專利名稱：長效沉默食管癌細胞HIF-1α基因的21ShRNA熒光表達載體的構建的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥技術領域，尤其是提供一種長效沉默食管癌細胞HIF-I α基 因的21ShRNA熒光表達載體的構建。
背景技術：
食管癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，提高食管癌治療效果的關鍵是早期發現、 早期診斷、早期治療。缺氧誘導因子-1是一種DNA結合蛋白，首次發現是可激活人EPO基因轉錄以應對 缺氧環境，隨后發現HIF-I可以激活轉錄人VEGF基因。HIF-I活性受細胞水平HIF-I α亞 基調控，它與缺氧誘導因子-1 β (HIF-1 β ) 二聚化，形成活性轉錄因子。HIF-I在常氧細胞 中很難檢測到，缺氧的條件下很快被激活，HIF-I活化后其靶基因表達上調，誘導多數編程 性細胞保護反應，如抗缺氧、抗缺血或抗損傷，即誘導促紅細胞生成素、血管內皮生長因子 和其它血管生成相關因子的基因表達，誘導糖代謝和葡萄糖轉運相關基因(GLUT1，ALD0A， ENO1，HKl，ΗΚ2，LDHA和PGK1)的表達，從而有助于改善細胞營養不良環境，據報道HIF-I可 激活多達近百個靶基因。缺氧會給細胞帶來嚴重的生存壓力，氧平衡需要一系列基因的協同調節。在多種 類型細胞中，當氧含量降低時可調控轉錄復合體缺氧誘導因子I(HIF-I)的表達。實體瘤內 的微環境完全不同于正常組織，其特點是氧分壓遠遠低于正常生理水平。人類超過一半的 中晚期原位癌有缺氧區，氧濃度比周圍正常組織大大降低。實體瘤內缺氧不僅因為腫瘤快 速增殖，而且因為血管結構和功能異常使腫瘤得不到足夠的營養物和氧。實體瘤組織往往 過表達HIF-I α并激活有關腫瘤血管生成、腫瘤的生長、侵襲和轉移等有關調節途徑。報道 表明食管癌中存在HIF-I α的活化現象，且HIF-I α蛋白表達水平和病人存活時間呈負相 關。由于HIF-I促進腫瘤細胞適應其惡劣環境因而使缺氧腫瘤細胞能抵抗癌癥治療，如抗 化學治療和抗輻射治療，Schwartz DL用HIF-I抑制劑PX-478降低輻射誘導的VEGF的表 達，結果提高了異種移植腫瘤對放射治療敏感性。鑒于以上研究結論，HIF-I α可能成為食 管癌及其他腫瘤診斷與治療的新靶標分子。RANi是自然界普遍存在的導致基因沉默的生物現象。1998年，Fire A等首次提出 了 RNA干擾學說。其基本原理是siRNA與互補的mRNA結合形成沉默復合體，導致mRNA降 解而使目的基因表達沉默。RNA干擾是由長的雙鏈RNA分子發動的，該分子可以被Di cer enzyme加工成長度為21-23個核苷酸的RNA，然后這種小的干擾RNA分子摻入RNA誘導的沉 默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，引導核酸酶降解靶RNA，從而產生RNA 干擾。這使得構建表達shRNA的干擾載體，從而使哺乳動物細胞內基因表達長期沉默成為 可能。光動力學療法(Photodynamic therapy, PDT)是近20年來應用于淺表腫瘤臨床 治療的一種非手術替代療法，經口服或局部應用的光敏劑能選擇性積蓄于腫瘤細胞和組織內，在分子氧的存在下，經特定波長的可見光激發能產生單態氧和氧自由基等活性物質，導 致腫瘤細胞凋亡或壞死。增強腫瘤細胞對PDT作用的敏感性是提高PDT療效的重要思路之一。由于光動力 學效應需依賴于分子氧的存在，但在多數實體瘤中往往存在缺氧狀態，因而氧分子的不足 可能會導致PDT效果的下降，而且缺氧狀態也導致腫瘤細胞對許多治療方式(如放療和化 療)的抵御作用。缺氧誘導因子-Ia(HIF-Ia)是細胞缺氧信號轉導途徑中的主要轉錄因 子，能激活許多基因的表達，與細胞的存活、增殖、血管生成及遷移相關。除此以外，最近的 研究報道亦證實HIF-I α在調節細胞凋亡方面起作用。由于誘導細胞凋亡是臨床PDT對腫 瘤細胞的重要殺傷機制之一，因而缺氧和/或HIF-I α的表達水平有可能影響到PDT的殺 傷效應
發明內容
本發明的目的在于提供一種長效沉默食管癌細胞HIF-I α基因的21ShRNA熒光表 達載體的構建，用于抑制食管癌細胞HIF-I α蛋白表達，不僅為提高光動力學對早期食管 癌的療效提供新方法，還為其他惡性腫瘤的藥物開發和基因治療提供新材料。為實現上述目的，本發明可采取下述技術方案本發明所述的-種長效沉默食管癌細胞HIF-I α基因的2IShRNA熒光表達載體的 構建，包括下述步驟(1)從NCBI獲取ΝΜ_001530. 3，利用WHITEH0USE軟件進行預測分析由21個核苷酸 組成的干擾序列，GC含量控制在30% -50% ；同時利用SiDirect在線設計軟件，將已獲得 的mRNA序列全長輸入待預測序列框，選擇設計方針為雷諾方程，GC含量控制在30 %-50%, 運行遠程預測程序，獲得預測結果；(2)以NCBI的Nucleotide Blast對各個預測的核苷酸序列進行比對，設計得到一 條21核苷酸的HIF-I α的干擾序列，正義鏈為5’ CAGCAGACTCAAATACAAGAA3’的寡核苷酸 干擾序列，G C比為36. 8%，同時合成一條與人類基因無同源性的陰性對照序列neg ；(3)依據質粒的插入位點和接頭結構設計編碼shRNA的單鏈DNA oligos，在正義 鏈序列5’加入GATCCC，中部加入TTCAAGAGA結構的loop環，3’端加TTTTTGGAT ；反義鏈設 計5，加入AGCTATCCAAAAA，中部加入TTCAAGAGA結構的loop環，3，端加GG，最終連接入載 體的編碼 shRNA 的 DNA 序列為正向GATCCCCAGCAGACTCAAATACAAGAATTCAAGAGATTCTTGTAT TTGAGTCTGCTGTTTTTGGAT,反向AGCTATCCAAAAACAGCAGACTCAAATACAAGAATCTCTTGAATTCTTGT ATTTGAGTCTGCTGGG ；(4)單鏈DNA oligo退火生成雙鏈oligo，雙鏈oligo連接pEZsiRNA6. 1載體， BamH I和Hind III對載體進行雙酶切，按照20 μ 1反應體系進行連接反應，16°C連接過 夜，冰浴并轉化感受態DH5 α，用含100mg/l氨芐霉素瓊脂平板篩選陽性克隆，提取得到 pEZsiRNA6. Ihif-I α 重組質粒。本發明的優點在于利用SiRNA原理，通過SiRNA序列設計原理設計HIF-I α 干擾序列，并通過優化改造構建帶有綠色熒光標簽的shRNA長效干擾表達載體，得到 pEZsiRNA6. Ihif-I α干擾表達載體，能夠得到長效沉默HIF-I α蛋白表達的穩定細胞 系，并且可在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，并且通過western blot實驗驗證能夠抑制HIF-I α蛋白表達，證明穩定細胞系構建成功。本發明為研究HIF-I α影響食管鱗癌PDT療效的分子機制提供長效沉默HIF-I α誘導表達的食管癌細胞系奠定基礎。
圖1是本發明得到的重組質粒pEZsiRNA6. Ihif-I α菌落PCR鑒定圖。圖2是本發明構建的重組質粒測序圖。圖3是本發明所用的質粒載體pEZsiRNA6. 1的結構圖。圖4a是pEZsiRNA6. Ihif-I α轉染EC-9706經G418篩選獲得的穩定細胞系。圖4b是pEZsiRNA6. 1/neg轉染EC-9706經G418篩選獲得的穩定細胞系。圖5是HIF-I α蛋白的誘導表達抑制效果的western blot鑒定。
具體實施例方式本發明所述的一種長效沉默食管癌細胞HIF-I α基因的2IShRNA熒光表達載體的 構建，包括下述步驟(I)HIF-Ia干擾序列的設計HIF-I α 基因 M 和mRNA全長序列號從NCBI 獲取(NM_001530. 3)，利用 WHITEH0USE 軟件進行預測分析由21個核苷酸組成的干擾序列，GC含量控制在30% -50% ；同時利用s iDirect在線設計軟件，將已獲得的mRNA序列全長輸入待預測序列框，選擇設計方針為雷 諾方程，GC含量控制在30%-50%，運行遠程預測程序，獲得預測結果；(2) BLAST 分析以NCBI的Nucleotide Blast對各個預測的核苷酸序列進行比對，設計得到一條 21核苷酸的HIF-I α的干擾序列，正義鏈為5’ CAGCAGACTCAAATACAAGAA3’的寡核苷酸干 擾序列，G C比為36. 8% ；同時合成一條與人類基因無同源性的陰性對照序列(neg)；(3)載體設計依據質粒的插入位點和接頭結構設計編碼shRNA的單鏈DNA oligos，在正義鏈序 列5’加入GATCCC，中部加入TTCAAGAGA結構的loop環，3’端加TTTTTGGAT ；反義鏈設計5’ 加入AGCTATCCAAAAA，中部加入TTCAAGAGA結構的loop環，3’端加GG，最終連接入載體的編 碼 shRNA 的 DNA 序列為正向GATCCCCAGCAGACTCAAATACAAGAATTCAAGAGATTCTTGTATTTGAGT CTGCTGTTTTTGGAT,反向AGCTATCCAAAAACAGCAGACTCAAATACAAGAATCTCTTGAATTCTTGTATTTGA GTCTGCTGGG ；(4)載體構建與轉化單鏈DNA oligo 退火生成雙鏈 oligo，單鏈 DNA oligo 用 oligo annealingbuffer 溶解，將oligo混合物在水浴鍋中95°C加熱5min，自然冷卻至室溫，形成雙鏈oligo片段； 雙鏈oligo連接pEZsiRNA6. 1載體，載體結構如圖3所示，質粒載體可以進行熒光示蹤，該 質粒載體由上海生博醫學生物工程科技有限公司提供；BamHI和Hind III對載體進行雙 酶切，按照20 μ 1反應體系進行連接反應，16°C連接過夜；冰浴并轉化感受態DH5 α，用含 100mg/l氨芐霉素瓊脂平板篩選陽性克隆；取一支感受態細胞(每管100μ 1，_80°C保存)于冰上，待溶解后加入10 μ 1連接 液，輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30分鐘；將管放到預加溫至42°C的恒溫水浴鍋中熱激90秒后，快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻2-3分鐘；每管加900 μ 1 LB培養液，然 后將管轉移到37°C搖床上，溫育1小時使細菌復蘇；取恰當量的轉化菌液涂布于LB瓊脂平 板上(含表達載體相應的抗生素)；倒置平皿，于恒溫培養箱中37°C培養，16小時；(5)、菌落 PCR 鑒定挑取平板上長出的轉化子重懸于10 μ 1 LB培養液中，從中取1μ 1做模板進行菌 落 PCR 鑒定。20ul 反應體系，30cycle(94°C，5min，94°C，30sec ；55°C，30sec ；72°C，30sec ； 72°C, IOmin)。Primer(+) :hU6-F_primer TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG ；Primer(-) :BGH_rev_primer TAGAAGGCACAGTCGAGG。
陽性克隆得到317bp條帶，陰性克隆得到269bp條帶。鑒定結果如圖1所示1、陰性對照(空載體)2、陽性對照(陽性對照所加的退火的雙鏈oligo是以前退火好的驗證好用的片 段，和連接組所加的退火的雙鏈oligo長度一樣，但序列無關)3、250bp DNA ladder plus :5kb，3Kb,2Kb,1. 5kb,1Kb,750bp,500bp,250bp,IOObp
4 11、挑取的8個轉化子(6)、陽性克隆測序挑取抗性克隆在含100mg/l氨芐霉素霉素LB液體培養基中過夜培養，質粒純化提 取試劑盒提取質粒，測序鑒定插入序列，測序由華大基因完成。結論所得質粒插入序列和預期設計完全相同，其測序圖如圖2所示。驗證試驗1、干擾HIF-I α表達穩定細胞(Ec-9706-hif-l α細胞)系的建立1-1主要試劑食管癌細胞株EC-9706本室保存。RPMI 1640培養基(Gibco公司)， 胎牛血清(杭州四季青)。LipofectmaineTM 2000和Opti-MEMIReducedSerum Medium(美國 Invitrogen 公司)。Cobalt chloride (CoCl 2) (sigma 公司)。HIF-I α 抗體(美國 Santa Cruz公司)，HRP2標記山羊抗兔IgG(JACKS0NIMMUN0公司)，β -actin (北京博奧森公司)， BCA蛋白定量試劑盒(北京博奧森)，ECL發光液(美國PIERCE)，蛋白電泳及轉膜系統為 Bio-Rad公司產品。1-2細胞培養培養基為含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液(含IOOU -rnL-1青 霉素和80U*mL-l鏈霉素)，于37°C，5% C02傳代培養。CoCl2濃度為100 μ mol/L，配置成 無血清缺氧誘導培養基，處理4h模擬低氧環境。2、EC_9706細胞的穩定轉染轉染前24h將對數生長期的EC-9706細胞接種于6孔板，待細胞生長到90%融合 時分為三組空白對照組不轉染任何質粒，neg組轉染pEZs iRNA6. Ι/neg質粒(即與人類 基因組無同源性序列質粒)，hif_la組轉染pEZsiRNA6. Ihif-Ia質粒(即干擾人HIF_1 a 蛋白表達序列質粒)。每組設3個復孔，嚴格按說明書操作。空白對照組則加入等體積RPMI 1640培養液。轉染24h后，更換含雙抗，20%胎牛血清培養基。經G418(600yg/ml)篩選培 養基培養3周后，熒光顯微鏡觀察細胞，如圖4a、圖4b所示，穩定細胞能夠表達綠色熒光蛋 白，證明穩定細胞構建成功，并挑單克隆至培養瓶中繼續用含G418(600yg/ml)培養基培 養并凍存。
3, HIF-I α蛋白表達測定
在收集細胞前4h加入化學乏氧劑CoCl2,濃度為ΙΟΟμπιοΙ/L，各組細胞經缺氧誘 導培養基培養后收集，用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液于冰上裂解細胞，于4°C 13000r/ min離心。取上清液即為總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，每組樣本各取總蛋白30yg，8% 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離蛋白，濕轉法將蛋白轉到NC膜上。經 5%脫脂奶封閉Ih后，加一抗兔抗人HIF-I α (1 1000)和兔抗人β-actin單克隆抗體 (1 300) 4°C孵育過夜；二抗為采用HRP標記的羊抗兔IgG(l 5000)；用化學發光法顯色； 如圖5所示1組為Cocl2誘導，未轉染質粒；2組為Cocl2誘導，轉染pEZsiRNA6. 1/neg ；3 組為Cocl2誘導，轉染pEZsiRNA6. Ihif-I α質粒；4組為不加Cocl2,未轉染質粒。結果轉染pEZsiRNA6. lhif- α質粒的穩定細胞(Ec-9706-hif-l α細胞)經 Cocl2誘導后明顯比經Cocl2誘導，未轉染質粒組和Cocl2誘導轉染pEZsiRNA6. 1/neg質粒 組蛋白表達量低，與不加Cocl2誘導，未轉染質粒的對照組蛋白表達相似，證明穩定細胞系 構建成功，并且能抑制HIF-I α蛋白表達。
權利要求
一種長效沉默食管癌細胞HIF-1α基因的21ShRNA熒光表達載體的構建，其特征在于包括下述步驟(1)從NCBI獲取NM_001530.3，利用WHITEHOUSE軟件進行預測分析由21個核苷酸組成的干擾序列，GC含量控制在30％-50％；同時利用siDirect在線設計軟件，將已獲得的mRNA序列全長輸入待預測序列框，選擇設計方針為雷諾方程，GC含量控制在30％-50％，運行遠程預測程序，獲得預測結果；(2)以NCBI的Nucleotide Blast對各個預測的核苷酸序列進行比對，設計得到一條21核苷酸的HIF-1α的干擾序列，既正義鏈為5’CAGCAGACTCAAATACAAGAA3’的寡核苷酸干擾序列，GC比為36.8％；(3)依據質粒的插入位點和接頭結構設計編碼shRNA的單鏈DNA oligos，在正義鏈序列5’加入GATCCC，中部加入TTCAAGAGA結構的loop環，3’端加TTTTTGGAT；反義鏈設計5’加入AGCTATCCAAAAA，中部加入TTCAAGAGA結構的loop環，3’端加GG，最終連接入載體的編碼shRNA的DNA序列為正向GATCCCCAGCAGACTCAAATACAAGAATTCAAGAGATTCTTGTATTTGAGTCTGCTGTTTTTGGAT，反向AGCTATCCAAAAACAGCAGACTCAAATACAAGAATCTCTTGAATTCTTGTATTTGAGTCTGCTGGG；(4)單鏈DNA oligo退火生成雙鏈oligo，雙鏈oligo連接pEZsiRNA6.1載體，BamHI和Hind III對載體進行雙酶切，按照20μl反應體系進行連接反應，16℃連接過夜，冰浴并轉化感受態DH5α，用含100mg/l氨芐霉素瓊脂平板篩選陽性克隆，提取得到pEZsiRNA6.1hif-1α重組質粒。
全文摘要
本發明公開了一種長效沉默食管癌細胞HIF-1α基因的21ShRNA熒光表達載體的構建，從NCBI獲取HIF-1α基因ID NM_001530.3，軟件預測設計21個寡核苷酸siRNA干擾序列，依據質粒插入位點和接頭結構設計編碼shRNA的DNA序列，并連接pEZsiRNA6.1載體，得到長效沉默HIF-1α基因的pEZsiRNA6.1hif-1α重組質粒。本發明利用siRNA原理，設計HIF-1α干擾序列，構建shRNA長效干擾熒光表達載體，經細胞轉染并篩選鑒定后能夠得到長效沉默HIF-1α蛋白表達的穩定細胞系，為以HIF-1α為靶標的新藥開發和基因治療提供了新材料。
文檔編號C12N15/113GK101864444SQ20101018313
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月26日 優先權日2010年5月26日
發明者孫蕾, 康巧珍, 張亞冰, 張聚真, 楊小靜, 楊觀瑞, 汲振余, 裘一兵, 趙立群, 郭歡, 閻紅霞 申請人:河南省醫藥科學研究院