核酸分離和檢測方法和適用于該方法的試管的制作方法

專利名稱：核酸分離和檢測方法和適用于該方法的試管的制作方法
技術領域：
本發明適用于基因診斷(也稱為核酸診斷)的各個應用分支如各種疾病診斷、流 行病預防；血庫的血液篩查；進出口商品的檢驗檢疫；食品安全檢測；生物恐怖的防范、法 醫鑒定等領域，具體說涉及一種核酸分離和檢測方法。本發明還涉及上述核酸分離和檢測方法的載體，具體說是一種試管裝置。
背景技術：
基因診斷也稱核酸診斷，是用分子生物學的理論和技術，通過直接探查核酸的存 在狀態或缺陷，從核酸結構、復制、轉錄或翻譯水平分析核酸的功能，從而對人體狀態與疾 病做出診斷的方法。它的目標分子是DNA或RNA，反映核酸的結構和功能。檢測的基因有 內源性(即機體自身的基因)和外源性(如病毒、細菌等)兩種，前者用于診斷基因有無病 變，后者用于診斷有無病原體感染。常用的應用范圍為各種疾病診斷、流行病預防；血庫 的血液篩查；進出口商品的檢驗檢疫；食品安全檢測；生物恐怖的防范、法醫鑒定等領域。核酸診斷的整個技術環節可以分為核酸的分離和純化、擴增和放大技術、檢測技 術三個過程。本發明主要集中于核酸的分離和純化技術。核酸的分離與純化技術是生物化 學與分子生物學的一項基本技術。隨著分子生物學技術廣泛應用于生物學、醫學及其相關 等領域，核酸的分離與純化技術也得到進一步發展。各種新方法、經完善后的傳統經典方法 以及商品試劑方法的不斷出現，極大地推動了分子生物學的發展。核酸的分離和純化是核 酸診斷的第一步，純化后核酸的質量和純度直接決定了核酸診斷的質量和準確性。大多數核酸分離與純化的方法一般都包括了細胞裂解、酶處理、核酸與其他生物 大分子物質分離、核酸純化等幾個主要步驟。每一步驟又可由多種不同的方法單獨或聯合 實現。核酸的高電荷磷酸骨架使其比蛋白質、多糖、脂肪等其他生物大分子物質更具親水 性，根據它們理化性質的差異，用選擇性沉淀、層析、密度梯度離心等方法可將核酸分離、純 化。在商業上應用的主要幾種方法為離心法、膜分離法、基于納米微粒的磁珠法等。國內離心法應用以達安基因、科華生物為代表等，其典型特征是經過高溫煮沸后 用離心機進行分離，通過取上清液和去上清液的辦法進行核酸和其他大分子物質和其他雜 質進行分析。其缺點是很難進行自動化操作，例如取上清、棄上清的過程很難用自動化的方 式來實現。另外的缺點是操作繁瑣，費時費力。一個操作熟練的技術人員一個上午也只能 處理幾十個標本，操作人員需要頻繁操作金屬、離心機等設備，操作人員全程暴露在生物污 染之中。膜分離法以AXYGEN、Qiagen等國外公司為代表，常應用于科學研究等領域。一般 以科研研究為主，成本很高，操作繁瑣，在國內少見臨床診斷用途。基于納米微粒的磁珠法磁珠法提取核酸是通過細胞裂解液裂解細胞，從細胞中 游離出來的核酸分子被特異的吸附到磁性顆粒表面，而蛋白質等雜質不被吸附而留在溶液 中。反應一定時間之后，再在磁場作用下，使磁性顆粒與液體分開，回收顆粒(即磁珠-DNA 混合物)，再用洗脫液洗脫即可以得到純凈的DNA。磁珠法不需要離心、不需要加入多種試劑，操作簡單，符合核酸自動化提取要求，是未來核酸純化方法發展的一個重要方向。核酸診斷相對于傳統的免疫診斷等方法具有靈敏度高，特異性強等顯著優于傳統 診斷方法的優點，但是也存在下述幾個缺點1自動化程度低，國內基本上無可以商業應用的核酸全自動自動提取和檢測儀器； 國外僅有Gene-Probe、Roche等兩三家企業有FDA認可的自動化的核酸提取和檢測系統。2標準化程度低；自動化的核酸提取和檢測儀器嚴重匱乏，各種方法林立，沒有統 一的標準。3交叉污染難以克服；核酸診斷的優勢在于靈敏度極高。但是由于靈敏度高帶來 的副作用就是交叉污染問題難以克服，在加熱、振蕩、加樣等核酸提取的過程中非常微量的 液體通過氣溶膠的方式擴散到空氣中，造成樣品之間交叉污染，從而造成假陽性的出現一 直是核酸診斷的普及的最大障礙之一。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種試管，該試管用于核酸提取裝置中，可最大 限度地降低樣品和外界接觸的可能，減少樣品之間的交叉污染，提高檢測靈敏度，并能通過 該試管方便地實現檢測核酸診斷的自動化、標準化。本發明采用以下技術方案一種試管，包括本體，本體內設有空腔，所述空腔上部有一個開口，所述本體包括 上、下密封連接的兩部分，下部分為硬管，上部分為彈性軟管。優選地，所述彈性軟管采用硅膠。優選地，所述下部分為PP聚丙烯塑料管。進一步地，所述本體包括底部和側壁，在底部一側與側壁之間設有斜面。進一步地，所述斜面包括位于最低處的根部，自根部起至對面側壁之間，形成沉淀 區。優選地，多個試管排成一列集成于一面板上，該面板上設有多個通孔，每個通孔對 應一個試管，通孔下設有支架，支架末端套于所述下部分硬管的管口上。本發明所涉及的試管用于核酸提取裝置中，上部分彈性軟管與下部分塑料硬管結 合，彈性軟管上設有一對夾持部，這樣試管的打開和封閉狀態得以實現，能在需要加液或抽 液的時候，松開夾持，彈性軟管釋放，加液管與抽液管得以進入；當試管內進行混勻、反應、 或捕獲的時候，彈性軟管被夾持，試管處于封閉狀態。由此可見，試管只在需要的時候打開， 既減小了交叉污染，同時也方便了打開和封閉。斜面結構可使磁珠在最短時間最短距離吸附到斜面，磁珠被集中吸附在斜面的時 候，可進行抽液，抽液管插入沉淀區內，而磁珠不會被吸走。同時，也方便了清洗步驟，提取 物始終在試管內，避免了與外界接觸。欲抽取提取物時，在斜面上方加入檢測液，檢測液將 磁珠沿著斜面沖刷進沉淀區內，方便了磁珠的提取。本發明要解決的另一個技術問題是提供一種核酸分離和檢測方法，該方法不僅能 實現核酸的提取，而且能減小交叉污染的可能，并可以方便地實現核酸分離、放大、檢測的 全自動操作。本發明采用以下技術方案
一種核酸分離和檢測方法，用于該方法的試管包括本體，本體內設有空腔，所述空 腔上部有一個開口，所述本體包括上、下密封連接的兩部分，下部分為硬管，上部分為彈性 軟管，當加液或抽液時，所述彈性軟管釋放，試管被打開；在其它步驟中，試管處于被夾持的 封閉狀態。進一步地，所述本體包括底部和側壁，在底部一側與側壁之間設有斜面，核酸提取 包括核酸分離步驟，分離出的核酸被捕獲，并形成磁珠，磁鋼貼在所述斜面外將試管內的磁 珠吸附于斜面上。優選地，對分離后的核酸提取物清洗，按以下步驟進行，并重復多次a.抽出廢液，磁鋼保持吸附磁珠；b.加入洗滌液，撤離磁鋼；c.試管振蕩混勻；d.磁鋼貼于斜面上，將試管內磁珠再次吸附于斜面上。優選地，清洗后，加檢測液，撤離磁鋼，檢測液自斜面上方加入試管，沖刷磁珠并聚 集在所述沉淀區中。本發明通過對彈性軟管的夾持，試管一直處于封閉狀態，只有在加液或抽液時才 打開，極大地減小了交叉污染的機會，且方便對試管的開閉狀態的控制。另外，試管底部設有斜面，磁珠被吸附在斜面上。提取物能最短時間最短距離聚集 在一起，當抽廢液時，磁珠在斜面上，這樣抽液管能深入試管底部的沉淀區，保證磁珠不會 被抽走。同時，也方便了清洗步驟，提取物始終在試管內，避免與外界接觸。欲抽取提取物 時，在斜面上方加入檢測液，檢測液將磁珠沿著斜面沖刷進沉淀區內，方便了磁珠的提取。


圖1為本發明所涉及的試管的結構示意圖。圖2為本發明所涉及的核酸提取裝置的裝配示意圖，該核酸提取裝置包括多個試 管排成一列組合而成。圖3為本發明所涉及的核酸提取裝置的結構示意圖。圖4為本發明所涉及的核酸提取裝置從另一個角度顯示的結構示意圖。圖5 圖15顯示了核酸提取過程，其中圖5為試管初始狀態，試管通過夾緊片封閉。圖6為加入核酸提取液，試管開管_閉管。圖7為加入樣本，試管開管_閉管。圖8為試管振蕩混勻。圖9為樣本裂解。圖10為捕獲核酸。圖11為磁珠被磁鋼吸附于斜面上。圖12為抽取廢液。圖13為清洗磁珠，包括往試管加入洗滌液_閉管并振蕩混勻_吸附磁珠_抽取廢 液。圖14為加入檢測液，試管開管_閉管。
圖15為轉移檢測液混合物。
具體實施例方式參見圖1 2，為用于本發明所涉及的核酸分離和檢測裝置。包括一面板17，所述 面板17上設有多個通孔18，每個通孔18下都連接試管10。該試管10包括本體，本體內設 空腔11，該空腔11只有一個開口 12，本體由上下兩部分組成，上半部分為柱狀彈性軟管13， 下半部分為硬質的塑料管14。試管10的上下材質不同，上半部分所采用的材質偏軟，能彈 性地收攏或張開，當有外力對彈性軟管13側壁施加時，管口被關閉，可以阻斷與外界的流 通；當撤除外力后，彈性軟管13回復，管口被打開。因此彈性軟管13所采用的為彈性材料， 如硅膠等。彈性軟管13套于塑料管14上，與塑料管14密封連接，形成完整的試管10。塑 料管14為PP聚丙烯材質。在本實施例中，塑料管14與彈性軟管13連接的管口上外套與面 板17連接的支架19，該支架19不僅是連接件，同時也不致使試管變形。軟管、硬管和面板 可以一體注塑成形。軟管開口與通孔可以是一體的。多個試管10排成一列形成如圖3 4所示的核酸提取裝置。在彈性軟管13側壁上設有夾具，如圖5所示，相應地，在彈性軟管13上設有夾持 部29。該夾具為一對夾緊片20，所述夾緊片20穿過兩兩試管之間的間隙，因此能夾持彈性 軟管13的一對夾持部29。當夾緊片20夾緊狀態時，彈性軟管13側壁貼緊，試管10封閉； 夾緊片20松開，彈性軟管13回復而釋放，試管10與外界連通。由此可見，通過夾緊片20 可控制試管10的開閉。在加液或抽液的時候，試管10打開；其它時候試管10被夾緊，最大 可能地減小了試劑與外界交叉污染的機會。核酸分離和檢測方法根據以下步驟進行1)試管10初始處于閉管狀態。夾緊片20夾緊彈性軟管13，斷絕了與外界的流通， 見圖5。2)向試管10加入核酸提取液21，夾緊片20打開試管10，注液管23得以伸入試管 10加提取液21。加完后，注液管23退出，夾緊片20再一次閉管，見圖6。3)接著，加樣本22與提取液21混合。再次控制夾緊片20，試管10開管-閉管， 見圖7。4)使試管10振蕩，提取液21與樣本22混勻，見圖8。5)裂解。在60°C下，金屬浴保持8分鐘，見圖9。6)捕獲，在常溫(25°C )下，見圖10。在本發明所涉及的方法中，核酸分離采用磁 珠法，磁珠法是通過細胞裂解液裂解細胞，從細胞中游離出來的核酸分子被特異地吸附到 磁性顆粒表面，而蛋白質等雜質不被吸附而留在溶液中。反應一定時間之后，再在磁場作用 下，使磁性顆粒與液體分開，回收顆粒，再用洗脫液洗脫即可以得到純凈的提取物。7)吸附磁珠24，見圖11。通過在試管10上增置磁鋼25來吸附磁珠24。磁珠24 材料是鐵氧體，磁鋼25可以是天然磁體。由圖可知，試管10的底部包括一斜面15，斜面15 延伸至側壁，該斜面15可以是45°的傾斜面，磁鋼25貼在斜面15上，可以將試管10內的 磁珠24吸附在該面上。也就是說，此時核酸分子都集中在磁珠24上，達到了核酸分離的效^ ο8)接下來對試管10清洗，以得到純凈的提取物。由圖12 13可知，先抽取廢液。
6由于試管10的斜面15設計，該斜面15為流線型的曲線，使試管10底部相對于斜面15的另一邊形成一沉淀區16，即自斜面15根部至另一邊側壁的區域，斜面15上的物質可沿著斜 面15進入沉淀區16，當磁鋼吸附磁珠時，磁珠被吸附后形成單點，從而保證磁珠不會在抽 廢液時抽走。抽液管26能深入到試管10底部，即沉淀區16進行廢液抽取。由于此時磁珠 24被吸附在斜面15上，因此不必擔心分離出的核酸分子隨著廢液抽出，而且還盡可能地將 廢液抽取干凈。然后，添加洗滌液27，閉管，撤離磁鋼25，磁珠24隨洗滌液27散化，振蕩混 勻，再次通過磁鋼25將磁珠24吸附于斜面15上，并由抽液管26抽深入試管10底部抽取 廢液。上述操作過程重復3次，即能達到提純的效果。該清洗方法由于磁珠24-磁鋼25的 運用，而使需提取的核酸始終駐留在試管10內，避免了與外界氣溶膠的接觸。9)加檢測液，見圖14。撤離磁鋼25，開管，注液管23于斜面15 —側加試劑，將磁 珠24沖刷至沉淀區16，振蕩混勻，此時提取物聚集在沉淀區16內。10)轉移檢測液混合物，見圖15。抽液管26深入至沉淀區16，將檢測液混合物抽 出，并移至PCR微孔板28上。試管10為長圓形管口設計，流線型斜面結構。流線型斜面結構使磁珠24能在最 短時間內，以最短的距離被吸附到試管10側壁上。長圓形管口設計使抽廢液時，磁珠24被 吸附到流線型斜面15，廢液吸頭沖原理斜面15的圓孔位置下抽取廢液。保證磁珠24不會 被吸走。本發明通過該試管10和試劑中的磁性微粒和該裝置外的磁鐵可以實現核酸的提 取和純化過程。樣品中的核酸(DNA、RNA)可以和磁性微粒中的核酸吸附物質相結合，而外 部的磁鐵可以吸附和放開磁性微粒，配合外部的試劑和沖洗試劑可以從樣品中提取和純化 待測的核酸。另外，在試管外加上熒光激發和讀數裝置可以實現全自動核酸提取、純化、放 大、檢測的全過程。在本發明中，試管10上半部分所采用的彈性軟管13設計結合夾緊片20可實現對 試管10的關閉和打開控制，在需要加樣的時候才打開試管10，最大可能地減小了核酸與氣 溶膠交叉污染。試管10的斜面15結構，及利用磁鋼25吸附磁珠24，可使磁珠24吸附于側 壁上，這樣為抽取廢液提供方便。利用該方法，還改變了清洗方式，在清洗過程中，提取物始 終在試管10內，避免與外界接觸。
權利要求
一種試管，包括本體，本體內設有空腔(11)，所述空腔(11)上部有一個開口(12)，所述本體包括上、下密封連接的兩部分，下部分為硬管，其特征是上部分為彈性軟管(13)。
2.根據權利要求1所述的試管，其特征是所述彈性軟管(13)采用硅膠。
3.根據權利要求2所述的試管，其特征是所述下部分為PP聚丙烯塑料管(14)。
4.根據權利要求3所述的試管，其特征是所述本體包括底部和側壁，斜面在底部一側 與側壁之間設有斜面(15)。
5.根據權利要求4所述的試管，其特征是所述斜面(15)包括位于最低處的根部，自 根部起至對面側壁之間，形成沉淀區(16)。
6.根據權利要求5所述的試管，其特征是多個試管(10)排成一列集成于一面板(17) 上，該面板(17)上設有多個通孔(18)，每個通孔(18)對應一個試管(10)，通孔(18)下設 有支架(19)，支架(19)末端與下部分硬管的管口連接。
7.—種核酸分離和檢測方法，用于該方法的試管(10)包括本體，本體內設有空腔 (11)，所述空腔(11)上部有一個開口(12)，所述本體包括上、下密封連接的兩部分，下部分 為硬管，上部分為彈性軟管(13)，其特征是當加液或抽液時，所述彈性軟管(13)釋放，試 管(10)被打開；在其它步驟中，試管(10)處于被夾持的封閉狀態。
8.根據權利要求7所述的核酸分離和檢測方法，其特征是所述本體包括底部和側壁， 在底部一側與側壁之間設有斜面(15)，核酸提取包括核酸分離步驟，分離出的核酸被捕獲， 并形成磁珠(24)，磁鋼(25)貼在所述斜面(15)外將試管(10)內的磁珠(24)吸附于斜面(15)上。
9.根據權利要求8所述的核酸分離和檢測方法，其特征是所述斜面(15)包括位于 最低處的根部，自根部起至對面側壁之間，形成沉淀區(16)，抽液時，磁鋼(25)吸附磁珠 (24)，抽液管(26)插入所述沉淀區(16)中進行抽液。
10.根據權利要求9所述的核酸分離和檢測方法，其特征是對分離后的核酸提取物清 洗，按以下步驟進行，并重復多次a.抽出廢液，磁鋼(25)保持吸附磁珠(24)；b.加入洗滌液(27)，撤離磁鋼(25)；c.試管(10)振蕩混勻；d.磁鋼(25)貼于斜面(15)上，將試管(10)內磁珠(24)再次吸附于斜面(15)上。
11.根據權利要求10所述的核酸分離和檢測方法，其特征是清洗后，加檢測液，撤離 磁鋼(25)，檢測液自斜面(15)上方加入試管(10)，沖刷磁珠(24)并聚集在所述沉淀區(16)中。
全文摘要
本發明公開了一種核酸分離和檢測的方法及其適用于該方法的試管裝置。所述試管包括本體，本體內設有空腔，所述空腔上部有一個開口，所述本體包括上、下密封連接的兩部分，下部分為硬管，上部分為彈性軟管。本發明所涉及的試管用于核酸提取裝置中，上部分彈性軟管與下部分塑料硬管結合，這樣試管的打開和封閉狀態通過夾持得以實現，能在需要加液或抽液的時候，松開夾持，彈性軟管釋放，加液管與抽液管得以進入；當試管內進行混勻、反應、或捕獲的時候，彈性軟管被夾持，試管處于封閉狀態。由此可見，試管只在需要的時候打開，可以在最大限度內減小了樣品之間的交叉污染。通過本發明，可以方便地實現核酸純化中的自動化、標準化問題并能有效解決核酸診斷中的交叉污染問題。
文檔編號C12Q1/68GK101869855SQ201010189028
公開日2010年10月27日 申請日期2010年5月31日 優先權日2010年5月31日
發明者周宋兵, 居金良, 朱慧偉, 王敏, 胡瑞, 黃鶴 申請人:嘉興凱實生物科技有限公司;上海仁度生物科技有限公司