專利名稱：一種腈轉化酶的高通量篩選方法
技術領域：
本發明涉及一種腈轉化酶的高通量篩選方法。 背景技術：
腈類化合物是重要的醫藥、農藥和精細化工中間體。腈類物質的微生物降解有 氧化、還原和水解等3種途徑。后者又可以根據參與水解反應的酶系不同分成兩類一是 腈水解酶(nitrilase，Ε. C. 3. 5. 5. 1)，直接將腈水解為羧酸和氨；另一途徑是先在腈水合 酶(nitrile hydratase, E. C. 4. 2. 1. 84)的作用下將腈水合生成酰胺，如果微生物中還存 在酰胺酶(amidase，Ε. C. 3. 5. 1. 4)，則在其作用下進一步生成羧酸和氨，反應需兩步完成 (BiotechLett. 1994，16 :47_50)，如圖 1 所示。目前，腈水合酶(NHase)的工業化應用越來越受到人們的關注。自1980年Asano 發現高NHase活力的微生物Pseudomonas chlororaphis B23，并將其成功應用于丙烯酰胺 的大規模生產以來，NHase這一生物催化領域的分支得以迅速發展，其應用范圍擴展至精 細化工產品、醫藥中間體、農藥中間體和化妝品等多個領域，合成的產物已經大大超過100 種，包括脂肪族、環脂肪族、芳香族以及雜環族的酰胺和羧酸。酰胺酶最早發現于1964年，分別是由Kelly和Jakoby在Pseudomonsaeruginosa 和Pseudomonas fluorescens中發現的。酰胺酶的底物范圍很廣，能夠水解各種天然及人 工合成的脂肪族和芳香族酰胺。某些酰胺酶具有很好的立體選擇性，在制備手性化合物方 面具有巨大的潛力，正日益受到工業界的重視。腈水解酶能夠催化腈水解生成相應的羧酸和氨，1964年由哈佛大學的Thimarm和 Mahadevan從大麥葉子中正式分離得到，并命名為腈水解酶。它能將吲哚-3-乙腈轉化為吲 哚-3-乙酸。第一個能產腈水解酶的微生物菌種是由Hook和Robinson利用天然腈化合物 蓖麻堿做為唯一碳源，篩選得到的假單孢菌(Pseudomonas)，該菌水解氰基吡啶的能力比蓖 麻堿高1. 18倍。在此之后利用腈水解酶催化腈水解生產相應羧酸的研究和應用也越來越多.鑒于腈轉化酶在工業微生物技術領域的重要性，越來越多的研究集中于產腈轉化 酶新菌株的篩選和現有菌株及酶的改良。從自然界的土壤、水體和污泥等環境中，通過傳統 方法篩選產腈轉化酶菌株效率低，工作量大。另一方面，隨著基因工程技術的快速發展，可 供選擇的生物催化劑的數量飛速增長。如通過定向(分子)進化技術，由于突變文庫包含 的突變體數量巨大(通常含IO4 IO6突變子)，對快速、準確的高通量篩選模型的建立提 出了更為迫切的需求。腈水解酶和酰胺酶由于水解產物均含有氨和羧酸，因此可以通過顯 色或熒光檢測檢測氨或羧酸的生成以構建快速篩選模型。Henke等利用酶催化底物水解所 產生的胺類物質，經衍生化生成容易檢出的熒光染料，建立用于篩選以N-酰胺為底物的水 解酶。Duchateau等建立的模型依據堿性環境下氨基酸及其相應的氨基酰胺與Cu (II)形成 的復合物在光譜特性上的差異，用于篩選氨基酰胺酶。Zheng等構建了基于酰基轉移反應的 立體選擇性酰胺酶篩選模型，用于篩選R-型酰胺酶，制備(S) - (+) -2，2- 二甲基環丙烷甲酰胺。腈水合酶的篩選主要是以GC、HPLC或1hNMR法檢測酰胺是否生成，這些方法不僅費時費 力，而且對設備要求高、通用性差。迄今為止，在國內外文獻中尚無用于篩選腈水合酶的高 通量快速篩選模型報道，也沒有同時可以用于腈水合酶、酰胺酶和腈水解酶的高通量篩選 的方法報道。
發明內容
為了克服傳統的腈水合酶篩選模型在篩選過程中費時費力、對設備要求高、通用 性差等缺點，本發明提供了一種基于絡合顯色反應的腈轉化酶高通量篩選方法，該方法不 僅可用于高通量篩選腈水合酶，而且還可用于酰胺酶和腈水解酶的快速篩選。本發明采用的技術方案是一種腈轉化酶的高通量篩選方法，所述腈轉化酶為腈水合酶、酰胺酶或腈水解酶， 所述方法包括取待測樣品溶于蒸餾水中，加入底物氨基腈類化合物或羥基腈類化合物或 酰胺類化合物、至底物濃度為1 IOOmM,于10 50°C水浴轉化反應10 120min，取轉 化液，先后添加Fe2+和Fe3+離子水溶液，進行顯色反應，添加兩種離子的時間間隔為0 lOmin，所加入的底物、Fe2+、Fe3+物質的量之比為1 1 3 1 3;所述氨基腈類化合物為下列之一 α -氨基腈2_氨基-2，3-二甲基丁腈、2-氨基 丁腈、2-氨基丙腈，其他氨基腈β -氨基丙腈、3-氨基丁腈；所述羥基腈類化合物為α -羥基腈，具體為下列之一 2_羥基丙腈、扁桃腈；所述酰胺類化合物為下列之一 2_氨基-2，3_ 二甲基丁酰胺、2-氨基丁酰胺；結果判斷添加底物為氨基腈類化合物或羥基類腈化合物時，若轉化液先由無色變為淺綠色 再變為黃色則表明被測樣品含有腈水合酶，若轉化液不發生明顯的顏色變化、最終顯示黃 色則表明被測樣品含有腈水解酶或同時含有腈水合酶和酰胺酶，若轉化液先由無色變為淺 黃色再變為藍色則表明被測樣品不含腈轉化酶；添加底物為酰胺類化合物時，若轉化液不發生明顯的顏色變化，最終顯示黃色則 表明被測樣品含有酰胺酶，若轉化液先由無色變為淺綠色再變為黃色則表明被測樣品不含 酰胺酶。本發明采用的絡合顯色反應方法是α -氨基腈或α -羥基腈水溶液先后加入Fe2+ 和Fe3+離子溶液后，發生絡合反應，溶液顏色先由無色變為淺黃色再變為藍色；脂肪族化合 物，同一分子上含有兩個氨基的化合物(如氨基酰胺、乙二胺等)的水溶液先后加入Fe2+和 Fe3+離子溶液也會發生絡合反應，使溶液顏色先變淺綠色，最后變為黃色；氨基酸水溶液先 后加入Fe2+和Fe3+離子溶液后，不發生明顯的顏色變化，最終顯示Fe3+離子溶液的黃色。所述的α -氨基腈和α -羥基腈顯色機理為α -氨基腈和α -羥基腈在水溶液中的不穩定，容易自發解離產生酮或醛、氫氰酸 禾口氛(Cyanide in biology. Academic Press. London. 1981)，其在水溶液中的解離途徑如 圖2所示。游離氰離子先后與Fe2+和Fe3+反應，生產不同的產物顯示出不同的顏色。翟慕衡(配位化學.安徽安徽人民出版社，2007)等指出亞鐵離子溶液加入KCN后，與后者反應產生絡離子[Fe (CN)6]4-(氰亞鐵酸根)，該離子在水溶液中顯黃色；再加入 鐵離子后，Fe3+與[Fe(CN)6]4_絡離子反應生成Fe4[Fe(CN)6]3沉淀，后者為常用的染料普魯士藍。圖3進一步闡明了游離氰離子與Fe2+和Fe3+顯色反應的機理。
所述的氨基酰胺顯色機理為 最外電子層具有(T9 (d5除外)結構的過渡元素離子在水溶液中一般都會顯示一定 的顏色。這些離子在水溶液中，都是以水合離子的形式存在，水合離子之所以具有顏色，是 因為其離子存在著未成對的d電子。過渡元素離子在其周圍作為配體的水分子的電場作用 下，d軌道產生分裂現象，形成能量不同的高、低兩組軌道。當自然光照射水溶液時，水合離 子的未成對d電子吸收一部分光能后，可以從低能量軌道躍遷到高能量軌道，稱d-d躍遷。 被吸收的光的補色所呈現出的顏色即為水溶液顏色。亞鐵離子溶液加入氨基酰胺如2-氨基-2，3-二甲基酰胺(ADBA)或乙二胺(en) 后，水合配離子([Fe(H2O)6]2+)變成[Fe (ADBA)2]2+或[Fe(en)2]2+0由于ADBA或乙二胺分子 比水分子產生的配位場強度大，配位后使d軌道的分裂能變大，未成對的d電子要吸收更大 的光能量后才能從低能量軌道躍遷到高能量軌道。從而使d電子對可見光的吸收光譜向短 波方向移動，溶液顏色由淺綠色變為藍綠色。溶液吸收光譜的波長變短引起的顏色變化可 由圖4示意。再加入Fe3+后，Fe3+對ADBA或乙二胺的親和力比Fe2+更強，破壞了 [Fe (ADBA)2]2+ 或[Fe(en)2]2+配離子，從而使顏色變為黃色。相似的反應有(物質的顏色與結構.北京 北京師范大學出版社，1991):綠色的NiCl2溶液加入乙二胺后顯色變為深藍色，再加入Fe3+ 后深藍色消失，產生黃色沉淀。所述的Fe2+離子水溶液為FeSO4或FeClyjC溶液，濃度為0. 01 1. OM ；所述的Fe3+ 離子水溶液為Fe (NO3) 3或FeCl3水溶液，濃度為0. 01 1. OM0所述顯色反應溫度為20 40°C，顯色反應時間為1 5min。本發明方法不僅適用于未知微生物的篩選，也適用于已知微生物的篩選，也可直 接采用已知或未知的酶作為篩選對象，待測樣品可為微生物菌種的菌懸液、也可以是溶解 后的酶液。所述待測樣品為微生物菌種的菌懸液時，加入底物進行轉化反應后，轉化液經 離心，取上清液再進行顯色反應。所述的微生物可來自實驗室保存的菌種，也可來自各種可 分離到微生物的樣品，如果園、農田、化工廠排污口等的土樣、水樣、污泥和保藏的微生物菌 種。所添加的底物為α -氨基腈，如2-氨基-2，3_ 二甲基丁腈、2_氨基丁腈和2_氨 基丙腈時，所述的轉化液先后添加含Fe2+和Fe3+離子的溶液后，若轉化液先由無色變為淺綠 色再變為黃色則表明被測樣品含有腈水合酶；若轉化液不發生明顯的顏色變化，最終顯示 Fe3+離子溶液的黃色則表明被測樣品含有腈水解酶或同時含有腈水合酶以及酰胺酶；若轉 化液先由無色變為淺黃色再變為藍色則表明被測樣品不含腈轉化酶。所添加的底物為α-氨基腈以外的氨基腈類物質，如β-氨基丙腈、3-氨基丁腈 時，所述的轉化液先后添加含Fe2+和Fe3+離子的溶液后，若轉化液先由無色變為淺綠色再變 為黃色則表明被測樣品含有腈水合酶；若轉化液不發生明顯的顏色變化，最終顯示Fe3+離 子溶液的黃色則表明被測樣品不含腈水合酶。所添加的底物為α _羥基腈，如2-羥基丙腈、扁桃腈時，所述的轉化液先后添加含Fe2+和Fe3+離子的溶液后，若轉化液不發生明顯的顏色變化，最終顯示Fe3+離子溶液的黃色 則表明被測樣品含有腈水合酶或腈水解酶；若轉化液先由無色變為淺黃色再變為藍色則表明被測樣品不含腈轉化酶。所添加的底物為2-氨基-2，3- 二甲基丁酰胺、2-氨基丁酰胺時，所述的轉化液先 后添加含Fe2+和Fe3+離子的溶液后，若轉化液不發生明顯的顏色變化，最終顯示Fe3+離子溶 液的黃色則表明被測樣品含有酰胺酶；若轉化液先由無色變為淺綠色再變為黃色則表明被 測樣品不含酰胺酶。本發明所述的基于絡合顯色反應的腈轉化酶高通量篩選方法的有益效果主要體 現在能夠較好地克服傳統的基于GC、HPLC或ihNMR的篩選方法存在費時費力、設備要求高 和通用性差等缺點，通過簡單的顏色對比即可以快速鑒定所試樣品是否存在腈水合酶、酰 胺酶或腈水解酶；具有操作簡便、檢測快速又經濟實惠等優點，為腈水合酶、酰胺酶或腈水 解酶的快速篩選帶來了極大的便利。
圖1為腈類化合物的兩種分解途徑；圖2為α _氨基腈和α _羥基腈在水中變化途徑；(a)自發分解，(b)質子化穩定；圖3為氰離子與Fe2+和Fe3+顯色反應的機理；圖4為吸收光譜波長變短引起溶液顏色變化。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于 此實施例1 含2-氨基-2，3-二甲基丁腈水合活力的腈水合酶產生菌的篩選將待篩選的微生物培養后，經離心、生理鹽水洗滌，均勻懸浮于蒸餾水中，制備成 OD600 = 10的菌懸液。取5ml該菌懸液置于具塞三角瓶(50ml)中，再放入30°C水浴中預 熱5min，添加20μ1 2-氨基-2，3-二甲基丁腈開始反應。15min后取樣，IOOOOrpm下離心 5min。取上清液100 μ 1于96孔板中，先后加入濃度為IOOmM的FeSO4和FeCl3水溶液各 100μ 1，觀察其顏色變化。先后加入FeSO4和FeCl3水溶液后，上清液先由無色變為淺綠色 再變為黃色的實驗組含有腈水合酶。經比色法對照，篩選獲得兩株紅球菌屬菌株能催化2-氨基-2，3- 二甲基丁腈水合 反應(Rhodococcus sp. ZJB-09153和Rhodococcus sp. ZA)，并經實驗證實，該菌株具有腈水 合酶活力。實施例2 :含β _氨基丙腈水合活力的腈水合酶產生菌的篩選將待篩選的微生物培養后按實施例1的方法制成菌懸液，取IOml該菌懸液置于具塞三角瓶(50ml)中，再放入20°C水浴中預熱lOmin，添加30μ1 β-氨基丙腈開始反應。 IOmin后取樣，12000rpm下離心4min。取上清液200 μ 1于96孔板中，先后加入濃度為1. OM 的FeCl2和Fe (NO3) 3水溶液各20 μ 1，觀察其顏色變化。先后加入FeCl2和Fe (NO3) 3水溶液 后，上清液先由無色變為淺綠色再變為黃色的實驗組含有腈水合酶。經比色法對照，實施例1篩選獲得的菌種Rhodococcus sp. ZJB-09153、 Rhodococcus sp. ZA和實驗室保藏的菌種 Nocardia globerula ZJB-09141 能催化 β -氨基 丙腈水合反應，并經實驗證實，該菌株具有腈水合酶活力。
實施例3 含2-氨基丁酰胺水解活力的酰胺酶產生菌的篩選將待篩選的微生物培養后按實施例1的方法制成菌懸液，取7ml該菌懸液置于具 塞三角瓶(50ml)中，再放入40°C水浴中預熱4min，添加20 μ 1 2-氨基丁酰胺開始反應。 40min后取樣，IOOOOrpm下離心6min。取上清液180 μ 1于96孔板中，先后加入濃度為200mM 的FeCl2和Fe (NO3) 3水溶液各60 μ 1，觀察其顏色變化。先后加入FeCl2和Fe (NO3) 3水溶液 后，上清液不發生明顯的顏色變化，最終顯示Fe3+離子溶液的黃色的試驗組含有酰胺酶。經比色法對照，菌種Delftiatsuruhatensis ZJB-05174(CCTCC No :M 205114)能 催化2-氨基丁酰胺水解反應，并經實驗證實，該菌株具有酰胺酶活力。實施例4 含2-氨基-2，3- 二甲基丁腈水解活力的腈水解酶產生菌的篩選將待篩選的微生物培養后按實施例1的方法制成菌懸液，取8ml該菌懸液置于具 塞三角瓶(50ml)中，再放入35°C水浴中預熱8min，添加30μ 1 2-氨基-2，3-二甲基丁腈 開始反應。30min后取樣，12000rpm下離心5min。取上清液150 μ 1于96孔板中，先后加 入濃度為500mM的FeSO4和Fe (NO3) 3水溶液各30 μ 1，觀察其顏色變化。先后加入FeSO4和 Fe (NO3) 3水溶液后，上清液不發生明顯的顏色變化，最終顯示Fe3+離子溶液的黃色的試驗組 含有腈水解酶或同時含有腈水合酶和酰胺酶。再按實施例3的方法確認上述試驗組含有腈 水解酶還是酰胺酶。經比色法對照，菌種Bacillus subtilis ZJB-063 (CCTCC No :M 206038)能催化 2-氨基_2，3- 二甲基丁腈水解反應，并經實驗證實，該菌株具有腈水解酶活力。實施例5 含扁桃腈水解酶活力的腈水解酶產生菌的篩選將待篩選的微生物培養后按實施例1的方法制成菌懸液，取IOml該菌懸液置于具塞三角瓶(50ml)中，再放入35°C水浴中預熱lOmin，添加30μ 1扁桃腈開始反應。30min后 取樣，IOOOOrpm下離心6min。取上清液180 μ 1于96孔板中，先后加入60 μ 1濃度為200mM 的FeCl2和Fe (NO3) 3水溶液各60 μ 1，觀察其顏色變化。先后加入FeCl2和Fe (NO3) 3水溶液 后，上清液不發生明顯的顏色變化，最終顯示Fe3+離子溶液的黃色的試驗組含有腈水解酶 或同時含有腈水合酶和酰胺酶。再按實施例3和4的方法確認上述試驗組含有腈水解酶還 是酰胺酶。經比色法對照，菌種Alcaligenes faecalis ZJUTB10 (CCTCC No :M208168)能催化 扁桃腈水解反應，并經實驗證實，具有腈水解酶活力。
權利要求
一種腈轉化酶的高通量篩選方法，所述腈轉化酶為腈水合酶、酰胺酶或腈水解酶，所述方法包括取待測樣品溶于蒸餾水中，加入底物氨基腈類化合物或羥基腈類化合物或酰胺類化合物、至底物濃度為1～100mM，于10～50℃水浴轉化反應10～120min，取轉化液，先后添加Fe2+和Fe3+離子水溶液，進行顯色反應，添加兩種離子的時間間隔為0～10min，所加入的底物、Fe2+、Fe3+物質的量之比為1∶1～3∶1～3；所述氨基腈類化合物為下列之一2-氨基-2，3-二甲基丁腈、2-氨基丁腈、2-氨基丙腈、β-氨基丙腈、3-氨基丁腈；所述羥基腈類化合物為下列之一2-羥基丙腈、扁桃腈；所述酰胺類化合物為下列之一2-氨基-2，3-二甲基丁酰胺、2-氨基丁酰胺；添加底物為氨基腈類化合物或羥基類腈化合物時，若轉化液先由無色變為淺綠色再變為黃色則表明被測樣品含有腈水合酶，若轉化液不發生明顯的顏色變化、最終顯示黃色則表明被測樣品含有腈水解酶或同時含有腈水合酶和酰胺酶，若轉化液先由無色變為淺黃色再變為藍色則表明被測樣品不含腈轉化酶；添加底物為酰胺類化合物時，若轉化液不發生明顯的顏色變化，最終顯示黃色則表明被測樣品含有酰胺酶，若轉化液先由無色變為淺綠色再變為黃色則表明被測樣品不含酰胺酶。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的Fe2+離子水溶液為FeSO4或FeCl2水溶 液，濃度為0. 01 1. OM ；所述的Fe3+離子水溶液為Fe (NO3)3或FeCljK溶液，濃度為0. 01 1. OM0
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述顯色反應溫度為20 40°C，顯色反應時 間為1 5min。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述待測樣品為微生物菌種的菌懸液，加入 底物進行轉化反應后，轉化液經離心，取上清液再進行顯色反應。
全文摘要
本發明提供了一種腈轉化酶的高通量篩選方法，所述方法包括取待測樣品溶于蒸餾水中，加入底物氨基腈類化合物或羥基腈類化合物或酰胺類化合物、至底物濃度為1～100mM，于10～50℃水浴轉化反應10～120min，取轉化液，先后添加Fe2+和Fe3+離子水溶液，進行顯色反應，所加入的底物、Fe2+、Fe3+物質的量之比為1∶1～3∶1～3，添加兩種離子的時間間隔為0～10min，根據溶液顏色變化進行判斷所含腈轉化酶的種類。本發明所述的基于絡合顯色反應的腈轉化酶高通量篩選方法，能夠較好地克服傳統篩選方法的缺點，通過簡單的顏色對比即可以快速鑒定所試樣品是否存在腈水合酶、酰胺酶或腈水解酶，具有操作簡便、檢測快速又經濟實惠等優點，為腈水合酶、酰胺酶或腈水解酶的快速篩選帶來了極大的便利。
文檔編號C12Q1/34GK101838681SQ20101018727
公開日2010年9月22日 申請日期2010年5月31日 優先權日2010年5月31日
發明者戴昌龍, 林志堅, 沈寅初, 鄭仁朝, 鄭裕國, 雷利華 申請人:浙江工業大學