專利名稱：一種提高谷氨酸脫羧酶活力持續性的方法
技術領域：
本發明涉及一種生物工程領域，特別涉及一種在釀酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)細胞壁外表面展露表達谷氨酸脫羧酶以提高該酶活力持續性的方法。
背景技術：
Y-氨基丁酸是一種天然健康因子，具有明顯降血壓作用。谷氨酸經谷氨酸脫羧酶轉化可一步生成Y-氨基丁酸。但目前應用的谷氨酸脫羧酶存在酶活力持續性不足這一問題。包括谷氨酸脫羧酶在內的各種酶的重組表達方式有細胞內表達和分泌表達兩種，這兩種酶的重組表達方式使酶分子與宿主細胞之間沒有關聯，即酶分子不是宿主細胞的組成部分，從而很容易失活。如果使酶分子成為細胞的有機組成部分，則只要細胞保持存活狀態酶分子也會保持活力，從而可以顯著提高酶的活力持續性。本發明開發一種使谷氨酸脫羧酶成為釀酒酵母細胞有機組成的技術，即將谷氨酸脫羧酶與釀酒酵母細胞壁成分FLO連接而成為釀酒酵母細胞的組成部分，只要釀酒酵母細胞保持存活則谷氨酸脫羧酶始終保持活性狀態，從而顯著提高了谷氨酸脫羧酶活力持續性。
發明內容
針對現有的谷氨酸脫羧酶活力持續性不足的問題，本發明提供一種使谷氨酸脫羧酶成為釀酒酵母細胞有機組成部分的技術，使谷氨酸脫羧酶只要釀酒酵母細胞保持存活即可保持活力，從而顯著提高谷氨酸脫羧酶活力持續性。本發明的一種提高谷氨酸脫羧酶活力持續性的方法，包括以下步驟將谷氨酸脫羧酶基因(Genbank號NM_168056)連接(常規方法)在釀酒酵母細胞壁成份FLO序列(Genbank號S73336)的N端，然后插入(常規方法)釀酒酵母表達載體GALl啟動子(Genbank號:AY428072)下游MF α 1信號肽序列(Genbank號Μ17301)的 C端，構建成表達框，表達框從N端到C端GAL1啟動子+MF α 1信號肽序列+谷氨酸脫羧酶基因+FLO序列；將包含該表達框的酵母質粒轉化入釀酒酵母細胞。將包含上述表達框的釀酒酵母細胞培養于添加有6. 5-8. 5% (重量百分比)半乳糖(普通半乳糖)的YPD培養基中。本發明的優點將谷氨酸脫羧酶與釀酒酵母細胞壁成分FLO連接，如此則只要釀酒酵母細胞保持存活狀態，谷氨酸脫羧酶即可保持活力。
具體實施例方式以下通過實施例進一步對本發明進行描述
實施例1谷氨酸脫羧酶展露表達
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將谷氨酸脫羧酶基因(來自Drosophila melanogaster, Genbank 號NM_168056) 連接在釀酒酵母細胞壁成份FLO序列(來自釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae, Genbank 號S73336)的N端，然后插入釀酒酵母表達載體GALl啟動子(來自釀酒酵母表達載體 pYES^3，Genbank 號AY^8072)下游 MF α 1 信號肽(來自釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae，Genbank號Μ17301)序列的C端，構建成表達框(從N端到C端)GAL1啟動子+MF α 1信號肽序列+谷氨酸脫羧酶基因+FLO序列。將包含該表達框的釀酒酵母質粒轉化入釀酒酵母細胞(Saccharomyces cerevisiae，購自安琪酵母股份有限公司)，則MF α 1 信號肽將引導谷氨酸脫羧酶向釀酒酵母細胞外分泌，而谷氨酸脫羧酶下游的FLO序列則錨定在釀酒酵母細胞壁中，從而使谷氨酸脫羧酶展露表達在釀酒酵母細胞壁外表面。實施例2谷氨酸脫羧酶展露表達的誘導在培養釀酒酵母的YPD培養基中，添加6. 5-8. 5%半乳糖(購自上海生工生物工程有限公司，Shanghai Sangon Biological Engineering Technology&ServicesCo. , Ltd.), 則表達框“GALl啟動子+MF α 1信號肽序列+谷氨酸脫羧酶基因+FLO序列”中的GALl啟動子就會活化，誘導谷氨酸脫羧酶在釀酒酵母細胞壁外表面展露表達。實施例3半乳糖對谷氨酸脫羧酶展露表達的作用在培養釀酒酵母的YPD培養基中，如果不含半乳糖，則未檢測到谷氨酸脫羧酶活性，這是因為表達框“GAL1啟動子+MF α 1信號肽序列+谷氨酸脫羧酶基因+FLO序列”中的GALl啟動子無法活化。實施例4谷氨酸脫羧酶展露表達后其活力持續性顯著提高按照實施例1和實施例2所示步驟進行展露表達的谷氨酸脫羧酶活性為2005U/ mL (6. 5%半乳糖)和2014U/mL(8. 5%半乳糖)，半衰期均為75天，即第75天時能保持起始活性的一半。而如果在實施例1和實施例2所示的展露表達表達框“GAL1啟動子+MF α 1 信號肽序列+谷氨酸脫羧酶基因+FLO序列”中去除FLO序列序列，則谷氨酸脫羧酶進行分泌表達，活性為1156U/mL(6. 5%半乳糖)和1130U/mL(8. 5%半乳糖)，半衰期均僅為8天， 即第8天時能保持起始活性的一半。因此，將谷氨酸脫羧酶與釀酒酵母細胞壁成分FLO連接而成為釀酒酵母細胞的組成部分，只要釀酒酵母細胞保持存活則谷氨酸脫羧酶始終保持活性狀態，從而顯著提高了谷氨酸脫羧酶活力持續性。谷氨酸脫羧酶活性單位U定義為在0.05mol/L谷氨酸(購自上海生工生物工程有限公司，Shanghai Sangon Biological Engineering Technology&ServicesCo. , Ltd.) 中，每分鐘催化生成lymol Y-氨基丁酸(標準品購自上海生工生物工程有限公司， Shanghai Sangon Biological Engineering Technology&ServicesCo. ,Ltd.)所需的酶量為一個活力單位(U)。最后，需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例子，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種提高谷氨酸脫羧酶活力持續性的方法，其特征在于包括以下步驟將谷氨酸脫羧酶基因連接在釀酒酵母細胞壁成份FLO序列的N端，然后插入釀酒酵母表達載體GALl啟動子下游MF α 1信號肽序列的C端，構建成表達框，表達框從N端到C端 GALl啟動子+MF α 1信號肽序列+谷氨酸脫羧酶基因+FLO序列；將包含該表達框的酵母質粒轉化入釀酒酵母細胞。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于將包含“權利要求1”所述表達框的釀酒酵母細胞培養于添加有重量百分比6. 5-8. 5%半乳糖的YPD培養基中。
全文摘要
本發明的一種提高谷氨酸脫羧酶活力持續性的方法，包括以下步驟將谷氨酸脫羧酶基因(Genbank號NM_168056)連接(常規方法)在釀酒酵母細胞壁成份FLO序列(Genbank號S73336)的N端，然后插入(常規方法)釀酒酵母表達載體GAL1啟動子(Genbank號AY428072)下游MFα1信號肽序列(Genbank號M17301)的C端，構建成表達框，表達框從N端到C端GAL1啟動子+MFα1信號肽序列+谷氨酸脫羧酶基因+FLO序列；將包含該表達框的酵母質粒轉化入釀酒酵母細胞。本發明的優點將谷氨酸脫羧酶與釀酒酵母細胞壁成分FLO連接，如此則只要釀酒酵母細胞保持存活狀態，谷氨酸脫羧酶即可保持活力。
文檔編號C12N15/81GK102242106SQ20101017181
公開日2011年11月16日 申請日期2010年5月14日 優先權日2010年5月14日
發明者何國慶, 周陳偉, 廖文艷, 徐娟, 王睿之, 阮暉, 陳美齡, 陳赟, 馬風蘭 申請人:浙江大學