一種鑒別番茄耐鹽性狀的分子標記方法

專利名稱：：一種鑒別番茄耐鹽性狀的分子標記方法
技術領域：
：本發明涉及番茄耐鹽主效基因定位，DNA提取，PCR的擴增，在已有的RFLP標記信息基礎上設計PCR引物和限制性內切酶，把操作復雜、成本較高的RFLP標記轉化為操作簡單、成本適宜的CAPS標記，鑒別其該物種的耐鹽的性狀。
背景技術：
：鹽分是限制植物生長和產量的主要環境因素之一，土壤鹽漬化是一個世界性問題，其中由于過量施用化肥，造成土壤尤其是蔬菜保護地次生鹽漬化已是一個極其嚴重的現象，常障礙蔬菜作物的生長、發育，導致大幅度減產，產品品質下降。作物耐鹽新品種的選育，一直是國內外研究的重點，番茄(LycopersiconesculentumMill)是茄科番茄屬的一年生草本植物，屬中度鹽敏感型鮮食和加工型蔬菜作物，其在高鹽土壤上生育狀況差。國內外對番茄的耐鹽性進行了廣泛的研究。因此，為了豐富我國番茄品種的遺傳資源，改良番茄的耐鹽性，選育耐鹽性強、品味好的品種一直是番茄育種的重要目標。對番茄進行耐鹽性研究和耐鹽基因的轉化研究，也可為進一步研究其它雙子葉植物的耐鹽機制和耐鹽基因的轉化奠定基礎。目前番茄主要是以育苗移栽為主，因此番茄苗期耐鹽就顯的尤為重要，部分野生資源材料及個別栽培種表現出一定程度的耐鹽性，為番茄耐鹽育種提供了可能。利用分子標記及生物工程技術深入挖掘這些材料，可加速番茄耐鹽遺傳改良。經專利文獻檢索披露號為CN200910020964.1的《一種鑒別辣椒抗疫病性狀的分子標記方法》專利；號為CN200810197310.1的《一種與番茄抗病性狀相關的分子標記克隆劑應用》專利；號為CN200510010485.3的《一種鯉魚抗寒性狀的分子標記鑒定技術》的專利都涉及了PCR分子標記的研究，方法都比較復雜。本研究發明采用簡單易操作的PCR分子標記，可快速檢測番茄的耐鹽材料與鹽敏感材料，為利用分子標記輔助選育和基因工程等手段改良番茄耐鹽新品種提供了基礎，極大地加速了番茄耐鹽育種進程。
發明內容本發明的目在于獲得的PCR標記，可快速檢測番茄苗期耐鹽基因，且不受生長期，外界環境等的影響，是一種快速鑒定和評價番茄苗期耐鹽材料的方法。本發明的目的是這樣實現的一種鑒別番茄耐鹽性狀的分子標記方法，包括以下步驟1)耐鹽主效基因定位；2)人工設計合成一對核苷酸序列作為引物，該引物是由堿基組成的特定序列的寡聚體，其中正向引物5’GCCAATCCAAACAAACCA’3，反向引物5，CATTGTCTCCTTCGCCTCG，3；3)提取番茄基因組DNA，以此對引物將番茄基因組DNA進行PCR擴增，無需特異性內切酶酶切，就可得到有差異性的產物條帶，利用此引物對的差異性產物條帶就可鑒別出番茄耐鹽材料和鹽敏感材料；4)PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳、溴化乙錠染色，用凝膠成像系統觀察并拍照記錄，耐鹽材料PCR產物有lOOObp的1條譜帶，3鹽敏感材料有900bp的1條譜帶。所述的分子標記方法，利用番茄野生資源S.pennelliiLA716的76個漸滲系材料，通過耐鹽篩選，將7個耐鹽主效基因定位在番茄的5條染色體上，研究所用的漸滲系材料IL7-5-5的片斷上含有其中一個耐鹽主效基因。所述的分子標記方法，以CTAB法提取7-8片真葉時幼苗的DNA，用0.1XTE稀釋后貯存于-20°C的冰箱中備用。所述的分子標記方法，CAPS體系的建立采用50ng模板DNA，1.25UTaqDNA聚合酶，Mg2+終濃度為1.5mmol/L,dNTP濃度為0.25mmol/L,每個引物濃度為0.2umol/L,最終體積為25ul的PCR體系。所述的分子標記方法，PCR反應在MJPTC-200熱循環儀上進行，反應程序為94°C預變性3min；然后94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，共37個循環，最后72°C延伸10min，4°C保存。所述的分子標記方法，對引物的退火溫度進行優化篩選，分別設55°C、58°C和60°C的溫度梯度，比較結果。所述的分子標記方法，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，用1.5%的瓊脂糖凝膠(0.5XTBE緩沖液)，每樣品加5ulPCR產物，3ul上樣緩沖液，溴化乙錠染色，在Geldoc1000凝膠成像系統下檢測PCR產物，如果PCR擴增產物與預期結果一致，進一步將PCR產物用限制性內切酶消化。所述的分子標記方法，研究所用的限制性內切酶，除TaqI的限制性酶切反應溫度為65°C外，其余的限制性內切酶酶切反應溫度均為37°C，反應時間為4小時以上。所述的分子標記方法，限制性內切酶反應體系為1.5ul限制性內切酶緩沖液，0.2ul限制性內切酶，3.3ulddH20,10ulPCR產物。所述的分子標記方法，1.5%瓊脂糖凝膠電泳酶切產物，每樣品加8ul酶切產物，3ul上樣緩沖液，溴化乙錠染色，在Geldoc1000凝膠成像系統下檢測酶切產物。所述的分子標記方法，研究所用的RFLP標記的序列來源于Cornell大學，所有用作CAPS分析的引物，由上海生物技術工程服務有限公司合成，CAPS標記的名稱仍用原來的RFLP標記的名稱。本發明方法依據已定位耐鹽主效基因，根據已有的RFLP標記信息，設計PCR引物和限制性內切酶，把操作復雜、成本較高的RFLP標記轉化為操作簡單實用，成本適宜的CAPS標記，并直接利用這個CAPS標記對含耐鹽基因的植株進行篩選，從而進行番茄耐鹽的分子標記輔助育種，轉化CAPS標記后，大大提高了這些分子標記的應用范圍和作用效率。CAPS標記作為PCR和限制性內切酶酶切技術相結合的分子標記技術，可以從單個的堿基差異進行區分，并且可以把相同或相近的其他物種的RFLP、AFLP或COS標記轉化而來，這為創建穩定、可靠、簡便實用的共顯性標記提供了一條捷徑，在精密的分子圖譜構建、新的基因定位以及分子標記輔助育種中具有廣闊的應用前景。本方法對耐鹽漸滲系IL7-5_5(所屬片斷在番茄第7條染色體2.0-2.9cM之間)上的5個RFLP標記進行了CAPS引物設計、PCR體系優化和限制性內切酶分析，最終獲得了1個有多態性、可快速檢測耐鹽基因的CAPS標記。該標記(TG418)的PCR產物，在耐鹽材料中可擴增出長度為1000bp的片段，在鹽敏感材料中可擴增出長度為900bp的片段，此標記用于番茄耐鹽材料的鑒定與篩選，并建立了該標記的PCR優化體系，充分展現了該標記在標記輔助選擇等實際應用中的實用性。本發明構思鑒別番茄耐鹽性狀的分子標記方法，包括番茄基因組DNA的提取、PCR引物設計，PCR擴增，通過PCR反應，無需特異性內切酶酶切，就得到有差異性的產物條帶，利用此標記PCR擴增產物的大小可鑒別出番茄耐鹽材材料和鹽敏感材料。該方法用于番茄苗期耐鹽性篩選，能極大地加速番茄耐鹽育種進程，彰顯技術進步。附圖1、野生番茄S.pennelliiLA716的76個漸滲系群體第一個獨立試驗耐鹽數值分布，圖中橫坐標表示耐鹽數值，縱坐標表示耐鹽值頻率。附圖2、野生番茄S.pennelliiLA716的76個漸滲系群體第二個獨立試驗耐鹽數值分布，圖中橫坐標表示耐鹽數值，縱坐標表示耐鹽值頻率。附圖3、野生番茄S.pennelliiLA716的76個漸滲系群體第三個獨立試驗耐鹽數值分布，圖中橫坐標表示耐鹽數值，縱坐標表示耐鹽值頻率。附圖4、野生番茄S.pennelliiLA716的76個漸滲系群體第四個獨立試驗耐鹽數值分布，圖中橫坐標表示耐鹽數值，縱坐標表示耐鹽值頻率。附圖5、野生番茄S.pennelliiLA716的76個漸滲系群體耐鹽成活率分布以及與鹽敏感材料M82耐鹽值的對比，圖中橫坐標表示漸滲系材料，縱坐標表示耐鹽成活率。附圖6、番茄第2條染色體上兩個耐鹽基因定位圖。紅色箭頭表示所定位的耐鹽基因位點。附圖7、番茄第6、7、8條染色體上四個耐鹽基因定位圖。紅色箭頭表示所定位的耐鹽基因位點。附圖8、番茄第10條染色體上一個耐鹽基因定位圖。紅色箭頭表示所定位的耐鹽基因位點。附圖9、TG61標記的PCR擴增產物凝膠電泳圖前4個泳道為耐鹽漸滲系材料IL7-5-5的電泳結果，后2個泳道為鹽敏感材料M82的電泳結果。附圖10、TG61標記的PCR擴增產物經限制性內切酶DraI酶切后的凝膠電泳圖前4個泳道為耐鹽漸滲系材料IL7-5-5的電泳結果，后2個泳道為鹽敏感材料M82的電泳結果。附圖11、TG418標記PCR擴增產物的凝膠電泳圖，第一泳道為Marker，第2、3、4、5泳道為耐鹽漸滲系材料IL7-5-5的電泳結果，第6、7泳道為鹽敏感材料M82的電泳結果。附圖12、TG418標記PCR擴增產物的凝膠電泳圖，前3個泳道為鹽敏感材料M82的電泳結果，后3個泳道為耐鹽漸滲系材料IL7-5-5的電泳結果。如圖所示PCR標記TG418在耐鹽材料IL7-5-5與耐敏感材料M82之間可擴增出明顯的差異性條帶，在耐鹽材料IL7-5-5中可擴展出一條約lOOObp的譜帶，在鹽敏感材料M82中可擴增出一條約900bp的條帶。附核苷酸的序列表及光盤。具體實施例方式實施例5鑒別番茄耐鹽性狀的分子標記方法，包括以下步驟1)耐鹽主效基因定位，2)人工設計合成一對核苷酸序列作為引物，該引物是由堿基組成的特定序列的寡聚體，其中正向引物5，GCCAATCCAAACAAACCA，3，反向引物5，CATTGTCTCCTTCGCCTCG，3；3)提取番茄基因組的DNA，以引物對番茄基因組DNA進行PCR擴增，無需特異性酶切，就可得到有差異性的產物條帶，利用此標記中產物的大小可鑒別出番茄耐鹽材材料和感疫病材料；4)PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳、溴化乙錠染色，用凝膠成像系統觀察拍照的耐鹽植株PCR產物有lOOObp的1條譜帶，鹽敏感植株有900bp的1條譜帶。一、耐鹽基因定位1材料與方法1.1材料栽培種S.lycopersicumM82及來自S.pennelliiLA716的76個漸滲系(表1)。漸滲系群體是基于普通番茄S.lycopersicumM82遺傳背景，利用側翼標記，將野生種S.pennelliiLA716片段滲入構建，包括初始含有較長染色體片段的50個品系，及后來開發的含有較短片段的26個品系，這些含有較短片斷的品系與50個品系中的一些品系基本完全重疊，為精細定位提供了基礎。全套漸滲系基本覆蓋了野生種LA716的整個基因組，片段平均長度約12.3cM(Eshed等1992)。表176個漸滲系材料及其片斷在染色體上的位置761inesS.pennelliIntrogressionLines761inesS.pennelliIntrogressionLines427-1LA4028IL1-1427-39LA4089IL10-2427-2LA4031IL1-2427-40LA4091IL10-3427-3LA4032IL1-3427-41LA4092IL11-1427-4LA4033IL1-4427-42LA4093IL11-2427-5LA4037IL2-2427-43LA4094IL11-3427-6LA4038IL2-3427-44LA4095IL11-4427-7LA4039IL2-4427-45LA4097IL12-1427-8LA4040IL2-5427-46LA4099IL12-2427-9LA4041IL2-6427-47LA4100IL12-3427-10LA4043IL3-1427-48LA4102IL12-4427-11LA4044IL3-2427-49LA4029IL1-1-2427-12LA4046IL3-4427-50LA4030IL1-1-3427-13LA4047IL3-5427-51LA4034IL1-4-186<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>761inesS.pennelliIntrogressionLines761inesS.pennelliIntrogressionLines427-38LA4087IL10-1427-76LA4077IL8-3-11.2方法番茄種子播種在草炭、珍珠巖、蛭石(111)基質中，按常規田間管理。待幼苗長到4片真葉時，將幼苗根部的草炭、珍珠巖和蛭石清洗干凈，然后移栽到盛有1/2濃度的Hoagland標準營養液。每一個塑料容器15株，每一個塑料容器包括至少1株M82作為對照，日補充空氣三次、每次30分鐘，并每隔兩天將蒸發掉的水分用無離子水補充到原體積，一周后開始加鹽。每天按50mMNaCl+5mMCaCl2增加鹽濃度，直至終鹽濃度達到700mMNaCl+70mMCaCl2為止。共設置4次獨立的生物學重復試驗。耐鹽性調查參照FOOlad(2001)和Dasgan(2002)等方法。當鹽濃度達到終濃度后分別于第4天、第8天、第12天調查耐鹽級數，根據鹽害的癥狀(萎黃、壞疽、枯萎)按照耐鹽程度分為11個等級。具體分級標準如下0級完全致死。1級植株葉枯萎，莖干直立。2級植株葉枯萎，莖干直立且綠色。3級植株葉一半萎黃，一半枯萎。4級植株葉大部分萎黃，有少許萎縮綠葉。5級植株葉1/3綠色、2/3萎黃，綠葉萎縮嚴重。6級植株葉一半綠，一半萎黃，綠葉有萎縮。7級植株葉2/3葉綠色、1/3萎黃，綠葉有萎縮。8級葉全綠色，有萎縮。9級葉全綠色，有輕微萎縮。10級植株健康，沒有任何鹽害癥狀。1.3數據統計分析用SPSS13.0對分級數進行統計分析。根據Foolad等(2001)方法，首先將分級數轉換為成活百分率(成活百分率％=級數/IIx100)。表型值利用普通線性模型(GenerallinearModel,GLM)進行計算，成活百分率％=常數+基因型+試驗+基因型X試驗。試驗相關性采用Pearsoncorrelation進行。利用Durmett兩尾測驗進行方差分析，漸滲品系與對照M82耐鹽性差異達到顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)即判定為包含耐鹽基因。根據Semel等(2006)方法，每個耐鹽漸滲系片段包含位點被認為是一個耐鹽基因。2結果與分析2.1番茄4個獨立耐鹽試驗數據群體變異分析對上述76個漸滲系及M82進行了4個獨立試驗的耐鹽性鑒定。結果表明，4個試驗間存在一定差異(表2)，成活百分率介于32.5士1.2%與52.3士0.69%。每試驗76個漸滲系的變異符合正態分布(圖1、2、3、4)，說明來自野生種番茄S.permelliiLA716的耐鹽性屬于數量性狀，受多基因控制。表2S.permelliiLA716漸滲系群體4個獨立耐鹽試驗均值試驗均值標準誤個體數132.5%1.18%210234.9%1.18%210347.9%0.70%594452.3%0.69%62581.0000.372(**)0.2260.496(**)1.0000.245(*)0.453(**)1.0000.1781.000注**相關性在0.01水平達到顯著*相關性在0.05水平達到顯著表43個獨立試驗線性模型方差分析結果變異來源平方和自由度均方和F值顯著水校正模型276219.594(a)290952.4813.268.000截距2100625.34212100625.3427206.291.0000061]組內*組間91963.000211435.8441.495.000組內71149.47576936.1773.212.000組間92859.430330953.143106.186.000誤差392940.3961348291.499總變異4131983.4711639校正總變異669159.99016382.3苗期耐鹽QTL定位利用Durmett兩尾測驗方差分析結果表明，10個漸滲系(IL2_1_1、IL2_6、IL6-2、IL6-4、IL7-1、IL7-5、IL7-4-1、IL7-5-5、IL8-3-1、IL10-1-1)與M82成活百分率差異達到顯著或極顯著水平(表5)，這些漸滲系應該包含耐鹽位點。由于來自S.permelliiLA716的漸滲系群體由50個片段較長的IL和26個片段間斷的亞漸滲系(Sub-IL)組成，而26個Sub-IL是基于50個初漸滲系構建的，因此Sub-IL均與50個IL的一些品系所包含的片段重疊，重疊區域不僅可用于驗證所包含的耐鹽基因位點，而且還可以進一步確定耐鹽基因所在的區段(圖6、圖7、圖8)。本研究所鑒定的10個耐鹽漸滲系中，IL2-1-1、IL7-4-1、2.2番茄4個獨立耐鹽試驗之間的相關性分析由表3知，試驗1、2、4相互間相關性都達到了極顯著，試驗3與試驗2之間的相關性達到顯著，而與試驗1和試驗4的相關性未達到顯著。這與上述試驗間變化結論相一致，說明不同試驗間存在一定差異。根據相關性，試驗1、2、4用于終結果方差分析(表4)。結果表明，試驗3缺失只影響耐鹽QTL的顯著性。試驗間和品系間差異均達到極顯著。說明不同試驗間存在一定的差異，而且不同品系耐鹽性也不同。利用線性模式對選取的3個試驗進行分析結果表明，對照M82的成活百分率為31.89%，76個漸滲系苗期耐鹽存活率介于15.28%-61.52%之間，其中65個株系的耐鹽性比對照高，其成活百分率介于32.07%-61.52%之間(圖5)。表34個耐鹽試驗之間的相關性分析相關性試驗2試驗3試驗4試驗1試驗2試驗3試驗49IL10-1-1、IL7-5-5、IL8-3-1均為Sub_IL，與它們有部分或者全部重疊的IL詳列表4。通過不同品系重疊區域確定，鑒定出來自S.permellii的8個耐鹽基因可明顯提高番茄苗期成活率，它們可較對照M82增加18.9%-83.8%，分布在番茄2、6、7、8、10等5條染色體上。例如包含耐鹽基因Stq7a的IL7-1，耐鹽成活率與M82達到了極顯著差異，IL7-2與其完全重疊，IL7-2也表現較好的耐鹽性且P值較低，因此確認該區段包含此耐鹽基因位點。而耐鹽基因Stq6比較特殊，雖然IL6-4表現很好的耐鹽性，但是與其完全重疊的IL6-3卻表現為對鹽極其敏感，因此該基因位點有待于更多的試驗進一步確定。表5耐鹽QTL的鑒定及重疊片段耐鹽性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>二、一種鑒別番茄耐鹽性狀的分子標記方法1、材料與方法1.1試驗材料試驗材料為M82和以M82為遺傳背景的漸滲系材料IL7-5-5，其中漸滲系IL7-5-5在第7條染色體2.0-2.9cM的片斷上，此片斷已被證實含有一個耐鹽的主效基因。1.2引物設計實驗所用RFLP標記的序列來源于Cornell大學；人工設計CAPS引物序列；由上海生物技術工程服務有限公司合成；CAPS標記的名稱仍用原來的RFLP標記的名稱(見表6)。表6根據RFLP標記序列設計的CAPS引物<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>1.3DNA提取實驗材料播種于溫室，待幼苗長到7-8片真葉時，參照姜靜(2003)的《分子生物學實驗原理與技術》的CTAB法提取嫩葉DNA，用0.IXTE稀釋后貯存于_20°C的冰箱中備用。1.4CAPS體系的建立CAPS體系參照王孝宣等(2004)方法，并進行了一定程度的優化，最終采用50ng模板DNA，1.25UTaqDNA聚合酶，Mg2+終濃度為1.5mmol/L,dNTP濃度為0.25mmol/L,每個引物濃度為0.2umol/L，最終體積為25ul的PCR體系。PCR反應在MJPTC-200熱循環儀上進行，反應程序為94°C預變性3min；然后94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，共37個循環，最后72°C延伸lOmin。實驗對PCR的退火溫度進行優化篩選，分別設55°C、58°C和60°C的溫度梯度，比較結果。1.5電泳檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，1.5%的瓊脂糖凝膠(0.5XTBE緩沖液)，每樣品加5ulPCR產物，3ul上樣緩沖液，溴化乙錠染色，在Geldoc1000凝膠成像系統下檢測PCR產物，如果PCR擴增產物與預期結果一致，就對PCR產物用限制性內切酶消化。1.6限制性內切酶消化根據PCR的引物序列與限制性內切酶的切割位點的多少和位置決定對引物序列采用哪種或哪幾種限制性內切酶。限制性內切酶反應體系為1.5ul限制性內切酶緩沖液，0.2ul限制性內切酶，3.3ulddH20,IOulPCR產物。試驗中除TaqI的限制性酶切反應溫度為65°C外，其余的限制性酶切反應溫度均為37°C，反應時間為4小時以上；1.5%瓊脂糖凝膠電泳酶切產物，每樣品加Sul酶切產物，3ul上樣緩沖液，溴化乙錠染色。2、試驗結果標記TG61、TG113、CT52經過PCR體系的優化篩選，退火溫度均為58°C時獲得了預期的PCR產物，但是經過設計的相應限制性內切酶消化后，在IL7-5-5和M82之間沒有顯示切開，這可能需更多的限制性內切酶進行消化分析(表7，圖9、圖10)。標記TG418經過PCR體系的優化篩選，在退火溫度60°C時獲得了預期的PCR產物，在酶切前進行PCR產物檢測，在IL7-5-5與M82之間產生了多態性，在IL7-5-5產生一條帶，其特征普帶分子量約為lOOObp，在M82也得到一條帶，其特征普帶分子量約為900bp，這種在酶切前進行的PCR產物檢測，其多態性稱為ALP，此標記更簡單實用，比需用限制性內切酶酶切的CAPS標記成本更低廉、操作更簡單。此結果與預期的RFLP標記一致，說明該RFLP標記可轉化為PCR標記(表7，圖11、圖12)。表7番茄RFLP標記轉化為CAPS的結果I火溫度標記PCR結果限制性內切酶多態性TG61無普帶TG113弱普帶55°CTG418弱普帶TG131無普帶_CT52弱普帶_TG61WTaqI/HinfI/EcorI/DraI無/無/無/無^TG113好TaqI/AluI/EcorII/DraI無/無/無/無58°CTG418多普帶TG131無普帶_CT52_U_TaqI/AluI/HinfI/XbalI無/無/無/無TG61弱普帶TGl13弱普帶60°CTG418好好(ALP)TG131無普帶_CT52弱普帶_權利要求一種鑒別番茄耐鹽性狀的分子標記方法，其特征在于，包括以下步驟1)耐鹽主效基因定位；2)人工設計合成一對核苷酸序列作為引物，該引物是由堿基組成的特定序列的寡聚體，其中正向引物5’GCCAATCCAAACAAACCA’3，反向引物5’CATTGTCTCCTTCGCCTCG’3；3)提取番茄基因組DNA，以此對引物將番茄基因組DNA進行PCR擴增，無需特異性內切酶酶切，就可得到有差異性的產物條帶，利用此引物對的差異性產物條帶就可鑒別出番茄耐鹽材料和鹽敏感材料；4)PCR產物在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳、溴化乙錠染色，用凝膠成像系統觀察并拍照記錄，耐鹽材料PCR產物有1000bp的1條譜帶，鹽敏感材料有900bp的1條譜帶。2.按照權利要求1所述的分子標記方法，其特征在于利用番茄野生資源S.permelliiLA716的76個漸滲系材料，通過耐鹽篩選，將7個耐鹽主效基因定位在番茄的5條染色體上，研究所用的漸滲系材料IL7-5-5的片斷上含有其中一個耐鹽主效基因。3.按照權利要求1所述的分子標記方法，其特征在于以CTAB法提取7-8片真葉時幼苗的DNA，用0.lxTE稀釋后貯存于-20°C的冰箱中備用。4.按照權利要求1所述的分子標記方法，其特征在于CAPS體系的建立采用50ng模板DNA,1.25UTaqDNA聚合酶，Mg2+終濃度為1.5mmol/L,dNTP濃度為0.25mmol/L,每個引物濃度為0.2umol/L，最終體積為25ul的PCR體系。5.按照權利要求1所述的分子標記方法，其特征在于PCR反應在MJPTC-200熱循環儀上進行，反應程序為94°C預變性3min；然后94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，共37個循環，最后72°C延伸10min，4°C保存。6.按照權利要求1所述的分子標記方法，其特征在于對引物的退火溫度進行優化篩選，分別設55°C、58°C和60°C的溫度梯度，比較結果。7.按照權利要求1所述的分子標記方法，其特征在于瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，用1.5%的瓊脂糖凝膠(0.5XTBE緩沖液)，每樣品加5ulPCR產物，3ul上樣緩沖液，溴化乙錠染色，在Geldoc1000凝膠成像系統下檢測PCR產物，如果PCR擴增產物與預期結果一致，進一步將PCR產物用限制性內切酶消化。8.按照權利要求1所述的分子標記方法，其特征在于研究所用的限制性內切酶，除TaqI的限制性酶切反應溫度為65°C外，其余的限制性內切酶酶切反應溫度均為37°C，反應時間為4小時以上。9.按照權利要求1所述的分子標記方法，其特征在于限制性內切酶反應體系為1.5ul限制性內切酶緩沖液，0.2ul限制性內切酶，3.3ulddH20,10ulPCR產物。10.按照權利要求1所述的分子標記方法，其特征在于1.5%瓊脂糖凝膠電泳酶切產物，每樣品加8ul酶切產物，3ul上樣緩沖液，溴化乙錠染色，在Geldoc1000凝膠成像系統下檢測酶切產物。11.按照權利要求1所述的分子標記方法，其特征在于研究所用的RFLP標記的序列來源于Cornell大學，所有用作CAPS分析的引物，由上海生物技術工程服務有限公司合成，CAPS標記的名稱仍用原來的RFLP標記的名稱。全文摘要本發明提供的一種鑒別番茄耐鹽性狀的分子標記方法，包括以下步驟1)番茄耐鹽主效基因定位；2)人工設計合成一對核苷酸序列作為引物，該引物是由堿基組成的特定序列的寡聚體，其中正向引物5’GCCAATCCAAACAAACCA’3，反向引物5’CATTGTCTCCTTCGCCTCG’3；3)提取番茄基因組的DNA，利用引物對番茄基因組DNA進行PCR擴增，無需特異性內切酶酶切，就可得到有差異的產物條帶，利用此標記PCR產物片斷的大小可鑒別出番茄耐鹽材料和鹽敏感材料；4)PCR產物在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳、溴化乙錠染色，用凝膠成像系統觀察拍照得耐鹽材料PCR產物有1000bp的1條譜帶，鹽敏感材料有900bp的1條譜帶。方法步驟為定位耐鹽基因，選用含有耐鹽基因的漸滲系片斷，提取幼苗的DNA；建立CAPS反應體系；將PCR產物選用限制性內切酶消化控制等。文檔編號C12Q1/68GK101831497SQ20101016815公開日2010年9月15日申請日期2010年5月11日優先權日2010年5月11日發明者余慶輝,帕提古麗,楊濤,楊生保,王柏柯申請人:新疆農業科學院園藝作物研究所