乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶啟動子及應用和構建體與載體的制作方法

專利名稱：乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶啟動子及應用和構建體與載體的制作方法
技術領域：
本專利屬于基因工程技術領域，具體涉及圓紅冬孢酵母啟動子、終止子及其用途， 包括基因工程菌株構建所必需的轉化方法等。
背景技術：
微生物是自然界中分布最廣泛的物種之一，具有卓越的生物合成能力，幾乎能合成地球上所有的有機化學品。微生物的種屬多樣性和遺傳多樣性決定了其代謝多樣性。與多細胞生物相比，微生物的代謝途徑雖然相對簡單，但其化合物的生產高效、快捷，并與人類日常生產生活關系密切。
做為某一化學品的天然生產菌株或環境治理應用菌株，其特定的生產性能往往并非最優化。如何優化或改變工業菌株的代謝網絡和表達調控網絡，以提高生物基產品的積累速度或定向控制靶產品的質量，是當今生物技術領域研究的熱點和難點。實際上，對微生物油脂代謝過程的理解、開發和利用是否能達到或者超過化學加工水平，也是提高發酵過程經濟性的關鍵。全基因組測序和基因工程技術的進步，為菌株生理學特性的認識和菌株改良提供了比傳統誘變技術更為合理的方法。
代謝工程的實質是利用重組DNA技術和其它技術，有目的地改變已有的代謝和表達調控網絡，更好地理解和利用細胞的代謝途徑。代謝工程可以在細胞與分子水平上認識和改造細胞過程，其不僅可以解釋細胞生理生化特性，而且還可賦于出發菌株新的性狀和表型(1)擴大底物利用范圍；( 生產原來不存在的新化合物；C3)增強對環境中毒害物質的降解能力；(4)提高菌體對環境的適應能力；(5)阻斷或降低副產品的生成；(6)代謝產品生產速率和生產性能的提高等(Bailey J Ε. Toward a science ofmetabolic engineering. Science. 1991,252(5013) :1668-1675 ；Aristidou A,Penttila M. Metabolic engineering applications to renewable resource utilization. Curr. Opin.Biotechnol.2000，11(2) :187-198)。
圓紅冬孢酵母屬于擔子菌門異宗配合型真菌，是發酵工業中一種極為重要的微生物，可利用源于生物質的己糖和戊糖為原料生產重要的生物基產品微生物油脂， 胞內油脂可達細胞干重的60 %以上(Ratledge C, WynnJ P. The biochemistry and molecular biology of lipid accumulation in oleaginousmicroorganisms.Adv. Appl. Microbiol. 2002, 51 :1-51 ；Li Y, Zhao Z, Bai F. High-density cultivation of oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Y4infed-batch culture.Enzyme Microb. Technol. 2007,41 (3) :312-317)；工業用酶或藥物合成用酶如磷酸二酯酶、苯丙氨酸角軍氨酶(Hodgins D S. Yeastphenylalanine ammonia-lyase. Purification, properties, and the identification ofcatalytically essential dehydroalanine. J Biol.Chem. 1971,246(9) :2977-2985 ；Gilbert H J, Clarke I N, Gibson R K, et al. Molecular cloning of the phenylalanineammonia lyase gene from Rhodosporidiumtoruloides in Escherichia coli K-12. JBacteriol. 1985,161 (1) :314-320)、D氨基酸氧化酶(Gadda G Negri A,PiloneM S. Reaction of phenylglyoxal with arginine groups in D-amino-acid oxidasefrom Rhodotorula gracilis. J Biol. Chem. 1994,269(27) 17809-17814 ；Liao G J, Lee Y J, Lee Y H, et al. Structure and expression of the D-amino-acid oxidasegene from the yeast Rhodosporidium toruloides. Biotechnol. Appl.Biochem. 1998，27 (Pt 1) :55-61)等；β-胡蘿卜素和胞外多糖；并在污水處理和生物制藥中有較廣泛的應用。實驗結果表明，該菌可同時利用五碳糖和六碳糖為底物，抗逆性好，能直接以玉米秸稈酸水解液為碳源積累油脂，可實現生物質到生物基產品的高效轉化 (李永紅，劉波，孫艷，等.廣譜碳源產油酵母菌的篩選.中國生物工程雜志，2005，25 (12) 39-44)。
雖然圓紅冬孢酵母具有優良的工業生產性能，同時，圓紅冬孢酵母來源的蛋白酶異源表達也獲得成功(Pollegioni L，Molla G Campaner S，Cloning，sequencing and expression in Ε.coli of a D—amino acid oxidase cDNA fromRhodotorula gracilis active on cephalosporin C. J Biotechnol. 1997，58(2) 115-123 ；Faulkner J D， Anson J G，Tuite M F，et al. High-level expression of thephenylalanine ammonia lyase-encoding gene from Rhodosporidium toruloidesin Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli using a bifunctionalexpression system. Gene. 1994,143 (1) 13-20)，但圓紅冬孢酵母自身缺乏相應的遺傳操作系統。以圓紅冬孢酵母為宿主菌，無論是基因工程操作還是代謝工程菌株改良，都受到遺傳操作系統的制約，難以進行靶向性的菌株改造。
啟動子對于遺傳操作系統來說必不可少。因此，如果要對圓紅冬孢酵母進行遺傳操作，獲得能在圓紅冬孢酵母中起作用的啟動子是該工作的關鍵環節。

發明內容
鑒于上述現有技術瓶頸，本發明的主要目的是提供可用于在圓紅冬孢酵母中有效表達外源基因，并且可通過遺傳工程技術進行圓紅冬孢酵母菌種改良的啟動子和終止子。
為實現本發明的目的，本發明人對圓紅冬孢酵母中的基因表達情況進行了深入研究，在對圓紅冬孢酵母乳清酸核苷-5 ‘-磷酸脫羧酶及其編碼基因Rtura3研究的基礎上(中國專利，專利申請號:200710158415. 1 ；Yang F, ZhangS, Tang W, Zhao Z. Identification of the orotidine-5' -monophosphatedecarboxylase gene of the oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Yeast2008,25 (9) :623-630)，利用染色體步移方法，從圓紅冬孢酵母染色體DNA中成功獲得了包含有效啟動子的DNA片段，由此完成了本發明。
具體講，本發明包含下述實施方案(A)到(F) (A)本發明涉及一種具有圓紅冬孢酵母轉錄啟動子活性的DNA片段，所述DNA片段具有如SEQ ID NO 1所示DNA序列的全部或包含該DNA序列自3，-末端起900bp以內的部分序列，或具有可與如SEQ ID NO 1所示序列的全部或其DNA序列3，-末端起900bp以內的部分序列雜交的、且保持轉錄啟動子活性的序列，或對SEQ ID NO :1所示的脫氧核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、插入或添加所獲得的，與SEQ ID NO :1所示序列具有50%以上同源性、且具有啟動子活性的序列。
(B)本發明涉及一種來自圓紅冬孢酵母的DNA片段，所述DNA片段具有如下特征 (1)如SEQ ID NO 2所示的DNA序列的全部或包含該DNA序列5，-末端的部分序列；(2) 或具有可與如(1)所示序列雜交的、且保持如(1)所述序列活性的序列。
(C)本發明涉及一種可完成靶基因在圓紅冬孢酵母中轉錄起始和轉錄終止的DNA 分子，它同時具有如㈧所述序列和如⑶所述序列，且如⑶所述序列位于如㈧所述序列的下游，與其相鄰1-10000個核苷酸的DNA片段。
(D)本發明涉及一種可將靶基因與(A)-(C)所述的任一種DNA分子連接的DNA構建體，以便于靶基因能夠在圓紅冬孢酵母中表達的重組DNA。所述靶基因為蛋白編碼核酸或反義核酸編碼核酸。
(E)本發明涉及一種攜帶(A)-(D)所述的的DNA分子中的任意一個的載體。所述載體可以是質粒載體或粘粒載體。
(F)本發明涉及轉入了如⑶所述的DNA分子或如(E)所述載體的圓紅冬孢酵母或紅冬孢酵母屬(Miodosporidium)真菌。
使用本發明的具有啟動子活性的DNA分子和具有轉錄終止子活性的DNA，可實現外源基因或內源基因在圓紅冬孢酵母中的表達，本發明提供了用于遺傳工程圓紅冬孢酵母的啟動子、終止子和載體。為圓紅冬孢酵母開啟了一條育種新途徑，并因此可以提供具有工業用途的新型圓紅冬孢酵母。


圖1表示pRtura3啟動子DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳的結果。
圖2表示Rtura3t終止子DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳的結果。
圖3表示Rtura3啟動子-ORF-終止子基因全長片段的瓊脂糖凝膠電泳的結果。
圖4表示GFPuv在圓紅冬孢酵母ATCC 10788中的整合性表達結果。
圖5表示pRtura3啟動子啟動博來霉素抗性基因ble在紅冬孢酵母ATCC10788的抗生表達結果。
圖6表示pRtura3啟動子啟動遺傳霉素抗性基因kanmx4在紅冬孢酵母ATCC 10788的抗生表達結果。
圖7表示重組圓紅冬孢酵母在5’ -FOA上的培養結果。
圖8是質粒pura3gfp的結構圖。
圖9是質粒pura3ble的結構圖。
圖10是質粒pura3kan的結構圖。
下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明。
具體實施例方式在本文中，“啟動子”是指能夠被RNA聚合酶識別、結合并能啟動基因轉錄的DNA序列。術語“啟動子”還可理解為包括5’非編碼區、順式作用元件(如增強子)以及其它能與轉錄因子結合的核苷酸序列。
啟動子的存在或強度通常是通過啟動子活性表示，其測定方法將報告基因(如綠色熒光蛋白)連接于所述啟動子的下游，并將該DNA構建體轉化相應宿主細胞，檢測報告基因表達量。如果人們觀察到連接于所述啟動子下游報告基因的表達，就可以認為所述啟動子在它所轉化的宿主細胞內有活性。
在本文中，“終止子”是指染色體上提供終止信號使RNA聚合酶與DNA模板分離而使轉錄終止的一段DNA序列。可以通過諸如Northern雜交或RT-PCR的方法檢查所轉錄 RNA的大小而確認終止子的存在。或通過“啟動子-報告基因-終止子”構建體使報告基因有效表達而確定終止子的活性。
本發明中的“圓紅冬孢酵母”，包括屬于該“物種，，的任何二倍體和單倍體，野生型菌株和營養缺陷型菌株。本發明中的“紅冬孢酵母屬真菌”，沒有具體限制，其例子包括歸屬于該屬的真菌，除圓紅冬孢酵母外，如Rhodosporidium azoricum, Rhodosporidium bab jevae, I hodosporidiumsphaerocarpum0 本發明的“目的基因”，包括能夠在圓紅冬孢酵母中表達的蛋白編碼序列，反義RNA 編碼序列和核酸酶編碼序列。能夠在圓紅冬孢酵母中表達的蛋白編碼序列的例子包括源于圓紅冬孢酵母的核酸序列，且并不局限于此。本發明的目的基因還包括來源于其它微生物、 植物和動物的蛋白編碼序列。
本發明中的啟動子具有如SEQ ID NO 1所示DNA序列的全部或包含該DNA序列 3，-末端的部分序列，或具有可與如SEQ ID NO 1所示序列的全部或其DNA序列3，-末端的部分序列雜交的、且保持轉錄啟動子活性的序列，或對SEQ ID NO :1所示的脫氧核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、插入或添加所獲得的，與SEQ ID NO :1所示序列具有 50%以上同源性、且具有啟動子活性的序列。
本發明中的終止子具有如SEQ ID NO 2所示的DNA序列的全部或包含該DNA序列 5，-末端的部分序列，或具有可與如SEQ ID NO 2所示序列的全部或其DNA序列5，-末端的部分序列雜交的、且保持轉錄終止子活性的序列，或對SEQ ID NO :2所示的脫氧核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、插入或添加所獲得的，與SEQ ID NO :2所示序列具有 50%以上同源性、且具有終止子活性的序列。
本發明中的啟動子-目的基因的構建體、目的基因-終止子的構建體或啟動子-目的基因-終止子的構建體，可以直接或經載體介導轉化圓紅冬孢酵母，以便于目的基因表達，可以優選質粒載體作為介導載體。
本發明的啟動子可以按照以下方面從圓紅冬孢酵母中分離。
下面結合附圖及實施例對本發明作進一步說明，將有助于本領域的普通技術人員理解本發明，但不以任何形式限制本發明。下述實施例中所有引物合成及測序工作，如無特別說明則均由大連TaKaRa公司完成。
實施例1 圓紅冬孢酵母基因組DNA的制備 將新鮮圓紅冬孢酵母R. toruloides ATCC 10788 (購自美國標準生物品收藏中心， ATCC)由斜面接種到50ml YEPD液體培養基中，于30°C搖床培養Mh，再以1 50的體積比例將菌液分別轉接到IOOml YEPD液體培養基中，于30°C搖床培養1 達對數生長期。在 4°C下，5000rpm離心％iin，收集菌體。ATCC 10788的基因組DNA提取采用玻璃珠破壁法(精編分子生物學實驗指南第三版第13章，奧斯伯等著，顏子穎等譯，科學出版社出版)。制備好的基因組DNA，利用Nanodrop 1000測定，測得0D26(1/0D28(1 = 1. 85，表明基因組DNA質量很好。基因組DNA濃度為120ng/l·! 1，共500μ 1，凍存于-20°C，備用。
實施例2 染色體步移獲得Rtura3基因5’翼側序列(啟動子) 本實施例利用Genome Walking Kit(購自 TaKaRa)完成。
根據已報道的圓紅冬孢酵母乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶編碼基因(Rtura3) 的基因組DNA序歹Ij (中國專利，專利申請號:200710158415. 1 ；Yang F, Zhang S, Tang W, Zhao Z. Identification of theorotidine-5‘ -monophosphate decarboxylase gene of the oleaginous yeastRhodosporidium toruloides Yeast 2008,25(9) 623-630)，設計 3 條 SpecificPrimer(基因特異性引物)分別為 ura3_SPl :5，-TCCCGGT CAAAGTCCTCGACGATGTC-3，， ura3-SP2 :5’ -CTTGATGCAGCAGCAGTACGGGCC-3，和 ura3_SP3 5，-GGCGTAGGTGCGGGTCGTGATGGAC-3，，做為下游引物，按照 Genomeffalking Kit (購自 TaKaRa)說明書進行以下操作。
1. IstPCR 反應 以實施例1中精制的基因組DNA為模板，進行第一輪擴增。反應體系50 μ 1 =IOXLA PCR buffer II (Mg2+plus，大連 TakaRa) 5· 0 μ 1，dNTPs (2. 5mmol/l)8. 0μ 1，TaKaRa LA Taq DNA 聚合酶(5U/y 1，大連 TakaRa) 1.0 μ 1，API Primer (100 μ mol/1，大連 TakaRa) 1· 0 μ 1， ura3-SPl (10 μ mol/1) 1.0 μ 1，R. toruloides ATCC 10788 基因組 DNA 模板(120ng/ μ 1)1.0 μ LddH2O加至50 μ 1。反應條件先進行5個高溫退火溫度的高特異性反應，然后進行1個極低退火溫度的低特異性反應；然后進行熱不對稱PCR :2個高退火溫度(65°C)的高特異性反應和1個低退火溫度(44°C )的低特異性反應交替循環，共15次。具體參數如下:94V lmin，98°C Imin ；94°C 30s, 65°C lmin，72°C 2min，共 5 個循環；94°C 30s, 25°C 3min, 72 "C 2min ；94 "C 30s, 65 "C lmin，72 "C 2min，94 "C 30s, 65 "C lmin，72 "C 2min，94 "C 30s, 44°C lmin，72°C 2min，共 15 個循環；72°C lOmin，結束反應。
2. 2nd 巢式 PCR 反應 反應體系50 μ 1 10 X LA PCR bufferll (Mg2+plus,大連 TakaRa) 5. 0 μ 1，dNTPs (2. 5mmol/l)8. 0μ 1，TakaRa LA Taq DNA 聚合酶(5U/μ 1，大連 TakaRa) 1.0 μ 1，API Primer (100 μ mol/1,大連 TakaRa) 1. 0 μ 1，IstPCR 反應產物 1.0 μ 1，ura3-SP2 (10 μ mol/ 1) 1· 0μ 1，ddH20 力口至 50 μ 1。反應條件94 °C 30s, 65 "C lmin，72 "C 2min，94 "C 30s, 65°C lmin, 72°C 2min, 94°C 30s, 44°C lmin, 72°C 2min,共 15 個循環；72°C lOmin,結束反應。
33rd 巢式 PCR 反應 反應體系50yl:10XLA PCR bufferll (Mg2+plus,大連 TakaRa) 5. 0 μ 1， dNTPs (2. 5mmol/l) 8. 0 μ 1，TaKaRa LA Taq DNA 聚合酶(5U/ μ 1，大連 TakaRa) 1. 0 μ 1， API Primer (100 μ mol/1，大連 TakaRa) 1. 0 μ 1，2nd 巢式 PCR 反應產物 1.0 μ 1， ura3-SP3(10ymol/l)1.0y l，ddH20 加至 50μ 1。反應條件:94V 30s,65°C lmin，72°C 2min， 94°C 30s,65°C lmin，72°C 2min，94°C 30s,44°C lmin，72°C 2min，共 15 個循環；72°C lOmin, 結束反應。
3rd巢式PCR反應產物經1 % (質量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳后切割目的條帶，利用DNA片段凝膠純化試劑盒(購自碧云天)進行純化。純化后的DNA片段經TA克隆插入pMD18-T載體(購自I^akaRa公司)，轉化DH5 α感受態細胞；其中感受態細胞按氯化鈣法(分子克隆實驗指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學出版社出版)制備。挑
7選Amp抗性轉化子進行增菌培養、質粒提取。重組質粒樣品送至TaKaRa公司測序，得到如 SEQ ID NO 1所示的DNA序列，證實為預期的pRtura3基因序列。 序列號1 (SEQ ID NO 1) 序列長度1529bp 序列類型DNA
來源圓紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)
來源菌株特征分類地位擔子菌門，高產油脂菌株，胞內油脂最高達細胞干重的 TGACCGGAGCMCMGACGTGGGCGAGTATACGCACTGGATGCAGGCGCCGACGCGTTTC60 TTGCACAMTAGCAGACCTGCGMCGMCTCTTCGTCAGCTCGMGCTTGAMGACTCGC120 CGCTTTCGACTCACCAGCTTCCATCGACTCTTGGGGATGTTCTCGAGACCGTCGACCGGC180 TCCATATACACCGTGTTGCTGACGCCTGTTTCGGGMCCCAGATCGCGCAGAGCMGTGT240 GCCCACTGGCCCGTTGTCGTTTGTTTGMGGCGCCGTACGAGTTGGGGCAMGCACGCAG300 GTCTACGAGAGATMTAGTCAGGTTTTGAGCGTAGCAMGGCCCCGGACGGAMCGCACG360 ACTGGCTTGTCGGGCGAGACGGTGCATTTGCGGCAGAGCCACTGTCCTTCCGGGATGTAC420 GGMCGCCGTAGCMTCTGCGAGGMGCGACAMGATGAGCATCAGATCCTCGTCGTGAC480 CACGCTGTGCAGCCATGCMCGTGAGMCTCGCGACGCACCTTGGTGGACCGCCMGTTG540 CATCCGTCGCAGMGACGATCGCATTCGAGTTCTCGCACTCGCCGTCGTCGCAMTGGCA600 CATTTGCTG TCTTCGCTCGGCMGGCATTCGTCCGCTTCGGGATATTGCGAGTCTGCGM660 AGACGAGCGAGACGGTCAGCAGGTCGCGAGMGTTGAGGGAGGGCGAGMCGGACCAGGT720 CGMCCACTCCTTCTCMTCTTGTCCATGACMTCTCAMGAGCTCGTACGGGATGGTGG780 CMGACCGTCCTTCTTCCGCTCCGCGTTGAGCGTGTCGAGCCAGAGTTGGTCTGTGGGTT840 TCGCCGTCCATACAGGCTGTCAGCTGTCGTACAMTCGTCMGCCTGCCTGAGAGMCCT900 CCCACCTTGCTCGTCCATGTCATACTCMCCTGCTTCGCCAGGTCCGACTCCATAGGTTC960 TGTGGGAGACGGAGGGAGGGTGAGTAAGTCGACTTTTGAGACGCTGGTCC GCCTGCAGAG1020 GCGCAGACATCGMGAGCGATCTTCGAGTGCTCCTGCAGCATCTGCACGTCCGTCCGGGC1080 GTCGCTCGCTGCTCCAGAGACGCGACAMCMTCCCCACTTGACGAGGATCGMGCGACT1140 CACGCAGCCACCGCAGGTACCGCCCCGGCTCGCCATCCGCTATGCCCTTG TACGCATCCC1200 ATTCCTGGCCGTCATTGTACCCGMCGCGACGAGCTGGGGGTTGTGMCA TCGGGCGGAG1260 CGGGGGTGCTCGTGTCGACGACGCGAMGTTGACGACTGGGAGTGCGAGA GACGAGCCGT1320 GAGCTCCTGGCATCCCGTTGGCAGTGTGTGAGCGTTCTACTGATGMGTC GAGGAGAGGA1380 AGAGMGGTTGTCGCTGGACTGCTCGCTCCTACTGTCCCTGTGAGGCTAC GGGACTGCTT1440 TCCGAGTCTATCAGAGCTACCTGMGCCCTTAGTACCGCTCGACTTGCGC GCCACCCCAT1500
實施例3 染色體步移獲得Rtura3基因3’翼側序列(終止子) 本實施例也是利用Genome Walking Kit(購自TaKaRa)完成。 已報道的圓紅冬孢酵母乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶編碼基因(Rtura3) 因組DNA序列(中國專禾丨J，專禾U申請號200710158415. 1 ；Yang F, ZhangS, W, Zhao Z. Identification of the orotidine-5' —monophosphatedecarboxylase gene of the oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Yeast2008, 25(9) :623-630)，設計 3 條 Specific Primer(基因特異性引物)分別為 ura3_SPll 5’ -GGAGGGTGGACGAGCGGGAAGAGAC-3’， ura3-SP22 :5’ -GTCATCATGACGC CCGGCGTCGGACT-3’ 和 ura3-SP33 :5，-GCGTACGAGGACAGGCTG AGGCAGT-3，，做為上游引物，按照 GenomeWalking Kit (購自TaKaRa)說明書進行3，翼側染色體步移操作，除Specif icl^rimer分別由 ura3-SPl，ura3-SP2，ura3-SP3 依次更換為 ura3-SPll，ura3-SP22，ura3_SP33 外，其它同實施例2。
3rd巢式PCR反應產物利用DNA片段凝膠純化試劑盒(購自碧云天)進行純化，經 TA克隆插入pMD18-T載體(購自TakaRa公司)，轉化DH5 α感受態細胞；其中感受態細胞按氯化鈣法(分子克隆實驗指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學出版社出版)制備。挑選Amp抗性轉化子進行增菌培養、質粒提取。重組質粒樣品送至TaKaRa公司測序， 得到如SEQ ID NO 2所示的DNA序列，證實為預期的Rt ura3t基因序列。
實施例4 =Rt ura3啟動子-ORF-終止子全長序列的獲得 以實施例1中制備的R. toruloides基因組DNA為模板，根據實施例2和實施例 3 獲得的序列信息，設計一對引物，pRtura3t-pl :5，-TGACCGGAGCAACAAGACGTGGG-3，和 pRtura3t-p2 :5，-AAGCAGGAGGAGGAGAAGCGGAGG-3，，進行 Rtura3 啟動子-ORF-終止子全長序列的 PCR擴增。PCR 體系(50 μ 1) 10 X Speed buffer (大連 TakaRa) 5. O μ 1, dNTPs (lOmmol/ 1)1. O μ 1，上游引物(10ymol/l)2. Ομ 1，下游引物(10 μ mol/1) 2. O μ 1, SpeedSTAR HS DNA 聚合酶(擴增速度快，ΙΙΛ/lOs，購自大連TaKaRa公司)0. 5 μ 1，基因組DNA模板(120ng/ μ 1)2 μ 1，ddH20;to 至 50μ 1。反應條件98 °C lmin，98°C 10s, 65 °C 1. 0min,30 個循環， 68°C 10min，4°C結束反應。PCR產物經(質量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳分析后利用 PCR片段純化試劑盒(購自碧云天)進行純化。片段經TA克隆插入pMDIS-T載體(購自 TakaRa公司)，轉化DH5ci感受態細胞；其中感受態細胞按氯化鈣法(分子克隆實驗指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學出版社出版)制備。挑選Amp抗性轉化子進行增菌培養、質粒提取。重組質粒樣品送至TaKaRa公司測序，得到如SEQ ID NO :3所示的DNA序列，證實為預期的pRtura3t全長序列，該重組載體命名為T-pRtura3t。
實施例5 圓紅冬孢酵母特異性綠色熒光蛋白表達盒ura3gfp的構建 ura3gfp圓紅冬孢酵母特異性綠色熒光蛋白表達盒的構建利用的是RF克隆(Van den Ent, F. , Lowe, J. ,2006. RF cloning :A restriction-free method forinserting target genes into plasmids. J. Biochem. Biophys. Methods 67 :67-74 ；Yang F, Zhang S, Tang W, Zhao Z, 2008. Identification of theorotidine-5 ' -monophosphate decarboxylase gene of the oleaginous yeastRhodosporidium toruloides. Yeast 25(9) :623-630)的方法。
pRtura3t全長序列擴增和克隆見實施例4。
1.綠色熒光蛋白編碼基因GFPuv的獲得 以pGFPuv質粒(購自BD Biosciences)為模板，利用一對引物gfp-pl 5，-ATGAGTAAAGGAGAAGAACT-3 ‘和 gfp_p2 :5，-TCATTTGTAGAGCTCATCCAT-3，，進行 PCR 擴增。體系(50 μ 1) :5XPrimebuffer (大連 TakaRa) 10.0 μ 1，dNTPs (大連 TakaRa，2. 5mmol/ 1)4. 0μ 1，上游引物 gfp-pl (10 μ mol/1) 2. 0 μ 1,下游引物 gfp-p2 (10 μ mol/1) 2. 0 μ 1,PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大連 TakaRa) 1. 0 μ 1，pGFPuv 質粒 1 μ 1，ddH20 加至 50 μ 1。反應條件95°C 3min，98°C 8s，49°C 15s，72°C lmin，；35 個循環，72°C lOmin，4°C結束反應。PCR 反應產物利用DNA片段膠回收純化試劑盒純化，利用taq DNA聚合酶進行DNA片段3，末端加 A，體系(50 μ 1) 10 X PCR buffer5. Ομ 1, dNTPs (2. 5mmol/l) 4. O μ 1，純化后的 GFPuv DNA片段30μ l，ddH20加至50μ 1。反應條件72°C 30min，4°C結束反應。3，末端加A后的 GFPuv DNA片段利用DNA片段膠回收純化試劑盒純化，克隆入pMD18_T載體，送TaKaRa公司測序，得到如SEQ ID NO 4所示的DNA序列，證實為預期的GFPuv基因序列。
2.參照文獻方法(Van den Ent, F. , Lowe, J. ,2006. RF cloning Are strict ion-free method for inserting target genes into plasmids. J. Biochem. Biophys. Methods 67:67-74)，設計 RF 克隆引物ura3-gfp-pl 5 ‘ -TCCTCCCGCTCCATCCGTCGAG atgagtaaaggagaagaact-3 ‘ 禾口 ura3_gfp_p2 5' -GAAAGTCTAGAGAGCGCCGCGCCAT tcatttgtagagctcatccat-3‘(其中大寫字母部分序列與pRtura3t克隆載體中原有的ura30RF翼側序列互補，小寫字母部分序列與綠色熒光蛋白 GFPuv ORF 互補)。
3. RF I反應體系及流程以本實施例操作項1中構建的GFPuvTA克隆載體為模板，利用ura3gfp-pl和ura3gfp-p2為引物，進行RF第一輪擴增。體系(50 μ 1) 5XPrime buffer 10. 0μ 1, dNTPs (2. 5mmol/l)4. 0μ 1，上游引物(10 μ mol/1) 2. 0 μ 1，下游引物 (10ymol/l)2. 0μ 1, PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大連 TakaRa) 1. 0 μ 1，T-GFRiv 質粒(源自實施例 4，100ng/y 1) 1 μ 1，ddH20 加至 50μ 1。反應條件:95V 3min，98°C 8s,49°C 15s, 72°C lmin，30個循環，72°C 10min，4°C結束反應。RF I反應產物利用DNA片段膠回收純化試劑盒純化，_20°C保存備用。
4. RF II 反應5 XPrime buffer 10. 0 μ 1，dNTPs (2. 5mmol/l) 4. 0 μ 1，實施例 4 中構建的T-pRtura3t質粒(lOOng/μ 1) 1. 0 μ 1，本實施例前述步驟中RFI反應產物(IOOng/ μ 1)5. 0μ 1, PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大連 TakaRa) 1. 0 μ 1，ddH20 加至 50 μ 1。反應條 # 95°C 3min，68°C 12min，之后 95°C 30s, 65°C 45s(_l°C /cyc)，68°C 12min，15 個循環，接下來再進行一輪95°C 30s, 55°C 45s, 68°C 12min，20 個循環，72°C lOmin，4°C結束反應。
5. DpnI消化和電擊轉化取8μ 1 RF II反應產物加入Ιμ DpnI (購自New England Biolabs)禾口 1 μ 1 DpnI buffer 混勻后在37°C作用 120min去除原T_pl tura;3t質粒后，分別取2μ1電擊轉化DH5ci感受態細胞，感受態細胞按標準方法制備(分子克隆實驗指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學出版社出版)，電擊轉化參數2200-2500V， 400Q，25yF，0°C。挑選Amp抗性轉化子進行增菌培養、質粒提取，并利用RF I反應所用引物ura3gfp-p 1和ura3gfp-p2進行菌落PCR鑒定，鑒定陽性的重組載體送TaKaRa進行測序， 得到5’端和3’端分別為ura3啟動子和ura3終止子的ura3gfp表達盒，同時，該重組載體命名為Pura3gfp。GFPuv ORF序列如SEQ ID NO :4所示；完整的ura3gfp表達盒如SEQ ID NO 5所示。
實施例6 利用ura3gfp表達盒進行Rtura3基因敲除兼綠色熒光蛋白表達 1. Rtura3gfp敲除盒的制備 以實施例5構建的PUra3gfp載體為模板，以實施例4中的寡核苷酸序列 pRtura3t-pl和pRtura3t_p2為引物，進行Rtura3gfp敲除盒的大量制備。PCR體系(500 μ 1) 10 X Speed buffer 50. 0 μ 1，dNTPs (10mmol/l) 10. 0 μ 1，上游引物(lOymol/ 1)20. O μ 1，下游引物(10ymol/l)20. Ομ 1, SpeedSTAR HS DNA 聚合酶(擴增速度快， lkb/10s，購自大連 TaKaRa 公司)5. O μ 1，基因組 DNA 模板(120ng/μ 1) 15. 0 μ 1，ddH20 加至 500 μ I0 反應條件98°C lmin,98°C 10s，65°C 60s，；35 個循環，72°C lOmin，4°C結束反應。
PCR產物經1 % (質量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳分析后利用PCR片段純化試劑盒(購自碧云天)進行純化。純化后的DNA片段濃度在400ng/yl，共50μ1，-20 保存 2.單倍體圓紅冬孢酵母ATCC 10788感受態細胞制備 R. toruloides npll 感受態細胞的制備R. toruloides ATCC 10788(購自美國標準生物品收藏中心ATCC)菌株挑菌落接種10ml YEPD培養基(葡萄糖20. Og/Ι，酵母提取物 10.0g/l，蛋白胨 20.0g/l，pH 6. 0)，30°C，200rpm，培養 20h ；培養物 1 50 比例轉接新鮮YEPD培養基，100ml (500ml錐形瓶，裝液量100ml) ,30 °C, 200rpm,培養6_9h，OD值達到 0. 6-1.2 ；培養物冰浴 10-30min，4°C，4000rpm 離心 5min，棄上清；0°C無菌 Milli-Q 水洗 1 次；0°C lmol/1山梨醇洗滌2次；冰浴，備用。
3.圓紅冬孢酵母ATCC 10788的電擊轉化和轉化子的PCR鑒定 Rtura3gfp 敲除盒的電擊轉化取 100 μ 1 R. toruloides ATCC 10788 感受態細胞，加入Rtura3gfp敲除盒5 μ 1 (總共2 μ g)，混勻后冰移入預冷至0°C的電擊杯中，電擊參數電壓0. 8-2. 0千伏，電阻200 Ω，電容25 μ F，時間4-lOms ；電擊后立即加入Iml YEPD, 30°C溫育1- ；涂布YEPD平板，10 μ 1/平板，30°C培養觀_3乩；逐一挑單克隆利用熒光顯微鏡進行鏡檢，陽性重組子ATCC 10788Aura3::gfp的熒光相片如圖4所示。
3株重組圓紅冬孢酵母ATCC 10788 Aura3: :gfp YEPD培養24h的培養物，利用生理鹽水(0.9% NaCl緩沖液)進行倍比稀釋，選擇其10-3、10-4、10_5、10-6四個稀釋度，分另Ij 移取10 μ 1菌液于含5’ -FOA (5’ -氟乳清酸，購自上海金和生物技術有限公司)的SC固體培養基(0. 2% 5' -F0A，葡萄糖 70g/L，(NH4)2SO4 0. lg/L，酵母粉 0. 75g/L，KH2PO4 0. 4g/L， MgSO4 ·7Η201. 5g/L，pH 6. 0)平板，待液體吸收完全，于30°C倒置培養3天，發現重組圓紅冬孢酵母ATCC 10788 Δ ura3::gfp具備5，-FOA抗性，而對照菌株圓紅冬孢酵母ATCC 10788 則無菌落生長。
以上結果說明，Rtura3gfp敲除盒(表達盒)在啟動綠色熒光蛋白在圓紅冬孢酵母中的整合性表達的同時，可以滅活整合位置ura3基因編碼的乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶活性。這樣的設計有利于后期的遺傳操作。
實施例7 圓紅冬孢酵母特異性博來霉素抗性表達盒ura3ble的構建 ura3ble圓紅冬孢酵母特異性博來霉素表達盒的構建，同樣是利用RF克隆的方法。
pRtura3t全長序列擴增和克隆見實施例4。
1.參照文獻方法(Van den Ent, F. , Lowe, J. ,2006. RF cloning Arestriction-free method for inserting target genes into ρlasmids. J. Biochem. Biophys. Methods 67:67-74)，設計 RF 克隆引物ura3_ble_pl 5 ‘ -TCCTCCCGCTCCATCCGTCGAG atggccaagttgaccagtgccgtt-3 ‘ 禾口 ura3_ble_p2 5' -GAAAGTCTAGAGAGCGCCG CGCCATtcagtcctgctcctcggccacg-3 ‘(其中大寫字母部分序列與pRtura3t克隆載體中原有的ura30RF翼側序列互補，小寫字母部分序列與博來霉素抗性基因ble ORF互補)。
2. RF I反應體系及流程以PPICZaA質粒(購自^witrogen公司)為模板，利用 ura3ble-pl 和 ura3ble-p2 為引物，進行 RF 第一輪擴增。體系(50 μ 1) 5XPrime buffer 10. Ομ 1, dNTPs (2. 5mmol/l)4. 0μ 1，上游引物(10 μ mol/1) 2. 0 μ 1，下游引物(lOymol/ 1)2. 0μ 1, PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大連 TakaRa) 1· 0 μ 1，pPICZ α A 質粒(lOOng/ μ 1) 1 μ 1，ddH20 加至 50 μ I0 反應條件95°C 3min，98°C 8s, 49°C 15s，72°C lmin，30 個循環，72°C 10min，4°C結束反應。RF I反應產物利用DNA片段膠回收純化試劑盒純化，-20°C 保存備用。
3. RF II 反應5 XPrime buffer 10. O μ 1，dNTPs (2. 5mmol/l) 4. O μ 1，實施例 4 中構建的T-pRtura3t質粒(lOOng/μ 1) 1. O μ 1，本實施例前述步驟中RF I反應產物(lOOng/ μ 1)5. Ομ 1, PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大連 TakaRa) 1. O μ 1，ddH20 加至 50 μ 1。反應條 # 95°C 3min，68°C 12min，之后 95°C 30s, 65°C 45s(_l°C /cyc)，68°C 12min，15 個循環，接下來再進行一輪95°C 30s, 55°C 45s, 68°C 12min，20 個循環，72°C lOmin，4°C結束反應。
4. DpnI消化和電擊轉化取8μ 1 RF II反應產物加入Ιμ DpnI (購自New England Biolabs)和 1 μ 1 DpnI buffer混勻后在37°C作用 120min去除原T_pRtura3t質粒后，分別取2μ1電擊轉化DH5ci感受態細胞，感受態細胞按標準方法制備(分子克隆實驗指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學出版社出版)，電擊轉化參數2200-2500V， 400Q，25yF，0°C。挑選Amp抗性轉化子進行增菌培養、質粒提取，并利用RF I反應所用引物ura3ble-pl和ura3ble-p2進行菌落PCR鑒定，鑒定陽性的重組載體送TaKaRa進行測序，得到5’端和3’端分別為ura3啟動子和ura3終止子的urdble表達盒，同時，該重組載體命名為Pura3ble。ble ORF序列如SEQ ID NO :6所示；完整的ura3ble表達盒如SEQ ID NO 7 所示。
實施例8 利用urdble表達盒進行Rtura3基因敲除兼博來霉素抗性表達 1. RturaiBble敲除盒的制備 以實施例5構建的PurUble載體為模板，以實施例4中的寡核苷酸序列 pRtura3t-pl和pRtura3t_p2為引物，進行Rtura3ble敲除盒的大量制備。PCR體系 (500 μ 1) 10 X Speed buffer 50. 0 μ 1, dNTPs (10mmol/l) 10. 0 μ 1，上游引物(lOymol/ 1)20. 0 μ 1，下游引物(10 μ mol/1) 20. 0 μ 1，SpeedSTAR HS DNA 聚合酶 5. 0 μ 1，基因組 DNA 模板(120ng/y 1)15. 0 μ 1, ddH20 加至 500 μ 1。反應條件98°C lmin，98°C 10s,65°C 60s, ；35個循環，72°C 10min，4°C結束反應。
PCR產物經(質量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳分析后利用PCR片段純化試劑盒(購自碧云天)進行純化。純化后的DNA片段濃度在300ng/yl，共50μ1，-20 保存 2.單倍體圓紅冬孢酵母ATCC 10788感受態細胞制備 R. toruloides npll感受態細胞的制備同實施例6中的操作項3。
3.圓紅冬孢酵母ATCC 10788的電擊轉化和轉化子的PCR鑒定 Rtura3ble 敲除盒的電擊轉化取 100 μ 1 R. toruloides ATCC 10788 感受態細胞，加入Rtura3ble敲除盒10 μ 1 (總共3 μ g)，混勻后移入預冷至0°C的電擊杯中，電壓0. 8-2. 0千伏，電阻200 Ω，電容25 μ F，時間4_10ms ；電擊后立即加入Iml YEPD, 30°C溫育 l-2h ；涂布含 20 μ g/ml Zeocin (購自 Invitrogen 公司)的 YEPD 平板，200 μ 1/ 平板，30°C 培養2-10d，約有100個轉化子陸續出現。
挑取4個kocin抗性轉化子于YEPD培養基中培養Mh，培養物利用生理鹽水 (0.9% NaCl緩沖液)進行倍比稀釋，選擇其10_3、10_4、10_5、10_6四個稀釋度，分別移取 10 μ 1菌液點樣于含5’ -FOA(購自上海金和生物技術有限公司)的SC固體培養基(0. 2% 5，_F0A，葡萄糖 70g/L，(NH4)2SO4O. lg/L，酵母粉 0. 75g/L，KH2PO4 0. 4g/L，MgSO4 ·7Η20 1. 5g/ L，pH 6. 0)平板，待液體吸收完全后，于30°C倒置培養3天，發現重組圓紅冬孢酵母ATCC 10788 Δ ura3: :ble具備5，_F0A抗性，而對照菌株圓紅冬孢酵母ATCC10788則無菌落生長。
以上結果說明，RturUble敲除盒(表達盒)在啟動博來霉素抗性基因在圓紅冬孢酵母中整合性表達的同時，可以滅活整合位置ura3基因編碼的乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶活性。這樣的設計有利于后期的遺傳操作。
實施例9 圓紅冬孢酵母特異性遺傳霉素抗性表達盒ura3kan的構建 ura3kan圓紅冬孢酵母特異性遺傳霉素抗性表達盒的構建，同樣是利用RF克隆的方法。
pRtura3t全長序列擴增和克隆見實施例4。
1.參照文獻方法(Van den Ent，F.，Lowe，J.，2006. RF cloning Are strict ion-free method for inserting target genes into ρlasmi ds. J. Biochem. Biophys. Methods 67:67-74)，設計 RF 克隆引物ura3_kan_pl 5 ‘ -TCCTCCCGCTCCATCCGTCGAG atgggtaaggaaaagactcacgt-3 ‘ 禾口 ura3_kan-p2 5' -GAAAGTCTAGAGAGCGCCG CGCCAT ttagaaaaactcatcgagcatc-3‘(其中大寫字母部分序列與pRtura3t克隆載體中原有的ura30RF翼側序列互補，小寫字母部分序列與遺傳霉素抗性基因kanmx4 ORF互補)。
2. RF I反應體系及流程以pFA6-kanmx4質粒(購自EUR0SCARF)為模板，利用 ura3kan-pl 和 ura3kan-p2 為引物，進行 RF 第一輪擴增。體系(50 μ 1) 5 XPrime buffer 10. 0 μ 1, dNTPs (2. 5mmol/l)4. 0μ 1，上游引物(10 μ mol/1) 2. 0 μ 1，下游引物(lOymol/ 1)2. 0μ 1, PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大連 TakaRa) 1· 0 μ 1，pFA6_kanmx4 質粒(llOng/ μ 1) 1 μ 1，ddH20 加至 50 μ I0 反應條件95°C 3min，98°C 8s, 49°C 15s，72°C lmin，30 個循環，72°C 10min，4°C結束反應。RF I反應產物利用DNA片段膠回收純化試劑盒純化，-20°C 保存備用。
3. RF II 反應5 XPrime buffer 10. 0 μ 1，dNTPs (2. 5mmol/l) 4. 0 μ 1，實施例 4 中構建的T-pRtura3t質粒(lOOng/μ 1) 1. 0 μ 1，本實施例前述步驟中RFI反應產物(IOOng/ μ 1)5. 0 μ 1, PrimeSTAR HS DNA 聚合酶 1. 0μ l，ddH20 加至 50 μ 1。反應條件:95 V 3min, 68°C 12min，之后 95°C 30s, 65°C 45s (-1 °C /cyc)，68°C 12min，15 個循環，接下來再進行一輪95°C 30s, 55°C 45s, 68°C 12min，20 個循環，72°C lOmin，4°C結束反應。
4. DpnI消化和電擊轉化取8μ 1 RF II反應產物加入Ιμ DpnI (購自New England Biolabs)和 1 μ 1 DpnI buffer 混勻后在37°C作用 120min去除原T_pl tura;3t質粒后，分別取2μ1電擊轉化DH5ci感受態細胞，感受態細胞按標準方法制備(分子克隆實驗指南第三版，薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學出版社出版)，電擊轉化參數2200-2500V，400Q，25yF，0°C。挑選Amp抗性轉化子進行增菌培養、質粒提取，并利用RF I反應所用引物ura3kan-p 1和ura3kan-p2進行菌落PCR鑒定，鑒定陽性的重組載體送TaKaRa進行測序， 得到5’端和3’端分別為ura3啟動子和ura3終止子的ura3kan表達盒，同時，該重組載體命名為Pura3kan。kanmx ORF序列如SEQID NO :8所示；完整的ura3kan表達盒如SEQ ID NO 9所示。
實施例10 利用ura3kan表達盒進行Rtura3基因敲除兼遺傳霉素抗性表達 1. Rtura3kan敲除盒的制備 以實施例9構建的PUra3kan載體為模板，以實施例4中的寡核苷酸序列 pRtura3t-pl和pRtura3t_p2為引物，進行Rtura3kan敲除盒的大量制備。PCR體系 (500 μ 1) 10 X Speed buffer 50. 0 μ 1，dNTPs (10mmol/l) 10. 0 μ 1，上游引物(lOymol/ 1)20. 0 μ 1，下游引物(10ymol/l)20. 0μ 1，SpeedSTAR HS DNA 聚合酶 5. 0 μ 1，基因組 DNA 模板(120ng/y 1)15. 0 μ 1, ddH20 加至 500 μ 1。反應條件98°C lmin，98°C 10s,65°C 60s, ；35個循環，72°C 10min，4°C結束反應。
PCR產物經1 % (質量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳分析后利用PCR片段純化試劑盒(購自碧云天)進行純化。純化后的DNA片段濃度在320ng/yl，共40μ1，-20 保存 2.單倍體圓紅冬孢酵母ATCC 10788感受態細胞制備 R. toruloides npll感受態細胞的制備同實施例6中的操作項3。
3.圓紅冬孢酵母ATCC 10788的電擊轉化和轉化子的PCR鑒定 Rtura3kan 敲除盒的電擊轉化取 100μ 1 R. toruloides ATCC 10788 感受態細胞，加入Rtura3kan敲除盒10 μ 1 (總共3. 2 μ g)，混勻后移入預冷至0°C的電擊杯中，電壓0. 8-2. 0千伏，電阻200 Ω，電容25 μ F，時間4_10ms ；電擊后立即加入Iml YEPD, 30°C溫育1-池；涂布含50yg/ml G418(購自北京舟鼎國)的YEPD平板，200 μ 1/平板，30°C培養 2-10d,約有60個轉化子陸續出現。
挑取3個G418抗性轉化子于YEPD培養基中培養Mh，培養物利用生理鹽水(0. 9% NaCl緩沖液)進行倍比稀釋，選擇其10_3、10_4、10_5、10_6四個稀釋度，分別移取10 μ 1菌液點樣于含5’-FOA(購自上海金和生物技術有限公司)的SC固體培養基(0.2% 5’-F0A， 葡萄糖 70g/L, (NH4)2SO4O. lg/L，酵母粉 0. 75g/L，KH2PO4 0. 4g/L，MgSO4 · 7H20 1. 5g/L， PH 6.0)平板，待液體吸收完全后，于30°C倒置培養3天，發現重組圓紅冬孢酵母ATCC 10788 Δ ura3: :kan具備5，_F0A抗性，而對照菌株圓紅冬孢酵母ATCC10788則無菌落生長。
以上結果說明，Rtura3kan敲除盒(表達盒)在啟動遺傳霉素抗性基因在圓紅冬孢酵母中整合性表達的同時，可以滅活整合位置的ura3基因編碼的乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶活性。這樣的設計有利于后期的遺傳操作。
實施例11 :PRtura3啟動子和Rtura3t終止子的屬內(不同種間)活性測定 也即ura3gfp、ura3ble、ura3kan 等表達盒在 R. babjevae 的功能驗證。
在此利用^SrDNA基因做為整合位點，通過融合PCR方法使每個整合表達盒5’末端攜帶有約500bp的^SrDNA基因同源重組臂，分別進行ura3gfp表達盒、urdble表達盒、 ura3kan表達盒在R. babjevae中的整合性表達。
1.根據 NCBI 公布的 R. babjevae 26SrDNA 序列(NO. :EF595746)，設計一對引物Rb26S-Rtura3-pl :5’ -AGCGGCGAGCGAAGCGGTAAG-3，和 Rb26S_Rtura3_p2 :5’ -cccacgtcttg ttgctccggtcaACGCTGCGTTCCTCAGTCCCC-3，(其中大寫字母部分序列與R. babjevae 26SrDNA 序列3’端同源，小寫字母部分序列與圓紅冬孢酵母pura3啟動子5’端互補)。
2. Rb26S-Rtura3gfp、Rb26S_Rtura3ble、Rb26S-Rtura3kan 的構建 分別利用實施例5、實施例7和實施例9中的Pura3gfp、Pura3ble和Pura3kan載體為模板，分別進行 M^6S-Rtura3gfb、M^6S-Rtura3ble、Rb26S-Rtura3kan 等 3 個融合表達盒的構建。PCR體系(各 500 μ 1) 10 X Speedbuffer 50. 0 μ 1, dNTPs (10mmol/l) 10. 0 μ 1， 上游引物(10μπιο1/1)20. 0μ 1，下游引物(10 μ mol/1) 20. 0 μ 1, SpeedSTAR HS DNA 聚合酶 5.0 μ 1，DNA 模板質粒 Rira3gfp 或 Pura3ble 或 Rira3kan (均 120ng/y 1)15.0 μ l,ddH20 加至 500 μ 1。反應條件98°C lmin,98°C 10s，65°C 60s，；35 個循環，72°C 10min，4°C 結束反應。
PCR產物經(質量/體積濃度)瓊脂糖凝膠電泳分析后利用PCR片段純化試劑盒(購自碧云天)進行純化。純化后的Rl^6S-Rtura3gfp、Rb26S-Rtura3ble和 Rb26S-Rtura3kan 表達盒濃度分別為 300ng/μ l、280ng/y 1 和 ^Ong/μ 1，均 40μ 1,-20 °C
保存備用。
3. R. babjevae ATCC90942 感受態細胞制備 R. babjevae ATCC90942購自購自美國標準生物品收藏中心。首先，挑菌落接種 IOml YEPD培養基，觀°C，200rpm，培養24h ；培養物1 50比例轉接新鮮YEPD培養基， 100ml (500ml 錐形瓶，裝液量 100ml)，28°C，200rpm,培養 7-10h, OD 值達到 0. 6-1. 2 ；培養物冰浴 10-30min，4°C，4000rpm 離心 5min，棄上清；0°C無菌 Milli-Q 水洗 1 次；0°C lmol/1 山梨醇洗滌2次；冰浴，備用。
4. R. babjevae ATCC90942的電擊轉化和表達結果觀察 取3 份 100 μ 1 R. babjevae ATCC90942 感受態細胞，分別加入 Rl^6S-Rtura3gfp、 Rb26S-Rtura3ble和Rl^6S-Rtura3kan表達盒各10 μ 1，混勻后移入預冷至0°C的電擊杯中，電壓0. 8-2. 0千伏，電阻200 Ω，電容25 μ F，時間4-lOms ；電擊后立即加入Iml YEPD, 30°C 溫育 1- ；Rb26S-Rtura3gfp 轉化液涂布 YEPD 平板，10 μ 1/ 平板；Rb26S-Rtura3ble 轉化液涂布含20 μ g/mlZeocin (購自hvitrogen公司)的YEPD平板，200 μ 1/平板； Rb26S-Rtura3kan轉化液涂布含50 μ g/ml G418 (購自北京舟鼎國)的YEPD平板，200 μ 1/ 平板；均培養2-10d。
R. babjevae ATCC90942/Rb26S-Rtura3gfp 轉化子逐一挑單克隆利用熒光顯微鏡進行鏡檢，每30個轉化子中可有一個熒光表達的陽性重組子，熒光相片略; Rb26S-Rtura3ble轉化液涂布含20 μ g/ml Zeocin的YEPD平板，培養5d時可觀察到大小不一的抗性重組子，平均200個/平板，轉化重組效率400個重組子/ μ g表達盒DNA ； Rb26S-Rtura3kan轉化液涂布含50 μ g/ml G418的YEPD平板，培養6d時可觀察到大小不一的抗性重組子，平均100個/平板，轉化重組效率200個重組子/ μ g表達盒DNA。
各表達盒在R. babjevae ATCC90942的表觀轉化重組效率，比在R. toruloides ATCC10788中的表觀轉化重組效率高，可能是由于在R. babjevaeATCC90942進行的是單位點同源重組，而在R. toruloides ATCC 10788進行的是雙位點同源重組的原因。
以上實施例證明，ura3啟動子能夠啟動綠色熒光蛋白基因、博來霉素抗性基因和遺傳霉素抗性基因在R. toruloides ATCC 10788中和R. bab jevaeATCC90942中的整合性表達，具有屬內啟動子活性；ura3gfp表達盒、ura3ble表達盒、ura3kan表達盒為基礎構建的線性DNA敲除盒，能夠敲除圓紅冬孢酵母基因組上的ura3靶基因。
使用本發明的啟動子和終止子，可實現目的基因在圓紅冬孢酵母中的表達或特定靶基因的選擇性敲除，本發明提供了用于遺傳工程圓紅冬孢酵母的啟動子、終止子和一系列DNA構建體。為圓紅冬孢酵母開啟了一條育種新途徑，并因此可以提供具有工業用途的新型圓紅冬孢酵母。并為紅冬孢酵母屬的其它酵母菌的遺傳操作提供了方法和平臺。
本發明的有益效果是 為圓紅冬孢酵母或紅冬孢酵母屬的酵母菌提供了啟動子、終止子、選擇性標記基因表達盒和遺傳轉化方法，將有力促進今后的圓紅冬孢酵母或紅冬孢酵母屬的酵母菌的菌株改良研究，加快圓紅冬孢酵母代謝工程研究。
0158]SEQ ID NO10159]TGACCGGAGCMCMGACGTGGGCGAGTATACGCACTGGATGCAGGCGCCGACGCGTTTC600160]TTGCACAMTAGCAGACCTGCGMCGMCTCTTCGTCAGCTCGMGCTTGAMGACTCGC1200161]CGCTTTCGACTCACCAGCTTCCATCGACTCTTGGGGATGTTCTCGAGACCGTCGACCGGC1800162]TCCATATACACCGTGTTGCTGACGCCTGTTTCGGGMCCCAGATCGCGCAGAGCMGTGT2400163]GCCCACTGGCCCGTTGTCGTTTGTTTGMGGCGCCGTACGAGTTGGGGCAMGCACGCAG3000164]GTCTACGAGAGATMTAGTCAGGTTTTGAGCGTAGCAMGGCCCCGGACGGAMCGCACG3600165]ACTGGCTTGTCGGGCGAGACGGTGCATTTGCGGCAGAGCCACTGTCCTTCCGGGATGTAC4200166]GGMCGCCGTAGCMTCTGCGAGGMGCGACAMGATGAGCATCAGATCCTCGTCGTGAC4800167]CACGCTGTGCAGCCATGCMCGTGAGMCTCGCGACGCACCTTGGTGGACCGCCMGTTG5400168]CATCCGTCGCAGMGACGATCGCATTCGAGTTCTCGCACTCGCCGTCGTCGCAMTGGCA6000169]CATTTGCTGTCTTCGCTCGGCMGGCATTCGTCCGCTTCGGGATATTGCGAGTCTGCGM6600170]AGACGAGCGAGACGGTCAGCAGGTCGCGAGMGTTGAGGGAGGGCGAGMCGGACCAGGT7200171]CGMCCACTCCTTCTCMTCTTGTCCATGACMTCTCAMGAGCTCGTACGGGATGGTGG7800172]CMGACCGTCCTTCTTCCGCTCCGCGTTGAGCGTGTCGAGCCAGAGTTGGTCTGTGGGTT8400173]TCGCCGTCCATACAGGCTGTCAGCTGTCGTACAMTCGTCMGCCTGCCTGAGAGMCCT9000174]CCCACCTTGCTCGTCCATGTCATACTCMCCTGCTTCGCCAGGTCCGACTCCATAGGTTC9600175]TGTGGGAGACGGAGGGAGGGTGAGTAAGTCGACTTTTGAGACGCTGGTCC GCCTGCAGAG10200176]GCGCAGACATCGMGAGCGATCTTCGAGTGCTCCTGCAGCATCTGCACGTCCGTCCGGGC10800177]GTCGCTCGCTGCTCCAGAGACGCGACAMCMTCCCCACTTGACGAGGATCGMGCGACT11400178]CACGCAGCCACCGCAGGTACCGCCCCGGCTCGCCATCCGCTATGCCCTTG TACGCATCCC12000179]ATTCCTGGCCGTCATTGTACCCGAACGCGACGAGCTGGGGGTTGTGAACA TCGGGCGGAG12600180]CGGGGGTGCTCGTGTCGACGACGCGAMGTTGACGACTGGGAGTGCGAGA GACGAGCCGT13200181]GAGCTCCTGGCATCCCGTTGGCAGTGTGTGAGCGTTCTACTGATGMGTC GAGGAGAGGA13800182]AGAGMGGTTGTCGCTGGACTGCTCGCTCCTACTGTCCCTGTGAGGCTAC GGGACTGCTT14400183]TCCGAGTCTATCAGAGCTACCTGMGCCCTTAGTACCGCTCGACTTGCGC GCCACCCCAT15000184]CTCCTCCTCCTCCCGCTCCATCCGTCGAG15290185]SEQ ID NO2
16 ATGGCGCGGCGCTCTCTAGACTTTCGMCGAGTGTMGGCTATCTTGACAACMCATGCA60 CMTCCGGTCGAGTCTACMCGTCTATCGCCTCTTCACGGACCGCTTCGGACCTGTCTGG120 ACGACGTGGCTTGATGCGMGCTGGGTAGCCACTTGTCGCTCGMCTCTTCGCCMTGGC180 TGTTTCTTCGGTGGCGCGGCTGCCGTCTTGGCGGAMCMGAGMGGGMGGGCGATGGC240 TGCTTCGCGCTGAGTTGAGCTGAGGAGGCGGMGMGAGACGTTCGACAGGCTGTTGTGG300 GCGGAGAGCGGTCGTGTGGGCGCCTCCTGCTTCGCCTTAGCCGACGACGACGCGMGTAC360 GACGACTCGACGATCTCGACGTCGCTGCTGTCGTCGTCATTCCGCGCCTTTGCTGGTCGG420 GCGGGCACCTCATTCTCCATCTCCCTCMCCTCTGCTCTTCTCGCACCGCAGCTCGCATC480 GTTTCCTCATCCGCATACTCCAGCTCATCATCCTCGTCATCGCTGTACTCGCGCGAGACC540 TCGCACTCGTCCATCAGCGTGCGCTCGTGCCGCTTCTTCGTTGGCGAGGCGAGCAGCTTC600 GATTTGTTGTTGACCTTGMGGACGGGCCGTCAGAGGGAGGTGMGGCGATCTGTACGAG660 CGCGAGGAGGCCGTGCGCTTGMCTGGCGCGMGGGMGGAGGTGGAGGGGTTGTCGGTC720 ATAGGGGATTCTTCGGCGTCACTGTCCGTCGCGACGATGCCGCGCTTCGCTCGCAGCTCG780 GCMCTTTCTTCTTCAGGCGCGCGAGCTGTGGCACATCGTCTGTTAGCTCGACTAGTGCG840 MCGMGGMMGACCGGGCCACGCACGTCGGCTTCGTACCGCTTGTTGGCTCCCTCCAC900 CCGCCTCCGCTTCTCCTCCT CCTGCTT927 SEQ ID NO 3 (圓紅冬孢酵母乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶啟動子、圓紅冬孢酵母乳清畫I核苷-5'-磷酸脫羧酶終止子) TGACCGGAGCMCMGACGTGGGCGAGTATACGCACTGGATGCAGGCGCCGACGCGTTTC60 TTGCACAMTAGCAGACCTGCGMCGMCTCTTCGTCAGCTCGMGCTTGAMGACTCGC120 CGCTTTCGACTCACCAGCTTCCATCGACTCTTGGGGATGTTCTCGAGACCGTCGACCGGC180 TCCATATACACCGTGTTGCTGACGCCTGTTTCGGGMCCCAGATCGCGCAGAGCMGTGT240 GCCCACTGGCCCGTTGTCGTTTGTTTGMGGCGCCGTACGAGTTGGGGCAMGCACGCAG300 GTCTACGAGAGATMTAGTCAGGTTTTGAGCGTAGCAMGGCCCCGGACGGAMCGCACG360 ACTGGCTTGTCGGGCGAGACGGTGCATTTGCGGCAGAGCCACTGTCCTTCCGGGATGTAC420 GGMCGCCGTAGCMTCTGCGAGGMGCGACAMGATGAGCATCAGATCCTCGTCGTGAC480 CACGCTGTGCAGCCATGCMCGTGAGMCTCGCGACGCACCTTGGTGGACCGCCMGTTG540 CATCCGTCGCAGMGACGATCGCATTCGAGTTCTCGCACTCGCCGTCGTCGCAMTGGCA600 CATTTGCTGTCTTCGCTCGGCMGGCATTCGTCCGCTTCGGGATATTGCGAGTCTGCGM660 AGACGAGCGAGACGGTCAGCAGGTCGCGAGMGTTGAGGGAGGGCGAGMCGGACCAGGT720 CGMCCACTCCTTCTCMTCTTGTCCATGACMTCTCAMGAGCTCGTACGGGATGGTGG780 CMGACCGTCCTTCTTCCGCTCCGCGTTGAGCGTGTCGAGCCAGAGTTGGTCTGTGGGTT840 TCGCCGTCCATACAGGCTGTCAGCTGTCGTACAMTCGTCMGCCTGCCTGAGAGMCCT900 CCCACCTTGCTCGTCCATGTCATACTCMCCTGCTTCGCCAGGTCCGACTCCATAGGTTC960 TGTGGGAGACGGAGGGAGGGTGAGTAAGTC GACTTTTGAG ACGCTGGTCC GCCTGCAGAG1020 GCGCAGACATCGMGAGCGATCTTCGAGTG CTCCTGCAGC ATCTGCACGTCCGTCCGGGC1080 GTCGCTCGCTGCTCCAGAGACGCGACAMC MTCCCCACTTGACGAGGATCGMGCGACT1140 CACGCAGCCACCGCAGGTACCGCCCCGGCTCGCCATCCGC TATGCCCTTG TACGCATCCC1200 ATTCCTGGCCGTCATTGTACCCGMCGCGA CGAGCTGGGG GTTGTGMCA TCGGGCGGAG1260 CGGGGGTGCTCGTGTCGACGACGCGAMGTTGACGACTGGGAGTGCGAGA GACGAGCCGT1320 GAGCTCCTGGCATCCCGTTGGCAGTGTGTGAGCGTTCTACTGATGMGTC GAGGAGAGGA1380 AGAGMGGTTGTCGCTGGACTGCTCGCTCCTACTGTCCCTGTGAGGCTACGGGACTGCTT1440 TCCGAGTCTATCAGAGCTACCTGMGCCCTTAGTACCGCTCGACTTGCGCGCCACCCCAT1500 CTCCTCCTCCTCCCGCTCCATCCGTCGAGATGCCGTCCATCACGACCCGCACCTACGCCG1560 MCGGGCTGCCMGCACCCCGTCCCGGTCGCAMGCAGTTGCTCGACATCTGCGACCGCA1620 AAMGACCMCCTCTGCGTTTCAGTCGACGTGACGAGCMGGCGGGCCTGCTCAGGATCG1680 CAGAGGCTGCCGGCCCGTACTGCTGCTGCATCMGGTAGGTTGTACCGGCGCTGMGTAA1740 TCCGAGGACCGCAGCTGACAGACCGAGACACCGACGATAGACCCACATCGACATCGTCGA1800 GGACTTTGACCGGGATCTCGTTCAGCMCTGCAGGCTCTC GCAGACAAGCACGATTTTCT1860 GATTTGGGAGGACCGCMGTTTGCCGACATCGGTGCGTCAATCGAGACTCCCGACTACCT1920 TCCCCGCTGATGGCCCGCGAGACGACAGGCMCACCGTTCGGCTGCAGTACTCGTCCGGT1980 ATCTACAAGATCGCATCCTGGGCGCACATCACCMCGCCCACTTGGTCCCCGGCGAGGGC2040 ATCCTGACGGGCCTCGCATCCGTCGGTCTGCCCCTTGGCCGCGGTCTCCTGCTTCTCGCC2100 GAGATGAGCGCCMGGGCMCCTCGCGACTGGCGAGTACACGGCCMGMTGTCGAGGCG2160 GCGAGGCGGCATCCTGMTTCGTGATGGGCTTCGTTGCGATGCGGAGGGTGGACGAGCGG2220 GAAGAGACGGCTGGCGGTGTTGCGCCGGGAGMGGGGTGCGTCCCATCTCACTCTTTTCC2280 GCTCMCTTCAGCTGACTCCGTGCTCCACCAGGCCGACTACGTCATCATGACGCCCGGCG2340 TCGGACTCGACTCGMGGGCGACGGCATGGGCCAGCAGTACCGTACACCC GACGAGGTCA2400 TCCGCGAGTCCGGCTGCGACGTTATCATCGTCGGTCGGGGTATCTACGGCGGCGGCGACG2460 GCMCCCTMCGMGAGATCGTCMGCAGTGCMGCGGTATCAGGAGGCGGGCTGGMGG2520 CGTACGAGGACAGGCTGAGGCAGTGAATGGCGCGGCGCTCTCTAGACTTTCGMCGAGTG2580 TAAGGCTATCTTGACAACMCATGCACMTCCGGTCGAGTCTACMCGTCTATCGCCTCT2640 TCACGGACCGCTTCGGACCTGTCTGGACGACGTGGCTTGATGCGMGCTGGGTAGCCACT2700 TGTCGCTCGAACTCTTCGCCAATGGCTGTTTCTTCGGTGGCGCGGCTGCCGTCTTGGCGG2760 AAACMGAGAAGGGMGGGCGATGGCTGCTTCGCGCTGAGTTGAGCTGAGGAGGCGGMG2820 MGAGACGTTCGACAGGCTGTTGTGGGCGGAGAGCGGTCGTGTGGGCGCCTCCTGCTTCG2880 CCTTAGCCGACGACGACGCGAAGTACGACG ACTCGACGAT CTCGACGTCGCTGCTGTCGT2940 CGTCATTCCGCGCCTTTGCTGGTCGGGCGGGCACCTCATTCTCCATCTCCCTCAACCTCT3000 GCTCTTCTCGCACCGCAGCTCGCATCGTTTCCTCATCCGCATACTCCAGCTCATCATCCT3060 CGTCATCGCTGTACTCGCGCGAGACCTCGCACTCGTCCATCAGCGTGCGCTCGTGCCGCT3120 TCTTCGTTGGCGAGGCGAGCAGCTTCGATTTGTTGTTGACCTTGMGGACGGGCCGTCAG3180 AGGGAGGTGAAGGCGATCTGTACGAGCGCGAGGAGGCCGTGCGCTTGMCTGGCGCGMG3240 GGMGGAGGTGGAGGGGTTGTCGGTCATAGGGGATTCTTCGGCGTCACTGTCCGTCGCGA3300 CGATGCCGCGCTTCGCTCGCAGCTCGGCMCTTTCTTCTTCAGGCGCGCGAGCTGTGGCA3360 CATCGTCTGTTAGCTCGACTAGTGCGMCGMGGAAMGACCGGGCCACGCACGTCGGCT3420 TCGTACCGCTTGTTGGCTCCCTCCACCCGCCTCCGCTTCTCCTCCTCCTGCTT3473 SEQ ID NO :4(綠色熒光蛋白編碼基因) ATGAGTAMG GAGMGMCTTTTCACTGGA GTTGTCCCMTTCTTGTTGA ATTAGATGGT60GATGTTMTG GGCACAMTT AMCTTACCC TTAMTTTAT GTCACTACTT TCTCTTATGG CATGACTTTT TCMGAGTGC AMGATGACG GGMCTACM MTCGTATCG AGTTAAMGG CTCGAGTACA ACTATMCTC ATCAMGCTA ACTTCAAMT CATTATCMC AAMTACTCC CTGTCGACAC MTCTGCCCT CTTGAGTTTG TMCTGCTGC SEQ ID NO :5(綠色熒光蛋白編碼基因) TGACCGGAGC TTGCACAMT CGCTTTCGAC TCCATATACA GCCCACTGGC GTCTACGAGA ACTGGCTTGT GGMCGCCGT CACGCTGTGC CATCCGTCGC CATTTGCTGT AGACGAGCGA CGMCCACTC CMGACCGTC TCGCCGTCCA CCCACCTTGC TGTGGGAGAC GCGCAGACAT GTCGCTCGCT CACGCAGCCA ATTCCTGGCC CGGGGGTGCT GAGCTCCTGG AGAGMGGTT TCCGAGTCTA CTCCTCCTCC TTGTCCCMT
TTCTGTCAGTGGAGAGGGTGMGGTGATGCMCATACGGA120TTGCACTACTGGAAMCTACCTGTTCCATGGCCMCACTT180TGTTCMTGCTTTTCCCGTTATCCGGATCATATGAMCGG240CATGCCCGMGGTTATGTACAGGMCGCACTATATCTTTC300GACGCGTGCTGMGTCMGTTTGMGGTGATACCCTTGTT360TATTGATTTTAMGMGATGGAMCATTCTCGGACACAM420ACACMTGTATACATCACGGCAGACAMCAAMGMTGGA480TCGCCACMCATTGMGATGGATCCGTTCAACTAGCAGAC540MTTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACMCCATTAC600TTCGAMGATCCCMCGAMAGCGTGACCACATGGTCCTT660TGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAMTM717
MCMGACGTGGGCGAGTATACGCACTGGATGCAGGCGCCGACGCGTTTC60AGCAGACCTGCGMCGMCTCTTCGTCAGCTCGMGCTTGAMGACTCGC120TCACCAGCTTCCATCGACTCTTGGGGATGTTCTCGAGACCGTCGACCGGC180CCGTGTTGCTGACGCCTGTTTCGGGMCCCAGATCGCGCAGAGCMGTGT240CCGTTGTCGTTTGTTTGMGGCGCCGTACGAGTTGGGGCAMGCACGCAG300GATMTAGTCAGGTTTTGAGCGTAGCAMGGCCCCGGACGGAMCGCACG360CGGGCGAGACGGTGCATTTGCGGCAGAGCCACTGTCCTTCCGGGATGTAC420AGCMTCTGCGAGGMGCGACAMGATGAGCATCAGATCCTCGTCGTGAC480AGCCATGCMCGTGAGMCTCGCGACGCACCTTGGTGGACCGCCMGTTG540AGMGACGATCGCATTCGAGTTCTCGCACTCGCCGTCGTCGCAMTGGCA600CTTCGCTCGGCMGGCATTCGTCCGCTTCGGGATATTGCGAGTCTGCGM660GACGGTCAGCAGGTCGCGAGMGTTGAGGGAGGGCGAGMCGGACCAGGT720CTTCTCMTCTTGTCCATGACMTCTCAMGAGCTCGTACGGGATGGTGG780CTTCTTCCGCTCCGCGTTGAGCGTGTCGAGCCAGAGTTGGTCTGTGGGTT840TACAGGCTGTCAGCTGTCGTACAMTCGTCMGCCTGCCTGAGAGMCCT900TCGTCCATGTCATACTCMCCTGCTTCGCCAGGTCCGACTCCATAGGTTC960GGAGGGAGGGTGAGTAAGTCGACTTTTGAG ACGCTGGTCC GCCTGCAGAG1020CGMGAGCGATCTTCGAGTGCTCCTGCAGC ATCTGCACGTCCGTCCGGGC1080GCTCCAGAGACGCGACAMCMTCCCCACTTGACGAGGATCGAAGCGACT1140CCGCAGGTACCGCCCCGGCTCGCCATCCGC TATGCCCTTG TACGCATCCC1200GTCATTGTACCCGMCGCGACGAGCTGGGG GTTGTGMCA TCGGGCGGAG1260CGTGTCGACGACGCGAMGTTGACGACTGG GAGTGCGAGA GACGAGCCGT1320CATCCCGTTGGCAGTGTGTGAGCGTTCTAC TGATGMGTC GAGGAGAGGA1380GTCGCTGGACTGCTCGCTCCTACTGTCCCT GTGAGGCTAC GGGACTGCTT1440TCAGAGCTACCTGMGCCCTTAGTACCGCTCGACTTGCGC GCCACCCCAT1500TCCCGCTCCATCCGTCGAGATGAGTAMGG AGMGMCTTTTCACTGGAG1560TCTTGTTGMTTAGATGGTGATGTTMTGG GCACAMTTTTCTGTCAGTG1620
63
64
65
66
68
72
73
74
75
78
79
80 81 82
83
84
85
86
87
88
89
90
92
93
95
96
99
78901234567890123456789012345678901 66677777777778888888888999999999900 222222222222222222222222222222222222233
Ooooooooooooooooooooooooooooooooooooooo
___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___
19GAGAGGGTGA GAAMCTACC TTTCCCGTTA GTTATGTACA MGTCMGTT MGMGATGG ACATCACGGC TTGMGATGG GCCCTGTCCT CCMCGAAM ATGGCATGGA TAAGGCTATC TCACGGACCG TGTCGCTCGA AAACMGAGA MGAGACGTT CCTTAGCCGA CGTCATTCCG GCTCTTCTCG CGTCATCGCT TCTTCGTTGG AGGGAGGTGA GGMGGAGGT CGATGCCGCG CATCGTCTGT TCGTACCGCT SEQ ID NO； ATGGCCMGT GAGTTCTGGA GTGGTCCGGG MCACCCTGG GTCGTGTCCA CCGTGGGGGC GAGGAGCAGG SEQ ID NO； TGACCGGAGC TTGCACAMT CGCTTTCGAC TCCATATACA
AGGTGATGCAACATACGGMMCTTACCCTTAMTTTATTTGCACTACTG1680TGTTCCATGGCCMCACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCMTGCT1740TCCGGATCATATGAMCGGCATGACTTTTTCMGAGTGCCATGCCCGMG1800GGMCGCACTATATCTTTCAMGATGACGGGMCTACMGACGCGTGCTG1860TGMGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAMGGTATTGATTTTA1920AMCATTCTCGGACACAMCTCGAGTACMCTATMCTCACACAATGTAT1980AGACAAACMMGMTGGMTCAMGCTMCTTCAAMTT CGCCACMCA2040ATCCGTTCMCTAGCAGACCATTATCMCAAMTACTCCA ATTGGCGATG2100TTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAATCTGCCCTTTCGAMGATC2160GCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTMCTGCTGCTGGGATTACAC2220TGAGCTCTACAMTGAATGGCGCGGCGCTCTCTAGACTTTCGMCGAGTG2280TTGACAACMCATGCACMTCCGGTCGAGTCTACMCGTCTATCGCCTCT2340CTTCGGACCTGTCTGGACGACGTGGCTTGATGCGMGCTGGGTAGCCACT2400ACTCTTCGCCAATGGCTGTTTCTTCGGTGGCGCGGCTGCCGTCTTGGCGG2460AGGGMGGGCGATGGCTGCTTCGCGCTGAGTTGAGCTGAGGAGGCGGAAG2520CGACAGGCTGTTGTGGGCGGAGAGCGGTCGTGTGGGCGCCTCCTGCTTCG2580CGACGACGCGAAGTACGACGACTCGACGATCTCGACGTCGCTGCTGTCGT2640CGCCTTTGCTGGTCGGGCGGGCACCTCATT CTCCATCTCCCTCAACCTCT2700CACCGCAGCTCGCATCGTTTCCTCATCCGCATACTCCAGCTCATCATCCT2760GTACTCGCGCGAGACCTCGCACTCGTCCATCAGCGTGCGCTCGTGCCGCT2820CGAGGCGAGCAGCTTCGATTTGTTGTTGACCTTGMGGACGGGCCGTCAG2880AGGCGATCTGTACGAGCGCGAGGAGGCCGTGCGCTTGMCTGGCGCGMG2940GGAGGGGTTGTCGGTCATAGGGGATTCTTCGGCGTCACTGTCCGTCGCGA3000CTTCGCTCGCAGCTCGGCMCTTTCTTCTTCAGGCGCGCGAGCTGTGGCA3060TAGCTCGACTAGTGCGMCGMGGAAMGACCGGGCCACGCACGTCGGCT3120TGTTGGCTCCCTCCACCCGCCTCCGCTTCTCCTCCTCCTGCTT3173:6(博來霉素抗性基因ble)TGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTC60CCGACCGGCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCCGGT120ACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGAC180CCTGGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAG240CGMCTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACCGAGATCGGCGAGCAG300GGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCC360ACTGA375:7(博來霉素抗性基因ble)
MCMGACGT GGGCGAGTAT ACGCACTGGA TGCAGGCGCC GACGCGTTTC60
AGCAGACCTG CGMCGMCT CTTCGTCAGC TCGMGCTTG AMGACTCGC120
TCACCAGCTT CCATCGACTC TTGGGGATGT TCTCGAGACC GTCGACCGGC180
CCGTGTTGCT GACGCCTGTT TCGGGMCCC AGATCGCGCA GAGCMGTGT240
20 21 22
23
24
25
26 27
23456789012345678901234567890123 00000000111111111122222222223333
333333333333333333333333333333333333333
Ooooooooooooooooooooooooooooooooooooooo
___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___
328
329
30
31
32
33
34
335
336
337
338
339
340GCCCACTGGCCCGTTGTCGTTTGTTTGMG GCGCCGTACGAGTTGGGGCAMGCACGCAG300GTCTACGAGAGATMTAGTC AGGTTTTGAGCGTAGCAMGGCCCCGGACGGAMCGCACG360ACTGGCTTGTCGGGCGAGAC GGTGCATTTGCGGCAGAGCCACTGTCCTTCCGGGATGTAC420GGMCGCCGTAGCMTCTGC GAGGMGCGACAMGATGAGCATCAGATCCTCGTCGTGAC480CACGCTGTGCAGCCATGCMCGTGAGMCTCGCGACGCACCTTGGTGGACCGCCMGTTG540CATCCGTCGCAGMGACGATCGCATTCGAGTTCTCGCACTCGCCGTCGTCGCAMTGGCA600CATTTGCTGTCTTCGCTCGGCMGGCATTC GTCCGCTTCGGGATATTGCGAGTCTGCGM660AGACGAGCGAGACGGTCAGC AGGTCGCGAG MGTTGAGGGAGGGCGAGMCGGACCAGGT720CGMCCACTCCTTCTCMTCTTGTCCATGACMTCTCAMGAGCTCGTACGGGATGGTGG780CMGACCGTCCTTCTTCCGCTCCGCGTTGA GCGTGTCGAGCCAGAGTTGGTCTGTGGGTT840TCGCCGTCCATACAGGCTGTCAGCTGTCGT ACAMTCGTCMGCCTGCCTGAGAGMCCT900CCCACCTTGCTCGTCCATGTCATACTCMCCTGCTTCGCCAGGTCCGACTCCATAGGTTC960TGTGGGAGACGGAGGGAGGGTGAGTAAGTCGACTTTTGAGACGCTGGTCC GCCTGCAGAG1020GCGCAGACATCGMGAGCGATCTTCGAGTGCTCCTGCAGCATCTGCACGTCCGTCCGGGC1080GTCGCTCGCTGCTCCAGAGACGCGACAMCMTCCCCACTTGACGAGGATCGMGCGACT1140CACGCAGCCACCGCAGGTACCGCCCCGGCTCGCCATCCGCTATGCCCTTG TACGCATCCC1200ATTCCTGGCCGTCATTGTACCCGMCGCGACGAGCTGGGGGTTGTGMCA TCGGGCGGAG1260CGGGGGTGCTCGTGTCGACGACGCGAMGTTGACGACTGGGAGTGCGAGA GACGAGCCGT1320GAGCTCCTGGCATCCCGTTGGCAGTGTGTGAGCGTTCTACTGATGMGTC GAGGAGAGGA1380AGAGMGGTTGTCGCTGGACTGCTCGCTCCTACTGTCCCTGTGAGGCTACGGGACTGCTT1440TCCGAGTCTATCAGAGCTACCTGMGCCCTTAGTACCGCTCGACTTGCGCGCCACCCCAT1500CTCCTCCTCCTCCCGCTCCATCCGTCGAGATGGCCMGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGC1560TCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCTCGGGTTCTCCC1620GGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCCGGTGTGGTCCGGGACGACGTGACCCTGTTCATCA1680GCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGGTGTGGGTGCGCGGCC1740TGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGMCTTCCGGGACGCCTCCG1800GGCCGGCCATGACCGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTTCGCCCTGCGCGACC1860CGGCCGGCMCTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGAATGGCGCGGCGCTCTC1920TAGACTTTCGAACGAGTGTAAGGCTATCTTGACMCMCATGCACMTCCGGTCGAGTCT1980ACMCGTCTATCGCCTCTTCACGGACCGCTTCGGACCTGT CTGGACGACGTGGCTTGATG2040CGMGCTGGGTAGCCACTTGTCGCTCGMCTCTTCGCCMTGGCTGTTTCTTCGGTGGCG2100CGGCTGCCGTCTTGGCGGMACMGAGMGGGMGGGCGATGGCTGCTTCGCGCTGAGTT2160GAGCTGAGGAGGCGGAAGMGAGACGTTCGACAGGCTGTTGTGGGCGGAG AGCGGTCGTG2220TGGGCGCCTCCTGCTTCGCCTTAGCCGACGACGACGCGMGTACGACGACTCGACGATCT2280CGACGTCGCTGCTGTCGTCGTCATTCCGCGCCTTTGCTGGTCGGGCGGGCACCTCATTCT2340CCATCTCCCTCMCCTCTGCTCTTCTCGCACCGCAGCTCGCATCGTTTCCTCATCCGCAT2400ACTCCAGCTCATCATCCTCGTCATCGCTGTACTCGCGCGAGACCTCGCACTCGTCCATCA2460GCGTGCGCTCGTGCCGCTTCTTCGTTGGCG AGGCGAGCAGCTTCGATTTGTTGTTGACCT2520TGMGGACGGGCCGTCAGAGGGAGGTGMG GCGATCTGTACGAGCGCGAGGAGGCCGTGC2580
123456789012345678901234567890123456789
44444444455555555556666666666777777777
333333333333333333333333333333333333333
Ooooooooooooooooooooooooooooooooooooooo
___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___
68
69
70 ；71
72
73
74
75
丨37.
378
37GCTTGMCTG GCGCGAAGGGAAGGAGGTGGAGGGGTTGTC GGTCATAGGG GATTCTTCGG2640CGTCACTGTCCGTCGCGACGATGCCGCGCTTCGCTCGCAG CTCGGCMCTTTCTTCTTCA2700GGCGCGCGAGCTGTGGCACATCGTCTGTTAGCTCGACTAG TGCGMCGM GGAAMGACC2760GGGCCACGCACGTCGGCTTCGTACCGCTTGTTGGCTCCCTCCACCCGCCTCCGCTTCTCC2820TCCTCCTGCTT2831SEQ ID NO 8 (遺傳霉素抗性基因kanmX4)ATGGGTMGGAAMGACTCACGTTTCGAGGCCGCGATTMATTCCMCATGGATGCTGAT60TTATATGGGTATAMTGGGCTCGCGATMTGTCGGGCMTCAGGTGCGACMTCTATCGA120TTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAMCATGGCAMGGTAGCGTTGCC180MTGATGTTA CAGATGAGATGGTCAGACTAMCTGGCTGACGGMTTTATGCCTCTTCCG240ACCATCMGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCC300GGCAAMCAGCATTCCAGGTATTAGMGMTATCCTGATTCAGGTGAAMTATTGTTGAT360GCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTMTTGTCCTTTTMC420AGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCMTCACGMTGMTMCGGTTTGGTTGAT480GCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTMTGGCTGGCCTGTTGMCMGTCTGGAMGAMTG540CATMGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGAT600MCCTTATTTTTGACGAGGGGAMTTMTAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGMTC660GCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGMCTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCA720TTACAGAMCGGCTTTTTCAAAMTATGGTATTGATMTCCTGATATGMTAMTTGCAG780TTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTM810SEQ ID NO 9 (遺傳霉素抗性基因kanmX4)TGACCGGAGCMCMGACGTGGGCGAGTATACGCACTGGATGCAGGCGCCGACGCGTTTC60TTGCACAMTAGCAGACCTGCGMCGMCTCTTCGTCAGCTCGMGCTTGAMGACTCGC120CGCTTTCGACTCACCAGCTTCCATCGACTCTTGGGGATGTTCTCGAGACCGTCGACCGGC180TCCATATACACCGTGTTGCTGACGCCTGTTTCGGGMCCCAGATCGCGCAGAGCMGTGT240GCCCACTGGCCCGTTGTCGTTTGTTTGMGGCGCCGTACGAGTTGGGGCAMGCACGCAG300GTCTACGAGAGATMTAGTCAGGTTTTGAGCGTAGCAMGGCCCCGGACGGAMCGCACG360ACTGGCTTGTCGGGCGAGACGGTGCATTTGCGGCAGAGCCACTGTCCTTCCGGGATGTAC420GGMCGCCGTAGCMTCTGCGAGGMGCGACAMGATGAGCATCAGATCCTCGTCGTGAC480CACGCTGTGCAGCCATGCMCGTGAGMCTCGCGACGCACCTTGGTGGACCGCCMGTTG540CATCCGTCGCAGMGACGATCGCATTCGAGTTCTCGCACTCGCCGTCGTCGCAMTGGCA600CATTTGCTGTCTTCGCTCGGCMGGCATTCGTCCGCTTCGGGATATTGCGAGTCTGCGM660AGACGAGCGAGACGGTCAGCAGGTCGCGAGMGTTGAGGGAGGGCGAGMCGGACCAGGT720CGMCCACTCCTTCTCMTCTTGTCCATGACMTCTCAMGAGCTCGTACGGGATGGTGG780CMGACCGTCCTTCTTCCGCTCCGCGTTGAGCGTGTCGAGCCAGAGTTGGTCTGTGGGTT840TCGCCGTCCATACAGGCTGTCAGCTGTCGTACAMTCGTCMGCCTGCCTGAGAGMCCT900CCCACCTTGCTCGTCCATGTCATACTCMCCTGCTTCGCCAGGTCCGACTCCATAGGTTC960TGTGGGAGACGGAGGGAGGGTGAGTAAGTC GACTTTTGAG ACGCTGGTCC GCCTGCAGAG1020GCGCAGACATCGMGAGCGATCTTCGAGTG CTCCTGCAGC ATCTGCACGTCCGTCCGGGC1080
CN 102268431 A
說明書20/21頁
012345678901234567890123456789012345678 888888888899999999990000000000111111111 333333333333333333334444444444444444444
Ooooooooooooooooooooooooooooooooooooooo
___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___ ___
22 GTCGCTCGCTGCTCCAGAGACGCGACAMCMTCCCCACTTGACGAGGATCGMGCGACT1140 CACGCAGCCACCGCAGGTACCGCCCCGGCTCGCCATCCGCTATGCCCTTGTACGCATCCC1200 ATTCCTGGCCGTCATTGTACCCGMCGCGACGAGCTGGGGGTTGTGMCATCGGGCGGAG1260 CGGGGGTGCTCGTGTCGACGACGCGAMGTTGACGACTGGGAGTGCGAGAGACGAGCCGT1320 GAGCTCCTGGCATCCCGTTGGCAGTGTGTGAGCGTTCTACTGATGMGTCGAGGAGAGGA1380 AGAGMGGTTGTCGCTGGACTGCTCGCTCCTACTGTCCCTGTGAGGCTACGGGACTGCTT1440 TCCGAGTCTATCAGAGCTACCTGMGCCCTTAGTACCGCTCGACTTGCGCGCCACCCCAT1500 CTCCTCCTCCTCCCGCTCCATCCGTCGAGATGGGTMGGAAMGACTCACGTTTCGAGGC1560 CGCGATTAMTTCCMCATGGATGCTGATTTATATGGGTATAMTGGGCTCGCGATMTG1620 TCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGMGCCCGATGCGCCAGAGTTGT1680 TTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAA1740 ACTGGCTGACGGMTTTATGCCTCTTCCGACCATCMGCATTTTATCCGTACTCCTGATG1800 ATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGCAAAACAGCATTCCAGGTATTAGMGMT1860 ATCCTGATTCAGGTGAAMTATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATT1920 CGATTCCTGTTTGTMTTGTCCTTTTMCAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGC1980 MTCACGMTGMTMCGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCT2040 GGCCTGTTGAACMGTCTGGAMGAAATGCATMGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAG2100 TCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAMTTMTAG2160 GTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTAT2220 GGMCTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAMCGGCTTTTTCAAAMTATGGTA2280 TTGATMTCCTGATATGMTAMTTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAAA2340 TGGCGCGGCGCTCTCTAGACTTTCGAACGAGTGTAAGGCTATCTTGACMCMCATGCAC2400 MTCCGGTCGAGTCTACMCGTCTATCGCCTCTTCACGGACCGCTTCGGACCTGTCTGGA2460 CGACGTGGCTTGATGCGMGCTGGGTAGCCACTTGTCGCTCGMCTCTTCGCCAATGGCT2520 GTTTCTTCGGTGGCGCGGCTGCCGTCTTGGCGGAAACMGAGMGGGMGGGCGATGGCT2580 GCTTCGCGCTGAGTTGAGCTGAGGAGGCGGMGMGAGACGTTCGACAGGCTGTTGTGGG2640 CGGAGAGCGGTCGTGTGGGCGCCTCCTGCTTCGCCTTAGCCGACGACGACGCGAAGTACG2700 ACGACTCGACGATCTCGACGTCGCTGCTGTCGTCGTCATTCCGCGCCTTTGCTGGTCGGG2760 CGGGCACCTCATTCTCCATCTCCCTCMCCTCTGCTCTTCTCGCACCGCAGCTCGCATCG2820 TTTCCTCATCCGCATACTCCAGCTCATCATCCTCGTCATCGCTGTACTCGCGCGAGACCT2880 CGCACTCGTCCATCAGCGTGCGCTCGTGCCGCTTCTTCGTTGGCGAGGCGAGCAGCTTCG2940 ATTTGTTGTTGACCTTGMGGACGGGCCGTCAGAGGGAGGTGMGGCGATCTGTACGAGC3000 GCGAGGAGGCCGTGCGCTTGAACTGGCGCGMGGGMGGAGGTGGAGGGGTTGTCGGTCA3060 TAGGGGATTCTTCGGCGTCACTGTCCGTCGCGACGATGCCGCGCTTCGCTCGCAGCTCGG3120 CAACTTTCTTCTTCAGGCGCGCGAGCTGTGGCACATCGTCTGTTAGCTCGACTAGTGCGA3180 ACGMGGAMAGACCGGGCCACGCACGTCGGCTTCGTACCGCTTGTTGGCTCCCTCCACC3240 CGCCTCCGCTTCTCCTCCTC CTGCTT326權利要求
1.乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶啟動子，簡寫為pRtUra3，其核苷酸序列具有如SEQID NO 1所示DNA序列的全部或包含該DNA序列自3，-末端起900bp以內的部分序列，或具有可與如SEQ ID NO 1所示序列的全部或其DNA序列3，-末端起900bp以內的部分序列雜交的、且保持轉錄啟動子活性的序列，或對SEQ ID NO :1所示的脫氧核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失或添加所獲得的，與SEQ ID NO :1所示序列具有50%以上同源性、且具有啟動子活性的序列。
2.—種權利要求1所述乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶啟動子的應用，其特征在于SEQ ID NO :1所示的脫氧核苷酸序列可作為啟動子用于構建新型酵母遺傳操作系統及新的重組工程菌株，所得到的基因工程菌株攜帶相應的PRtura3序列。
3.按照權利要求2所述乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶啟動子的應用，其特征在于所述基因工程菌株為紅冬孢酵母屬(Miodosporidium)基因工程菌株，所述新型酵母遺傳操作系統為圓紅冬孢酵母遺傳操作系統。
4.一種DNA構建體，含有權利要求1所述SEQ ID NO :1所示的脫氧核苷酸序列，或同時含有權利要求1所述SEQ ID NO :1所示的脫氧核苷酸序列和如SEQ ID NO :2所示的脫氧核苷酸序列，且SEQ ID NO :1所示序列位于SEQ ID NO :2所示序列的上游，SEQ ID NO 1 和SEQ ID NO 2之間為一編碼基因的開放閱讀框架。
5.按照權利要求4構建體，其特征在于所述的SEQID NO :2所示序列為一種乳清酸核苷-5 ‘-磷酸脫羧酶終止子Rtura3t。
6.一種攜帶權利要求1啟動子PRtFBA或權利要求4構建體的載體。
7.按照權利要求6載體，其特征在于所述載體為質粒載體。
全文摘要
通過擴增圓紅冬孢酵母乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶基因組DNA上下游序列，進行生物學信息分析和功能驗證，獲得可有效表達目的基因于圓紅冬孢酵母，并因此能夠用于圓紅冬孢酵母遺傳工程操作和菌株改良的啟動子和終止子。本發明還涉及包含這些元件的DNA構建體和載體。
文檔編號C12R1/645GK102268431SQ20101018972
公開日2011年12月7日 申請日期2010年6月2日 優先權日2010年6月2日
發明者趙宗保, 楊帆, 張素芳 申請人:中國科學院大連化學物理研究所