一種輔助鑒定弱冬性小麥的方法及其專用引物的制作方法

專利名稱：：一種輔助鑒定弱冬性小麥的方法及其專用引物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種輔助鑒定弱冬性小麥的方法及其專用引物。
背景技術：
：春化作用是一些一年生或多年生的溫帶或亞熱帶植物如小麥、大麥等禾谷類作物必須經歷一定時間的低溫處理才能開花結實的現象，普通小麥廣泛的適應性很大程度上就是由于春化需求的遺傳變異引起的。根據小麥的春化反應特性將其分為春性、弱冬性和冬性。春性植物不需要低溫春化就能開花，弱冬性的植物需要2-4周的低溫處理才能抽穗開花，冬性的植物必須給以6周以上的低溫處理才能實現營養生長向生殖生長轉變(GardnerFPiBarnettRD(1990).Vernalizationofwheatcultivarsandatriticale.CropSci，30:166-169)。植物品種的春化特性與其地理分布關系密切，其中弱冬性小麥廣泛分布于亞洲、歐洲等許多地區，在小麥品種中占有較大的比例。我國具有豐富的小麥品種資源，且分布在十大小麥生態區，有44%以上的品種為弱冬性，其中最大的麥區-黃淮海麥區有60%以上的品種為弱冬性，這種廣泛的適應性必然有豐富的遺傳基礎。現有的有關春化基因的研究多集中在春性與冬性基因上，迄今已有VRN-1、Vrn-2和Vrn-3三個春化基因被克隆(YanL,LoukoianovA,TranquilliG,etal(2003)·PositionalcloningofthewheatvernalizationgeneVRNLPNAS,100:6263_6268;YanL,LoukoianovA,BlechlA,etal(2004).ThewheatVRN2geneisafloweringrepressordown-regulatedbyvernalization.Science,3031640-1644；YanL,FuD,LiC,etal(2006).FromtheCoverThewheatandbarleyvernalizationgeneVRN3isanorthologueofFT.PNAS,10319581-19586)；研究表明，VRN-1基因在A、B、D三個基因組上的等位基因變異在調節普通小麥春化反應特性上起著重要的作用(McintoshRA,YamazakiY,DevosKM,etal(2003).Catalogueofgenesymbolsforwheat.InProceedingsoftheIOthInternationalWheatGeneticsSymposium,ed(InstitutoSperimentaleperlaCerealicoltura)，l-34)。VRN-I基因對于春性習性來說是顯性的，A、B、D三個基因組上的任何一個等位基因為顯性時，均表現為春性習性，否則為冬性(YmL，LoukoimovA,TranquilliG,etal(2003).PositionalcloningofthewheatvernalizationgeneVRNl.PNAS,100:6263-6268；YanL,HelgueraΜ,KatoK，etal(2004)·AllelicvariationattheVRN-Ipromoterregioninpolyploidwheat.TheorApplGenet,109:1677—1686;FuD,SzucsP,YanL,etal(2005).LargedeletionswithinthefirstintroninVRN-Iareassociatedwithspringgrowthhabitinbarleyandwheat.MolGenetGenomics,273=54-65)0目前，已有研究證明春性產生的原因，但有關弱冬性產生的原因尚未見報道，因此研究弱冬性習性形成的分子機理、小麥春化反應特性、春化基因VRN-I和Vrn-2的等位變異及不同等位基因組合的地理分布特征具有重要的理論與實際意義。啟動子和內含子均屬于基因的非編碼區域，近年來研究發現它們以增強子、抑制子或促進子的方式參與基因轉錄調節。啟動子通過一系列的順式作用元件，如TATA-，CCAAT-，E-和CArG-boxes等與轉錄因子結合，調控下游功能基因的時空表達。多數研究認為內含子區域的調控因子位于第一個內含子內(Gazzrni，S.，Gendall,A.R.，Lister,C.，etal(2003).AnalysisofthemolecularbasisoffloweringtimevariationinArabidopsisaccessions.PlantPhysiol,132:107_1114；Michaels，S.D.，He，Y.，Scortecci，K.C,etal(2003).AttenuationofLOWERINGLOCUSCactivityasamechanismfortheevolutionofsummer-annualfloweringbehaviorinArabidopsis.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100:10102-10107)。例如，Yan等(YanL,LoukoianovA，TranquilliG，etal(2003).PositionalcloningofthewheatvernalizationgeneVRNl.PNAS,100:6263_6268；YanLiHelgueraMiKatoK，etal(2004)·AllelicvariationattheVRN-Ipromoterregioninpolyploidwheat.TheorApplGenet，109:1677-1686)發現Vrn-Al啟動子的插入或缺失突變與春性生長習性有關；Fu等(FuDiSzucsP，YmL，etal(2005).LargedeletionswithinthefirstintroninVRN-Iareassociatedwithspringgrowthhabitinbarleyandwheat.MolGenetGenomics，273:54_65)石if究認為VRN-I第一個內含子缺失突變也能導致春性生長習性。可見，這兩個調控位點中的任何一個發生突變都足以引起春性習性(FuD,SzucsP,YanL,etal(2005).LargedeletionswithinthefirstintroninVRN-Iareassociatedwithspringgrowthhabitinbarleyandwheat.MolGenetGenomics，273:54_65)。在二倍體和四倍體春性小麥中，Vrn-Al啟動子區域的缺失突變臨近或者影響到CArGbox(DubcovskyJandYanL(2003).AllelicvariationinthepromoterofAp1,thecandidategeneforVRN-1.InPognaN(ed)ProceedingsoftheIOthinternationalwheatgeneticssymposium,Paestum,Italy,1243-246；YanL,LoukoianovA,TranquilliG,etal(2003).PositionalcloningofthewheatvernalizationgeneVRN1.PNAS,1006263-6268；YanL,HelgueraΜ,KatoK,etal(2004).AllelicvariationattheVRN-Ipromoterregioninpolyploidwheat.TheorApplGenet，109:1677_1686)；而在六倍體小麥中檢測到Vrn-Al啟動子區域差異不是位于CArGbox，而是臨近HDD區域(YanL,HelgueraM,KatoK,etal(2004).AllelicvariationattheVRN-Ipromoterregioninpolyploidwheat.TheorApplGenet,1091677-1686)。然而，HDD區域在VRN-I轉錄起始中可能并沒有起重要作用，因為小麥PI349049的春性習性是由于Vrn-Al啟動子區域包括HDD區發生了34bp的缺失(YanL,LoukoianovA,TranquilliG,etal(2003).PositionalcloningofthewheatvernalizationgeneVRN1.PNAS，100:6263_6268)。在六倍體小麥品種中Vrn-Al啟動子突變的作用可以被簡單地解釋為這些突變足以產生春性習性；然而，不能排除由VRN-I基因啟動子外的區域的突變產生春性習性，而這個突變與啟動子的突變是連鎖的。因此，比較VRN-I顯性和隱性等位基因的全長序列是非常重要的(FuDjSzucsP,YanL,etal(2005).LargedeletionswithinthefirstintroninVRN-Iareassociatedwithspringgrowthhabitinbarleyandwheat.MolGenetGenomics,273:54_65)。CArG-box(CC(A/T)6GG；Dolan,J.W.andFields,S(1991).Cell-type-specifictranscriptioninyeast.Biochim.Biophys.Acta,1088155-169；Treisman,R(1992).Theserumresponseelement.TrendsBiochem.Sci,17:423_426)是MADS—boxSSW^n(Huang,H.，Mizukami,Y.，Hu,Y.，etal(1993).IsolationandcharacterizationofthebindingsequencesfortheproductoftheArabidopsisfloralhomeoticgeneAGAMOUS.NucleicAcidsRes，1993，21:4769_4776)。在擬南芥中，MADS是個大的基因家族，有100多個成員，大部分已經被證明參與植物生長發育的各個方面(ParenicovaL,deFolterS,KiefferM,etal(2003).MolecularandphylogeneticanalysesofthecompleteMADS—boxtranscriptionfactorfamilyinArabidopsis:newopeningstotheMADSworld.PlantCell，15:1538_1551；DeFolterS，Angenent(2006).GCtransmeetscisinMADSscience.TreadsinPlantScience,11:224_231)。在小麥中，同樣有一些MADS-box成員參與開花調控。Jolineetal.(JolineJ.Tilly,DavidW(1998).AllenandThomasJack.TheCArGboxesinthepromoteroftheArabidopsisfloralorganidentitygeneAPETALA3mediatediverseregulatoryeffects.Development,1251647-1657)研究發現擬南芥中花器官形成類的基因APETALA3的調節序列位于啟動子區域的CArG-boxes作用元件，其有三個拷貝，通過將其突變與⑶S報告基因融合發現它們對AP3起著不同的調節作用。推測CArGl和CArG2是一個或一類激活因子的結合位點，而CArG3可能是一種負調控因子的結合位點。此外，擬南芥上的兩個基因FLOWERINGLOCUSC(FLC)和FRIGIDA(FRI)協同作用調節春化反應，在FRI功能喪失時，表現為春性(MichaelsS.D.andAmasinoR.M(1999).FlowingLocusencodesanovelMADSdomainproteinthatactsasarepressorofflowering.PlantCell,11949~956；SheldonCC,BurnJE,PerezPP,etal(1999).TheFLFMADSboxgene-.arepressoroffloweringinArabidopsisregulatedbyvernalizationandmethylation.PlantCell,11:445-458)。Scott等(2003)(ScottD.Michaels,YuehuiHe,etal(2003).AttenuationofFLOWERINGLOCUSCactivity.PNAS,100(17)10102-10107)報道了一些含有FRI功能的品種開花仍然比較早，這是由于FLC的第一個內含子中的插入突變產生了FLC的弱的等位基因；相對于FLC強等位基因，它們的轉錄水平較低。
發明內容本發明的目的是提供一種輔助鑒定弱冬性小麥的方法及其專用引物。本發明所提供的輔助鑒定弱冬性小麥的方法，是以待測小麥的基因組DNA為模板，用序列表中序列1和序列2所示的引物進行PCR擴增，獲得第一輪PCR擴增產物；再以所述第一輪PCR擴增產物為模板，用序列表中序列3和序列4所示的引物進行PCR擴增，獲得第二輪PCR擴增產物；將第二輪PCR擴增產物用限制性內切酶BfaI進行酶切，若酶切產物為兩條帶，則待測小麥為弱冬性小麥；若酶切產物不為兩條帶，則待測小麥為候選非弱冬性小麥。上述小麥為普通小麥。上述輔助鑒定弱冬性小麥的引物也屬于本發明的保護范圍。本發明所提供的輔助鑒定弱冬性小麥的引物，由兩對引物組成，其中一對引物的核苷酸序列如序列表中序列1和序列2所示，另一對引物的核苷酸序列如序列表中序列3和序列4所示。本發明的第三個目的是提供一種輔助鑒定弱冬性小麥的試劑盒。本發明所提供的輔助鑒定弱冬性小麥的試劑盒，包括核苷酸序列為序列表中序列3和序列4所示的一對引物和限制性內切酶Bfal。本發明對不同品種的春性和弱冬性小麥的Vrn-Dl基因進行比較，結果發現，在弱冬性小麥Vrn-Dl基因啟動子區的CArG-box中，胞嘧啶突變為腺嘌呤突變，形成了一個新的等位基因Vrn-Dlb。根據該突變位點，開發出該等位基因的CAPS標記。在一個BC4F2群體中發現基因Vrn-Dlb與材料的弱冬性共分離；實時定量PCR結果表明，攜帶有基因Vrn-Dlb的弱冬性小麥中，Vrn-Dl的表達受到抑制。因此，認為Vrn-Dlb是控制小麥弱冬性的基因。實驗結果表明，相對于春性小麥品春16，帶有等位基因Vrn-Dlb的弱冬性小麥萊州953的春化敏感性增加，基因表達水平降低與啟動子區域的CArG-box的點突變的相關性可以被解釋為CArG-box是一個正向作用因子的結合位點，而且這個正調控因子在調節Vrn-Dl表達水平上起著重要作用；Vrn-Dl弱等位性當CArG-box發生點突變時，導致上游正調控因子不能識別它，產生了Vrn-Dl弱等位基因Vrn-Dlb，以致Vrn-Dl表達水平降低，春化敏感性增加。現有的研究表明，VRN-I的三個顯性等位基因Vrn-Al、Vrn-Bl和Vrn-Dl均能使得植株對春化不敏感，表現為春性習性。然而，本發明發現一些帶有Vrn-Dl顯性等位基因的品種有弱的春化需求，屬于弱冬性類型。本發明的研究認為，Vrn-Dl啟動子區域CArG-box的點突變導致了弱冬性習性。理由如下第一，將攜帶相同基因型Vrn-Alvrn-BlVrn-Dl的春性和弱冬性小麥品種(各5份)的D基因組上的VRN-I全基因組序列進行測序，比較發現，除了起始密碼子上游161bp位置的一個SNP外，沒有任何差異。該點突變位于CArG-box內。為了區別該突變位點，將春性品種的Vrn-Dl命名為Vrn-Dla，而將弱冬性品種的Vrn-Dl命名為Vrn-Dlb；第二，在一個148個單株的BC4F2群體中弱冬性習性與Vrn-Dlb的標記表現為共分離，且自然群體中，Vrn-Dlb的標記僅出現在弱冬性習性的材料中；第三，在春性、弱冬性和冬性習性的材料間Vrn-Dl的表達分析也證明了啟動子區域CArG-box內的A/C突變確實影響了Vrn-Dl基因的表達，且改變了材料的春化反應特性。可以提出一個簡單的模型對春性、弱冬性和冬性習性的產生進行解釋。基因型為Vrn-Alvrn-Blvrn-Dl的小麥，VRN-I基因A基因組上啟動子區域InDel或VRN-I基因的第一個內含子區域缺失使得作用于該位點的抑制子不能識別，該基因能正常表達，表現為春性；而當VRN-I基因D基因組上同時出現第一個內含子區域缺失和啟動子區域CArG-box點突變時，一方面作用于內含子上的抑制子不能識別，另一方面又使得作用于啟動子區域CArG-box上的促進子也不能識別它，在兩個調節位點的共同作用下，Vrn-Dl的表達量低于那些只攜帶第一個內含子缺失的春性材料，卻又高于那些沒有任何突變的冬性材料，植物最終表現為弱冬性。可見，生物體內的調節過程是復雜的，有時是某個部分單獨起作用，如春性習性由啟動子區域或內含子區域的變化(YanL,LoukoianovA,TranquilliG,etal(2003).PositionalcloningofthewheatvernalizationgeneVRNLPNAS,100:6263_6268;YanL,HelgueraM,KatoK,etal(2004).AllelicvariationattheVRN-Ipromoterregioninpolyploidwheat.TheorApplGenet,109:1677-1686；FuD,SzucsP,YanL,etal(2005).LargedeletionswithinthefirstintroninVRN-Iareassociatedwithspringgrowthhabitinbarleyandwheat.MolGenetGenomics,27354~65；YanL,FuD,LiC,etal.FromtheCover:ThewheatandbarleyvernalizationgeneVRN3isanorthologueofFT.PNAS，2006，10319581-19586)來調節。有時又是幾個部分協同調控，就會產生一系列新的表型，從而造就了自然界的多樣性。本發明的輔助鑒定弱冬性小麥的方法，可以在早期對小麥的春化習性進行判斷，以加快育種速度、降低育種成本，并具有操作簡單、成本低廉和周期短的優點，適于推廣應用，為小麥品種的春化習性鑒定提供了一種快捷的方法。圖IA為D基因組特異性引物IF和3R在中國春及其缺體-四體材料基因組中的擴增結果圖IB為四對重疊PCR引物的擴增結果圖2A為引物VRN1-1000F和VRN1-INT1R在不同小麥品種中的擴增結果圖2B為引物VRNlweakD2-lF和VRNlweakDl-IR以引物VRN1-1000F和VRN1-INT1R的PCR產物為模板的擴增結果圖2C為不同小麥品種的兩輪PCR擴增產物的BfaI酶切結果圖3為不同春性、弱冬性小麥品種的Vrn-Dl基因部分序列比對結果圖4為CAPS標記對親本及部分F2單株的檢測結果圖5A為不同生長習性的小麥品種在不同春化條件處理下的抽穗天數圖5B為不同生長習性的小麥品種在不同春化條件處理下葉片中Vrn-Dl基因的表達量比較結果圖6為CAPS標記對攜帶不同VRN-I基因型的春性、弱冬性及冬性小麥品種的PCR檢測結果具體實施例方式本發明實施例中所用到的各個品種的小麥均由中國農業科院作物科學研究所和農業部作物品種資源與生物技術重點實驗室提供。具體可以登陸“中國作物種質信息網，，http://www.cRris.net/query/croplist.php查詢禾口獲耳又。實施例1、VRN-I基因的D基因組全長序列的獲得一、DNA的提取與檢測將小麥種子(中國春的缺體_四體材料5NATD、5NBTD、5NDTA及中國春)表面消毒后，播種于培養缽中，室溫條件下長至兩葉一心時分別采集葉片，液氮速凍后，置于-70°C冰箱中備用。總DNA的提取采用酚-氯仿法(DevosKM，AtkinsonMD,ChinoyCN,etal.RFLPbasedgeneticmapofthehomoeologousgroup3chromosomesofwheatandrye.TheorApplGenet,1992,83:931_939)。具體步驟如下1)將新鮮的上述葉片置于液氮中低溫下磨碎，轉入1.5ml離心管中，加入500μ1緩沖液S(100mMρΗ8.5的Tris-HCl，IOOmMNaCl,50mMpH8.0的EDTA，2%(質量百分含量)SDS)，65°C水浴l_2h。2)加入500μ1酚-氯仿(11體積比)混合液，混勻后10，OOOrpm離心IOmin；取上清液加入0.6倍體積的異丙醇，混勻后靜置5min，10，OOOrpm離心lOmin，棄上清，用70%乙醇將DNA洗1-2次后室溫下干燥。3)將DNA溶于500μ11XTE(ρΗ8·0)，力口2μ1RNA酶(10mg/ml)，37°C保溫3h；加500μ1氯仿，輕柔混勻，10，OOOrpm離心IOmin。4)取上清液加入1/10體積的3Μ乙酸鈉(ρΗ5.2)和2倍體積的冷無水乙醇(或95%乙醇)，輕輕混勻后靜置5min，10，OOOrpm離心lOmin，輕輕倒掉液相，用70%乙醇將DNA洗1-2次后室溫下干燥，將干燥后的DNA溶于1XTE(ρΗ8.0)中。5)用紫外分光光度計測定提取得到的DNA的濃度和相對純度；0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA條帶的完整性。結果表明，提取得到的DNA的濃度為800-1000ng/ul；相對純度為OD26(1/OD28(1=1.75-1.80；瓊脂糖凝膠電泳的DNA為一條完整的條帶，無降解。二、基因組DNA的擴增與測序1、引物設計及基因組DNA的擴增根據NCBI中提供的VRN-I基因的A、B和D基因組序列，利用DNAStar軟件中的SeqMan比較序列間的差異，PrimerSelect設計D基因組特異引物IF和3R。為證實該引物的基因組特異性，分別在中國春的缺體-四體材料5NATD、5NBTD、5NDTA及中國春中擴增VRN-I基因。PCR反應體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>PCR擴增程序如下先95"C4min；然后95°C30s,68"CIOmin,30個循環；再72°C10min，4°C保溫。1-2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增得到的片段大小，結果如圖IA所示。其中，M為GeneRulerIkb的DNA分子量標準；5NA、5NB和5ND分別為中國春第五同源群上的缺體-四體材料5NATD、5NBTD和5NDTA；CS為中國春。結果表明，除了缺少5D染色體的缺體-四體5NDTA中無擴增條帶外，其余材料均擴增得到大小約為8.Ikb的目的條帶，從而證明引物IF和3R為D基因組特異性的引物。另外，由于擴增得到的片段過長，不利于擴增及測序，又以IF和3R為引物，以從中國春中擴增出的產物為模板，設計四對重疊PCR引物1F和AR、BnewlF和BnewR、CF和C2R和DF和3R，分四段擴增出Vrn-Dl基因的全長序列。具體的PCR擴增引物序列、產物大小及退火溫度如表1所示。PCR反應體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>PCR擴增程序如下先950C4min；然后95°C30s，退火(51-60°C)30s,72°Clmin/kb，34個循環；再72°C10min，4°C保溫。表IPCR引物序列、產物大小及退火溫度<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增得到的片段大小，結果如圖IB所示。其中，M為天根生物公司的200bp的DNA分子量標準；1、2、3和4分別為四對重疊PCR引物IF和AR、BnewlF和BnewR、CF和C2R、DF和3R的擴增產物(均以引物IF和3R在中國春中擴增得到的產物為模板)。結果表明，以IF和AR為引物擴增得到大小約為900bp的條帶；以BnewlF和BnewR為引物擴增得到大小約為800bp的條帶；以CF和C2R為引物擴增得到大小約為4.5kb的條帶；以DF和3R為引物擴增得到大小約為3.4kb的條帶。這四條擴增產物條帶的大小均與預期相符。2、PCR產物的純化1)100μ1的PCR產物進行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下用潔凈消毒的刀片將目標片段挖出，分別放入1.5ml離心管中。2)向1.5ml離心管中加入3倍體積的溶膠液，50°C水浴lOmin，待凝膠完全溶化后，倒入吸附柱中，13，OOOrpm離心lmin，棄溶膠液。3)向吸附柱中加入700μ1漂洗液，13，OOOrpm離心lmin。4)倒出漂洗液，再向吸附柱中加入500μ1漂洗液，13，OOOrpm離心lmin。5)將離心管中的漂洗液倒掉，13，OOOrpm離心2min。6)將吸附柱轉移至一新的1.5ml離心管上，加入適量洗脫液，室溫放置2min。7)13，OOOrpm離心lmin，棄吸附柱，離心管內即為高純度的PCR純化產物。3、PCR產物測序采用引物延伸(primerwalking)的方法設計測序引物，分別將上述四段擴增產物直接測序，采用BigDyeKTerminatorv3.ICycleSequencingKit(ABI)進行測序PCR反應，測序使用ABI3730XLDNAAnalyzer。三、序列組裝、拼接和比對采用http//www.DNAStar.com中的LasergeneSeqManIIModule(DNAStar)進行序列的組裝和拼接。將拼接后的序列與NCBI中的Vrn-Dl基因序列進行相似性比較，結果表明，表明從中國春中獲得了Vrn-Dl基因的全長序列。實施例2、Vrn-Dl的一個新等位基因Vrn-Dlb的發現為解釋基因型均為Vrn-Dl的小麥中出現兩種表現型的現象，將攜帶Vrn-Dl等位基因的春性小麥(品春16、偃展1號、雙吉4號、中國春和鄭花2563)與弱冬性小麥(螞蚱麥、茶淀紅、萊州953、復壯30和百農3217)進行VRN-I基因的D基因組全序列掃描、比較。利用表1中的引物，分別獲得各個品種小麥的Vrn-Dl基因全長序列及四段重疊序列，按照實施例1的方法測序、拼接和比對后發現，春性小麥與弱冬性小麥之間只有一個堿基的差異，比較結果如圖3所示。圖3的10條序列從上至下依次為螞蚱麥、品春16、偃展1號、雙吉4號、中國春、鄭花2563、茶淀紅、萊州953、復壯30和百農3217。其中，490bp處為起始密碼子ATG，其上游161bp處為序列間的差異位點，框內為CArG-box，BfaI和CAP位點均用下劃線標出。該突變位點位于起始密碼子ATG上游的161bp處，5個弱冬性小麥品種均為腺嘌呤A，而5個春性小麥品種均為胞嘧啶C。該位點正好位于預測的轉錄起始位點CAT上游的CArG-box內。為了區別該突變位點，將春性小麥品種的Vrn-Dl基因命名為Vrn-Dla，而將弱冬性小麥品種的Vrn-Dl基因命名為Vrn_Dlb。實施例3、檢測新等位基因Vrn-Dlb的CAPS標記的開發為了有利于對小麥種質資源中的這個突變位點進行檢測，將該突變開發成一個標記。經DNAStar中的Mapdraw程序進行酶切位點預測，發現該單堿基的突變正好形成了一個限制性內切酶BfaI的酶切位點。采用巢式PCR,以VRN1-1000F和VRN1_INT1R(序列1和序列2)為第一輪PCR引物，從小麥的基因組DNA中擴增出約為1200bp的片段，擴增結果如圖2A所示，其中1-10為10個不同的小麥品種的PCR擴增結果，M2為200bp的DNA分子量標準。再以此1200bp的擴增產物為模板(稀釋100倍)，以VRNlweakD2_lF禾口VRNlweakDl-IR為引物(序列3和序列4)進行第二輪PCR擴增，獲得大小為442bp的含突變位點的目標區域，擴增結果如圖2B所示，其中1-10為10個不同的小麥品種的PCR擴增結果，M1為50bp的DNA分子量標準，M2為200bp的DNA分子量標準。最后用BfaI酶對第二輪PCR產物進行酶切。反應體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>37°C酶切l_3h，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果表明，攜帶Vrn-Dlb等位基因的弱冬性小麥品種經酶切產生301bp和141bp兩個新的片段；而攜帶Vrn-Dla等位基因的春性小麥品種均未被切開，酶切結果如圖2C所示。其中1-5為春性小麥品種品春16、偃展1號、雙吉4號、中國春和鄭花2563的BfaI酶酶切結果，6-10為弱冬性小麥品種螞蚱麥、茶淀紅、萊州953、復壯30和百農3217的BfaI酶酶切結果，M1為50bp的DNA分子量標準，S為春性小麥品種，麗為弱冬性小麥品種。以上結果說明，利用巢式PCR經兩輪擴增后，再用BfaI酶酶切能夠成功地檢測到該突變位點，即利用這個CAPS標記可以檢測到新等位基因Vrn-Dlb。實施例4、小麥春化敏感性差異與新等位基因Vrn-Dlb的關系用CAPS標記檢測已知基因型為Vrn-Alvrn-BlVrn-Dl的弱冬性小麥65份和其它基因型的春性、弱冬性及冬性小麥共53份，見表2和表3(中國作物種質信息網http://www.CRris.net/query/croplist.php)。按照實施例3的方法進行巢式PCR、用BfaI酶對第二輪PCR產物進行酶切和檢測酶切產物，檢測結果如表2和圖6所示。表2中，在鑒定的65份基因型為Vrn-Alvrn-BlVrn-Dl的弱冬性小麥中，有53份小麥檢測到CAPS標記，出現的頻率為82%，推測其基因型為Vrn-Alvrn-BlVrn-Dlb；有12份小麥沒有檢測到CAPS標記，可能是其它位點發生了突變；而在其它基因型的春性、弱冬性及冬性小麥中均未檢測到CAPS標記。表2CAPS標記對攜帶不同VRN-I基因型的春性、弱冬性及冬性小麥的檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表2中，“+”表示按照實施例3的方法進行巢式PCR、用BfaI酶對第二輪PCR產物進行酶切并電泳檢測后產生兩條新的條帶，“_”表示按照實施例3的方法進行巢式PCR、用BfaI酶對第二輪PCR產物進行酶切并電泳檢測后未產生新的條帶。表3不同春化基因型的113份材料<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>圖6中，M為50bp的DNA分子量標準；1_35依次分別為1，春小麥(弱冬性，abd)、2，火燎麥(春性，Abd)、3，晉春3號(春性，Abd)、4，豫麥29(弱冬性，abd)、5，徐州14(弱冬性，abd)、6，輻63(弱冬性，abd)、7，丹麥1號(冬性，abd)、8，中麥9號(冬性，abd)、9，京411(冬性，abd)、10，克澇4號(春性，ABD)、11，白大頭(春性，ABD)、12，VAI0LET(春性，aBD)、13，大粒黃(春性，aBD)、14，克豐3號(春性，aBD)、15，深根(春性，AbD)、16，黑小麥(春性，abD)、17，GUADALUPE(春性，abD)、18，品春16(春性，abD)、19，百農3217(弱冬性，&匕013)、20，科遺26(弱冬性，abD)、21，光頭(春性，ABd)、22，鄭花0840-3(春性，abD)、23，復壯30(弱冬性，abDb)、24，綿陽79_2(春性，abD)、25，藁城8901(弱冬性，abDb)、26，洋麥(春性，ABd)、27，敦化春麥(春性，ABd)、28，恩麥4號(春性，aBd)、29，邯8014(弱冬性，abDb)、30，內鄉182(弱冬性，abD)、31，冀933235(弱冬性，abDb)、32，定西24(春性，ABd)、33，安陽1號(春性，aBd)、34，貴農10號(春性，aBd)和35，茶淀紅(弱冬性，abDb)的CAPS標記檢測結果；括號內為材料的生長習性及基因型。結果表明，圖6中檢測的35份材料中，只有基因型為vrnAlvrnBlVrnDlb(abDb)的弱冬性材料19、23、25、29、31和35酶切后能產生兩條新的條帶，其余各種基因型的春性、弱冬性和冬性材料均不能被酶切。實施例5、基因Vrn-Dlb的功能驗證春性小麥品種偃展1號(基因型為Vrn-AlVrn-BlVrn-Dla)和弱冬性小麥品種萊州953(基因型為Vrn-Alvrn-BlVrn-Dlb)在B、D基因組上的等位基因存在差異。為了證明基因Vrn-Dlb的功能，將偃展1號與萊州953雜交，并用偃展1號作輪回親本進行回交，在其BC4F1群體中鑒定出一株基因型為Vrn-AlVrn-AlVrn-BlVrn-BlVrn-DlaVrn-Dlb的單株。將偃展1號、萊州953及其該單株自交獲得的種子BC4F2分離群體的148個單株播種于20-25°C的溫室，16小時的長日照下生長60天。采集植株解剖鏡下觀察生長錐，鑒定其生長發育階段。進入幼穗分化階段的植株標志其處于生殖生長階段，反之為營養生長階段；未經低溫處理就能進入生殖生長階段的植株表現為春化不敏感性(即春性小麥)，而必須經4°C低溫春化處理15-30天后才能進入生殖生長階段的植株表現為春化敏感性(即弱冬性小麥)。結果表明，親本偃展1號表現為春化不敏感(I)，萊州953表現為春化敏感(S)。148個單株的鑒定結果表明，其中103株表現為春化不敏感(1)，45株表現為春化敏感(S)，不敏感與敏感株數之比符合3:1的分離比(χ2=1.796<Xaci52=3.841)。可見該群體對春化反應特性是由一對顯性基因控制的。利用Vrn-Dlb的CAPS標記對這148個單株進行鑒定，檢測結果如圖4所示。其中，M為200bp的DNA分子量標準；1為萊州953；2為偃展1號；3和21為攜帶純合基因Vrn-Dlb的春化敏感F2代單株；其余為春化不敏感單株，其中5、7和19為基因Vrn-Dla與Vrn-Dlb的雜合體F2代單株，4、6、8-18、20、22-25為攜帶純合基因Vrn-Dla的春化不敏感F2代單株。結果發現45株春化敏感的F2代單株全部攜帶純合的Vrn-Dlb基因，而春化不敏感的103個單株有29株均攜帶有純合的Vrn-Dla基因，其余為基因Vrn-Dla與Vrn-Dlb的雜合體，即春化特性與基因Vrn-Dlb的標記表現為共分離。由此可見該群體單株間在春化敏感性上的差異是由于D基因組上的顯性等位基因Vrn-Dla和Vrn-Dlb的差異引起的。實施例6、啟動子區突變對Vrn-Dl表達的影響一、春化處理及取樣方法選取攜帶Vrn-Dl等位基因的春性(品春16)、弱冬性(萊州953)和冬性(丹麥1號)小麥種子各80粒，隨機分為四組，每組的每個品種20粒，播種于20°C的溫室中，16h長日照下生長一個月。從第一組中選取五株最幼嫩的全展葉片提取RNA，作為未經春化處理的對照；其余三組轉入4°C16h長日照下生長，分別于4°C16h長日照下生長2周、4周和6周后，每組選取五株最幼嫩的全展葉片提取RNA，作為春化處理2周、4周和6周的RNA樣品。于播種120天后記載小麥的抽穗期，結果如圖5A所示，圖5A中數值為平均值士標準誤差。其中，1為無春化處理；2、3和4為分別進行2周、4周和6周的春化處理；S為春性小麥；MW為弱冬性小麥；W為冬性小麥。從圖5A中可以看出，總的趨勢為隨著低溫春化處理時間的延長，所有小麥品種中抽穗所需的天數逐漸減少。對于春性小麥品種，抽穗所需天數也在減少，但差異不顯著；冬性小麥品種的春化敏感性更強，低溫處理必須達到6周以上，才能使植株抽穗。二、實時定量PCR為了進一步了解Vrn-Dl的不同等位基因與春化敏感性間的關系，利用VRN-I的D基因組特異引物SYBER_BD_F和SYBER_D_R(LoukoianovA,YanL,BlechlA,SanchezA,&DubcovskyJ(2005)RegulationofVRN-IVernalizationGenesinNormalandTransgenicPolyploidWheat.PlantPhysiol.138(4):2364_2373)，以ACTIN基因為內參(YanL,etal.(2003)PositionalcloningofthewheatvernalizationgeneVRN1.ProcNatlAcadSciUSAlOO(IO):6263_6268)，對給予不同低溫春化處理O周、2周、4周和6周的春性小麥品春16(Vrn-Dla)、弱冬性小麥萊州953(Vrn-Dlb)和冬性小麥丹麥1號(vrn-Dl)分別提取總RNA，進行實時定量PCR分析，并與上述抽穗所需天數進行對照，具體步驟如下1、總RNA的提取滅菌的一次性使用的塑料制品如槍頭、1.5ml離心管基本上無RNA酶，可以不經預處理直接用于制備和貯存RNA；反復使用的塑料制品如40ml離心管、研缽和玻璃器皿等經常有RNA污染，用前需用0.1%(體積百分含量)的DEPC水浸泡過夜，然后高壓蒸汽滅菌45min。新開封的試劑基本上無RNA污染，可直接使用。提取過程中所配制的試劑均用滅菌的0.(體積百分含量)的DEPC水配制。1)將研缽先充分預冷，分別稱取0.Ig步驟一中的小麥葉片，在液氮低溫下充分研磨；將粉末轉入1.5ml離心管中，加入ImlTrizol(購自Invitrogen公司)，充分混勻。2)將勻漿樣品在室溫15-30°C下放置5min，使得核酸蛋白復合物完全分離。40C10，OOOrmp離心lOmin。3)將上清液轉入另一新的離心管中，加入200μ1氯仿，劇烈震蕩15s，室溫靜置3min,10,OOOrmp4°C離心15min。4)將水相轉移到另一新的離心管中，加入0.5ml異丙醇，混勻，室溫靜置lOmin，4°C10，OOOrmp離心IOmin05)倒掉液相，加入Iml75%乙醇，4°C不超過7500rmp離心5min，棄上清。短暫干燥，加入50ulDEPC水溶解，-70°C保存。2、總RNA中DNA的處理(1)在無RNase的0.2ml離心管中依次加入下述試劑<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>(2)37°Cgi^30min。(3)加入25mMEDTA1μ1，65°C溫育lOmin。3、RNA濃度及純度鑒定利用紫外分光光度計測定上述提取得到的總RNA的濃度并鑒定其純度；利用1.2%的甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。膠板、膠槽、梳子和電泳槽用洗滌靈浸泡洗滌后，用0.5%的SDS浸泡過夜，洗凈后，用蒸餾水沖洗干凈，備用。配制甲醛變性1.2%瓊脂糖凝膠在1.2g瓊脂糖中加入IOmlIOXFABuffer，加滅菌的DEPC水至IOOml；溶膠后待膠冷卻至50°C時加入1.8ml甲醛及1μ1ΕΒ，混勻后倒膠(厚度0.5-0.6cm)。待膠凝固后，將膠放入盛有IXFArunningbuffer的電泳池中平衡至少0.5h，在上述RNA樣品中加入1/4體積的IXRNAloadingbuffer，混勻后，65°C溫育3-5min，冰浴至少5min，上樣，電泳。電壓100V,電泳時間1.5h。結果表明，提取得到的總RNA濃度在1.5-2.Oug/ul之間；相對純度為D26(1/D28(1吸光值的比率在2.0-2.1之間；變性瓊脂糖凝膠電泳可見28S、18S、5.8S(5S)三條清晰的rRNA條帶。4、cDNA第一鏈的合成分別取上述經DNaseI處理過的不同時間低溫處理的小麥葉片總RNA，用SuperScriptIIReverseTranscriptase(Invitrogen)直接反轉錄為cDNA第一鏈。1)將如下試劑加入無RNA酶離心管<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>65°C保溫5min后，迅速置于冰上。2)將上述混合液短暫離心后，棄去上清，在沉淀中加入下述試劑<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>輕輕混勻，37°C保溫2min。3)加入1μ1反轉錄酶(購自Invitrogen公司)(200units/μ1)，用槍頭混勻，42°C保溫50min。4)70°C15min終止反應。5、實時定量PCR(1)引物來源D基因組特異引物為SYBER_BD_F:5，-CAGCCTCAAACAAGCTCTTCT-3，(序列5)禾口SYBER_D_R:5，-CTGCCCTCTCGCCTGC-3，(序列6)(LoukoianovA,YanL,BlechlA,SanchezA,&DubcovskyJ(2005)RegulationofVRN-IVernalizationGenesinNormalandTransgenicPolyploidWheat.PlantPhysiol.138(4):2364_2373)。內#ACTIN自(YanL,etal.(2003)PositionalcloningofthewheatvernalizationgeneVRN1.ProcNatlAcadSciUSAlOO(10):6263_6268)。ACTINF-ATGGAAGCTGCTGGAATCCAT-3'(序列7)禾口ACTINR5，-CCTTGCTCATACGGTCAGCAATAC-3，(序列8)。(2)實時定量PCR采用天根生化科技有限公司的SYBR試劑盒中提供的方法，25μ1的反應體系如下試劑_im_2.5xRealMastermix11.25μ1.10M引物F(序列5)0.625μ110M引物R(序列6)0.625μ11/10cDNA第一鏈2μ1ddH2010.5μ1總計_25.0μ1_反應程序為先95°C2min；然后95°C20s，60°C30s,72°C40s，40個循環；再10°C保溫。6、數據計算按照文獻(LivakKJ&SchmittgenTD(2001)Analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativePCRandthe2(-DeltaDeltaC(T))Method.Methods25(4)402-408)中提出的公式計算2(-ΔΔσ)的值。ΔΔCt=(CT,Target-C1,Actin)Timeχ-(Ct,Target-C1,Actin)Time0。Ct中C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數。PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期(對數期)，此時微小誤差尚未放大，Ct值的重現性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恒定的。Timeχ代表不同的處理時間點，TimeO代表處理的零占。圖5B中的數值為平均值士標準差。結果如圖5B所示，其中，1為無春化處理；2、3和4為分別進行2周、4周和6周的春化處理；S為春性小麥；MW為弱冬性小麥；W為冬性小麥。圖5B中的表達量用D基因組的特異引物(序列5和序列6)及綠色熒光染料進行實時定量PCR來檢測，以ACTIN作為內參。從圖5B中可以看出，總的趨勢為隨著低溫春化處理時間的延長，所有材料中Vrn-Dl的表達量均增加。對于春性小麥，未經春化處理也能檢測到一定量的Vrn-Dl的表達，隨著春化處理時間的延長，Vrn-Dl的表達量逐漸增加，但差異不顯著；在攜帶Vrn-Dlb基因的弱冬性小麥中，不經低溫處理，只能檢測到微量Vrn-Dl基因的表達，顯著低于春性小麥，給以2周低溫處理，Vrn-Dl的表達量略有增加，處理4周以后，Vrn-Dl的表達量顯著提高，以致能從營養生長向生殖生長轉變；冬性小麥的春化敏感性更強，低溫處理必須達到6周以上，才能使植株抽穗。這一結果表明啟動子區的胞嘧啶突變為腺嘌呤的確影響了Vrn-Dl基因的表達，且改變了材料的春化反應特性。權利要求一種輔助鑒定弱冬性小麥的方法，是以待測小麥的基因組DNA為模板，用序列表中序列1和序列2所示的引物進行PCR擴增，獲得第一輪PCR擴增產物；再以所述第一輪PCR擴增產物為模板，用序列表中序列3和序列4所示的引物進行PCR擴增，獲得第二輪PCR擴增產物，將所述第二輪PCR擴增產物用限制性內切酶BfaI進行酶切；若酶切產物為兩條帶，則待測小麥為弱冬性小麥；若酶切產物不為兩條帶，則待測小麥為候選非弱冬性小麥。2.輔助鑒定弱冬性小麥的引物，由兩對引物組成，其中一對引物的核苷酸序列如序列表中序列1和序列2所示，另一對引物的核苷酸序列如序列表中序列3和序列4所示。3.權利要求2所述引物在制備輔助鑒定弱冬性小麥試劑盒中的應用。4.權利要求2所述引物在輔助鑒定弱冬性小麥中的應用。5.一種輔助鑒定弱冬性小麥的試劑盒，包括核苷酸序列為序列表中序列3和序列4所示的一對引物和限制性內切酶BfaI。6.權利要求5所述試劑盒在輔助鑒定弱冬性小麥中的應用。全文摘要本發明公開了一種輔助鑒定弱冬性小麥的方法。以待測小麥的基因組DNA為模板，用序列表中序列1和序列2所示的引物進行PCR擴增，獲得第一輪PCR擴增產物；再以所述第一輪PCR擴增產物為模板，用序列表中序列3和序列4所示的引物進行PCR擴增，獲得第二輪PCR擴增產物，將所述第二輪PCR擴增產物用限制性內切酶BfaI進行酶切，若酶切產物為兩條帶，則待測小麥為弱冬性小麥；若酶切產物不為兩條帶，則待測小麥為候選非弱冬性小麥。發明的輔助鑒定弱冬性小麥的方法，可以在早期對小麥的春化習性進行判斷，以加快育種速度、降低育種成本，并具有操作簡單、成本低廉和周期短的優點，適于推廣應用，為小麥品種的春化習性鑒定提供了一種快捷的方法。文檔編號C12N15/11GK101805797SQ201010145950公開日2010年8月18日申請日期2010年4月9日優先權日2010年4月9日發明者周榮華,孫清明,賈繼增,高麗鋒申請人:中國農業科學院作物科學研究所