專利名稱：一種提高alpha半乳糖苷酶活力持續性的方法
技術領域：
本發明涉及一種生物工程領域，特別涉及一種在釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)細胞壁外表面展露表達alpha半乳糖苷酶以提高該酶活力持續性的方法。
背景技術：
飼料中含有水蘇糖等含α半乳糖苷的動物腸道消化酶難以消化的糖類，不僅影響動物對碳水化合物的消化吸收，而且會提高單胃動物消化道粘度，妨礙動物腸道消化酶對飼料中其它營養成分的消化吸收。在飼料中添加α半乳糖苷酶可望有效去除水蘇糖等對動物消化功能的不利影響。但酶活力持續性不足是目前應用的α半乳糖苷酶存在的一個問題。包括α半乳糖苷酶在內的各種酶的重組表達方式有細胞內表達和分泌表達兩種，這兩種酶的重組表達方式使酶分子與宿主細胞之間沒有關聯，即酶分子不是宿主細胞的組成部分，從而很容易失活。 如果使酶分子成為細胞的有機組成部分，則只要細胞保持存活狀態酶分子也會保持活力， 從而可以顯著提高酶的活力持續性。本發明開發一種使α半乳糖苷酶成為釀酒酵母細胞有機組成的技術，即將α半乳糖苷酶與釀酒酵母細胞壁成分FLO連接而成為釀酒酵母細胞的組成部分，只要釀酒酵母細胞保持存活則α半乳糖苷酶始終保持活性狀態，從而顯著提高了 α半乳糖苷酶活力持續性。
發明內容
針對現有的α半乳糖苷酶活力持續性不足的問題，本發明提供一種使α半乳糖苷酶成為釀酒酵母細胞有機組成部分的技術，使α半乳糖苷酶只要釀酒酵母細胞保持存活即可保持活力，從而顯著提高α半乳糖苷酶活力持續性。本發明的一種提高alpha半乳糖苷酶活力持續性的方法，包括以下步驟將alpha半乳糖苷酶基因連接在釀酒酵母細胞壁成份FLO序列的N端，然后插入釀酒酵母表達載體GALl啟動子下游MF α 1信號肽序列的C端，構建成表達框，表達框從N 端到C端GAL1啟動子+MF α 1信號肽序列+alpha半乳糖苷酶基因+FLO序列；將包含該表達框的酵母質粒轉化入釀酒酵母細胞。將包含“權利要求1”所述表達框的釀酒酵母細胞培養于添加有重量百分比 3. 5-7%半乳糖的YPD培養基中。本發明的優點將α半乳糖苷酶與釀酒酵母細胞壁成分FLO連接，如此則只要釀酒酵母細胞保持存活狀態，α半乳糖苷酶即可保持活力。
具體實施方式
實施例1 α半乳糖苷酶展露表達將α半乳糖苷酶基因(來自釀酒酵母&iccharomyces cerevisiae, Genbank號 X03102)連接在釀酒酵母細胞壁成份FLO序列(來自釀酒酵母&iccharomyces cerevisiae, Genbank號S73336)的N端，然后插入釀酒酵母表達載體GALl啟動子(來自釀酒酵母表達載體PYES263，Genbank號AY42807》下游MF α 1信號肽序列(來自釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae，Genbank 號Μ17301)的 C 端，構建成表達框(從 N 端到 C 端) GALl啟動子+MF α 信號肽序列+ α半乳糖苷酶基因+FLO序列。將包含該表達框的釀酒酵母質粒轉化入釀酒酵母細胞(Saccharomyces cerevisiae，購自安琪酵母股份有限公司)， 則MF α 信號肽將引導α半乳糖苷酶向釀酒酵母細胞外分泌，而α半乳糖苷酶下游的 FLO序列則錨定在釀酒酵母細胞壁中，從而使α半乳糖苷酶展露表達在釀酒酵母細胞壁外表面。實施例2 α半乳糖苷酶展露表達的誘導在培養釀酒酵母的YPD培養基中，添加3. 5-7%半乳糖(購自上海生工生物工程有限公司，Shanghai Sangon Biological Engineering Technology&ServicesCo·，Ltd·)，則表達框“GAL1啟動子+MF α 信號肽序列+α半乳糖苷酶基因+FLO序列”中的GALl啟動子就會活化，誘導α半乳糖苷酶在釀酒酵母細胞壁外表面展露表達。實施例3半乳糖對α半乳糖苷酶展露表達的作用在培養釀酒酵母的YPD培養基中，如果不含半乳糖，則未檢測到α半乳糖苷酶活性，這是因為表達框“GAL1啟動子+MF α 信號肽序列+α半乳糖苷酶基因+FLO序列”中的GALl啟動子無法活化。實施例4 α半乳糖苷酶展露表達后其活力持續性顯著提高按照實施例1和實施例2所示步驟進行展露表達的α半乳糖苷酶活性為
mL (3. 5 %半乳糖)和678U/mL (3. 5_7 %半乳糖)，半衰期均為73天，即第73天時能保持起始活性的一半。而如果在實施例1和實施例2所示的展露表達表達框“GAL1啟動子+MF α 1 信號肽序列+α半乳糖苷酶基因+FLO序列”中去除FLO序列，則α半乳糖苷酶進行分泌表達，活性為228U/mL(3. 5%半乳糖)和216U/mL(3. 5_7%半乳糖)，半衰期均僅為5天，即第 5天時能保持起始活性的一半。因此，將α半乳糖苷酶與釀酒酵母細胞壁成分FLO連接而成為釀酒酵母細胞的組成部分，只要釀酒酵母細胞保持存活則α半乳糖苷酶始終保持活性狀態，從而顯著提高了 α半乳糖苷酶活力持續性。α半乳糖苷酶活性單位U定義為在37°C、pH 5. 0的條件下，1分鐘內從0. 01摩爾 / 升的 pNPG(p-nitrophenyl-alpha-D-galactopyranoside，購自上海生工生物工程有限公司，Shanghai Sangon Biological Engineering Technology&Services Co. , Ltd.)溶液中釋放出1微摩爾pNP(p-nitrophenyl p-nitrophenyl，購自上海生工生物工程有限公司， Shanghai Sangon Biological EngineeringTechnology&Services Co.，Ltd.)所需要白勺 α 半乳糖苷酶酶量為IU。最后，需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例子，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種提高alpha半乳糖苷酶活力持續性的方法，其特征在于包括以下步驟將alpha半乳糖苷酶基因連接在釀酒酵母細胞壁成份FLO序列的N端，然后插入釀酒酵母表達載體GALl啟動子下游MF α 1信號肽序列的C端，構建成表達框，表達框從N端到 C端GAL1啟動子+MF α 1信號肽序列+alpha半乳糖苷酶基因+FLO序列；將包含該表達框的酵母質粒轉化入釀酒酵母細胞。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于將包含“權利要求1”所述表達框的釀酒酵母細胞培養于添加有重量百分比3. 5-7%半乳糖的YPD培養基中。
全文摘要
本發明的一種提高alpha半乳糖苷酶活力持續性的方法，包括以下步驟將alpha半乳糖苷酶基因連接在釀酒酵母細胞壁成份FLO序列的N端，然后插入釀酒酵母表達載體GAL1啟動子下游MFα1信號肽序列的C端，構建成表達框，表達框從N端到C端GAL1啟動子+MFα1信號肽序列+alpha半乳糖苷酶基因+FLO序列；將包含該表達框的酵母質粒轉化入釀酒酵母細胞。本發明的優點將α半乳糖苷酶與釀酒酵母細胞壁成分FLO連接，如此則只要釀酒酵母細胞保持存活狀態，α半乳糖苷酶即可保持活力。
文檔編號C12N15/81GK102242094SQ20101017180
公開日2011年11月16日 申請日期2010年5月14日 優先權日2010年5月14日
發明者何國慶, 周陳偉, 廖文艷, 徐娟, 王睿之, 阮暉, 陳美齡, 陳赟, 馬風蘭 申請人:浙江大學