兩種大腸桿菌噬菌體的感 染，且細胞生長速度和L-苯丙氨酸產量不受影響，并且具有良好的遺傳穩定性，提高了 L-苯丙氨酸生產企業的經濟效益。
具體實施例方式實施例一噬菌體BP-I的分離純化菌株本實驗室前期開發的L-苯丙氨酸生產菌重組大腸桿菌WSH-Z06 (pAP_B03)， 保藏于中國典型培養物保藏中心，菌種保藏編號為CCTCC M 2010009。取某工廠受到噬菌體感染的重組大腸桿菌WSH-Z06(pAP_B03)發酵液4mL， 8000rpm離心IOmin后，上清液經0.22 μ m微孔濾膜過濾除菌，取出100 μ L到50 V 裝有6mL上層肉膏蛋白胨培養基的試管中，同時加入WSH-Z06(pAP_B03)菌懸液100 UL,立即混勻，倒入已凝固的底層培養基上，鋪勻，置37°C培養箱內培養16-24h。 待長出單個噬菌斑后，用接種針穿刺法挑取形態、大小不一的單個空斑分別接入含有 WSH-Z06(pAP_B03)的液體培養基中，37°C振蕩培養16_24h。重復上述步驟進行噬菌斑 形態、大小的檢驗，直至得到純化的噬菌體。噬菌體分離純化培養基肉膏蛋白胨培養基(牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡 萄糖 10g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0-7.2，上層瓊脂 0.8%，下層瓊脂 2%)。噬菌體BP-I已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCM
2010054。實施例二噬菌體BP-2的分離純化菌株本實驗室前期開發的L-苯丙氨酸生產菌重組大腸桿菌WSH-BR42 (pAP_B03)， 保藏于中國典型培養物保藏中心，菌種保藏編號為CCTCC M 2010008。取某工廠受到噬菌體感染的重組大腸桿菌WSH-BR42 (pAP"B03)發酵液4mL， 8000rpm離心IOmin后，上清液經0.22 μ m微孔濾膜過濾除菌，取出100 μ L到50 V 裝有6mL上層肉膏蛋白胨培養基的試管中，同時加入WSH-BR42(pAP_B03)菌懸液 IOOuL,立即混勻，倒入已凝固的底層培養基上，鋪勻，置37°C培養箱內培養16-24h。 待長出單個噬菌斑后，用接種針穿刺法挑取形態、大小不一的單個空斑分別接入含有 WSH-BR42(pAP_B03)的液體培養基中，37°C振蕩培養16_24h。重復上述步驟進行噬菌 斑形態、大小的檢驗，直至得到純化的噬菌體。噬菌體分離純化培養基肉膏蛋白胨培養基(牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡 萄糖 10g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0-7.2，上層瓊脂 0.8%，下層瓊脂 2%)。噬菌體BP-2已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCM
2010055。實施例三紫外線誘變育種、噬菌體淘汰培養以及雙抗性的篩選菌株大腸桿菌宿主菌WSH-ZHO6 (前期構建，Enhanced L-phenylalanine biosynthesis byco-expression of pheAftr and aroFwt.Haiyan Zhou, Xianyan Liao，Tianwen Wang, GuochengDu, Jian Chen.Bioresource Technology)從斜面上接一環大腸桿菌宿主菌WSH-ZH06菌種入LB種子培養基中 (25mL/250mL錐形瓶)，在37°C、200rpm的條件下培養12h后，離心收集菌體，用生 理鹽水洗滌三次。取適量菌懸液于六只內置磁力攪拌子的培養皿中，放入紫外誘變箱 (紫外燈與菌液距離為30cm，紫外燈為15瓦特)，分別在紫外燈下照射10s，20s, 30s, 40s, 50s及60s。在紅燈下，在每只培養皿中分別吸取ImL菌液于裝有30mLLB和各 ImL效價為liTpfu/mL的兩種噬菌體裂解液的三角瓶中間培養6h，而后稀釋、涂布LB 平板，置于37°C培養箱中培養過夜，挑取形態、大小、顏色各不相同的菌落逐一涂布單 層平板，然后在平板的4個象限處分別各滴加5μ1噬菌體BP-I和BP-2裂解液，做好標 記，培養24h后，挑取在4處滴加噬菌體的地方均沒有出現噬菌斑的菌株6株，將每株菌 分別在斜面培養基上連續傳代10次，再分別檢測各菌株每一代的噬菌體抗性，結果選出 噬菌體抗性遺傳穩定的菌株1株，命名為WSH-BR165。
實施例四將質粒轉入具有雙重噬菌體抗性的大腸桿菌菌株具有噬菌體BP-1、BP-2雙重抗性的大腸桿菌宿主菌WSH-BR165質粒PAP-B03為本實驗室自行構建(詳見參考文獻Enhanced L-phenylalanine biosynthesis byco-expression of pheAftr and aroFwt.Haiyan Zhou, Xianyan Liao，Tianwen Wang, GuochengDu, Jian Chen.Bioresource Technology, 2010, 1)采用電轉化的方法對大腸桿菌突變株WSH-BR165進行轉化質粒pAP_B03。將 WSH-BR165的對數期培養液IOOmL先用等量的水洗滌三次，再用等量的10%甘油洗滌 三次，最后用ImL的10%甘油懸浮菌體。向電轉化杯中加入50μ1的菌懸液，再加入 5μ1的質粒，向電轉杯提供2.5KV的電壓5ms，立刻在電轉杯中加入ImL的LB培養基， 混勻后轉入1.5mL的離心管里于37°C、200rpm條件下培養2h后，涂布含有硫酸卡那霉素 的LB平板，置于37°C培養箱中培養過夜。待有單菌落長出，得到具有雙重噬菌體抗性 的L-苯丙氨酸生產菌WSH-BR165 (pAP03)，將其接入含有硫酸卡那霉素的LB斜面上保 藏備用。WSH_BR165(pAP03)已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC M2010013。 實施例四在添加噬菌體BP-2裂解液的條件下，WSH-BR165 (pAP03)與 WSH-BR42 (pAP-B03)以及WSH-Z06 (pAP-B03)產L-苯丙氨酸能力的比較菌株WSH-BR165 (pAP03)、WSH-ZH06 (pAP03)、WSH-BR42 (pAP_B03)優選培養基組成為(1)種子培養基使用LB培養基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)，pH 7.0,固體培
養基加2%的瓊脂。(2)發酵培養基(g/L)葡萄糖25，L-酪氨酸0.4，碳酸鈣12.5，七水合硫酸鎂3.0，二水合氯化鈣 0.015，磷酸二氫鉀3.0，氯化鈉1.0，硫酸銨5.0，七水合硫酸亞鐵0.075，檸檬酸鈉1.0， 硫胺素(thiamine · HCl) 0.075,硫酸卡那霉素0.04，微量元素溶液(TES) 1.5mL/L，pH 7.0。TES 溶液(g/L) Al2 (SO4) 3 · 18H20 2.0, CoSO4 · 7H20 0.75, CuSO4 · 5H20 2.5，H3BO30.5，MnSO4 · H2O 24，Na2MoO4 · 2H20 3.0，NiSO4 · 6H20 2.5， ZnSO4 · 7H20 15，用 IN 的 HCl 溶解。3L發酵罐中發酵培養基體積為1.5L，通氣量為lvvm，攪拌轉速為400rpm，待 DO降至20%，通過調節攪拌轉速和通氣量維持DO在20%以上；溫度設定為33°C，菌 體濃度達到OD61tl = 3時，升溫至37°C，用28%氨水控制pH在7.0左右，使用流加700g/ L的葡萄糖溶液的方式維持培養基中殘余葡萄糖濃度在5g/L左右，發酵至L-苯丙氨酸產 量達到最大，結果見表一。表一
菌種發酵時間(h)L-苯丙氨酸(g/L)生產強度(gh_VL)WSH-BR165 (pAP03)45491.09WSH-ZH06 (pAP03)48521.08WSH-BR42 (pAP-B03)47501.06表一數據表示，經過誘變后，雖然重組大腸桿菌L-苯丙氨酸產量略微降低，但 發酵時間有所縮短，生產強度總體不變，并且具有了噬菌體BP-I和BP-2抗性。實施例五在添加噬菌體BP-I和BP-2裂解液的條件下，WSH_BR165 (pAP03) 產L-苯丙氨酸能力的驗證菌株噬菌體BP-I，保藏編號為CCTCC M 2010054 ；噬菌體BP-2，保藏編號為 CCTCC M2010055 ； WSH-BR165 (pAP03)保藏編號為 CCTCC M 2010013。3L發酵罐中發酵培養基(分別添加0.5% (ν/ν)的效價為IOuiPFUAnL的噬菌體 BP-I和ΒΡ-2的裂解液)體積為1.5L。通氣量為lwm，攪拌轉速為400rpm，待DO降 至20%，通過調節攪拌轉速和通氣量維持DO在20%以上；溫度設定為33°C，菌體濃度 達到OD61tl = 3時，升溫至37°C，用28%氨水控制pH在7.0左右，使用流加700g/L的 葡萄糖溶液的方式維持培養基中殘余葡萄糖濃度在5g/L左右，發酵48小時，L-苯丙氨 酸產量達到48g/L。
權利要求
1.一種L-苯丙氨酸生產菌，其特征在于該菌株具有對重組大腸桿菌易感染噬菌體 BP-I (CCTCC M 2010054)和 BP-2 的(CCTCC M 2010055)雙重抗性；含有重組質粒，質 粒上攜帶L-苯丙氨酸合成酶基因，現已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏時間2010 年1月18日，保藏編號為CCTCC M2010013。
2.根據權利要求1所述兩種噬菌體BP-I和BP-2，其特征在于，噬菌體BP-I來源于 本實驗室前期開發的L-苯丙氨酸生產菌WSH-ZH06 (CCTCC M2010009)受到噬菌體污 染的裂解液，噬菌體BP-I已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏時間2010年3月15 日，保藏編號為CCTCC M 2010054 ；噬菌體BP_2來源于本實驗室開發的L-苯丙氨酸生 產菌WSH-BR42 (CCTCC M2010008)受到噬菌體污染的裂解液，WSH-BR42具有噬菌體 BP-I的抗性，但不具有噬菌體BP-2的抗性，噬菌體BP-2已保藏于中國典型培養物保藏 中心，保藏時間2010年3月15日，保藏編號為CCTCC M 2010055。
3.根據權利要求1所述重組質粒，其特征在于，其上攜帶L-苯丙氨酸合成的關鍵酶 CM/PDT 和 DS 的基因 pheAto 和 aroFwt。
4.一種選育噬菌體抗性L-苯丙氨酸生產菌的方法，其特征在于，對容易受到噬菌體 污染的大腸桿菌宿主菌分別進行紫外線誘變處理、噬菌體淘汰培養后，篩選到一株具有 BP-I和BP-2噬菌體雙重抗性的大腸桿菌宿主菌，隨后用編碼L-苯丙氨酸合成酶基因的 質粒轉化上述大腸桿菌宿主菌，得到具有噬菌體雙重抗性的L-苯丙氨酸生產用重組大腸 桿菌。
5.根據權利要求4所述噬菌體淘汰培養方法，其特征在于，在紫外線誘變處理后，紅 燈下在培養皿中分別吸取一定含量菌液于裝有LB培養基和噬菌體BP-I以及BP-2裂解液 的三角瓶中培養一段時間，使得誘變后不具有噬菌體BP-I和BP-2抗性的菌被淘汰，具 有雙重噬菌體抗性的菌得到富集。
全文摘要
本發明對容易受到噬菌體污染的WSH-Z06的宿主菌分別進行紫外線誘變處理、噬菌體淘汰培養，篩選到一株具有BP-1和BP-2雙重抗性的大腸桿菌宿主菌，隨后用編碼L-苯丙氨酸合成酶基因的質粒(pAP-B03)轉化宿主菌，得到抗噬菌體L-苯丙氨酸生產菌WSH-BR165(pAP-B03)；本發明將傳統紫外誘變育種的優點與分子生物學改造的優點相結合，通過噬菌體淘汰培養的方法，高效率地篩選并構建出一株具有噬菌體BP-1、BP-2抗性的L-苯丙氨酸生產菌。
文檔編號C12P13/22GK102010848SQ20101013560
公開日2011年4月13日 申請日期2010年3月30日 優先權日2010年3月30日
發明者劉龍, 周海巖, 堵國成, 李江華, 王靜, 陳堅 申請人:江南大學