與肝細胞癌發生相關的1p36.22區域的多態性的檢測方法、試劑盒及其應用的制作方法

專利名稱：與肝細胞癌發生相關的1p36.22區域的多態性的檢測方法、試劑盒及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及肝細胞癌Ofepatocellular carcinoma, HCC)的人群預防中的個體易感性及其遺傳學檢測方法、試劑盒及其應用。具體地，本發明涉及與HBV相關HCC發生風險相關的易感基因組區域1ρ36. 22 (UBE4B-KIF1B-P⑶)的rsl7401966基因型的檢測方法；本發明進一步涉及上述易感基因組區域基因型的檢測試劑盒；另外，本發明還涉及上述易感基因組區域、相關檢測方法和檢測試劑盒在HCC的預防和控制以及遺傳咨詢中的應用。
背景技術：
HCC是最常見的癌癥之一，居全球癌癥死亡原因的第五位。HCC很少能夠在早期得到診斷，并且通常在確診后的幾個月內死亡。據估計，全世界每年有超過50萬新發HCC病例 1O HCC的發病率與致病因素在不同地區存在顯著差別2’3。盡管在歐洲、北美和日本，與慢性丙型肝炎病毒(h印atitis C virus, HCV)感染相關的HCC的發病率越來越高，但在全球范圍內慢性乙型肝炎病毒(h印atitis B virus, HBV)感染仍是HCC發生的最重要的原因。尤其是在中國和非洲等高度流行的地區，慢性HBV感染導致至少80%的HCC病例2。然而，只有一小部分慢性HBV攜帶者在其一生中發生HCC4。和其他常見的癌癥一樣，慢性HBV攜帶者發生HCC的風險在不同個體之間存在差異，這種差異也是由遺傳和環境因素之間復雜的相互作用而導致的5。針對HBV相關的HCC進行的分離分析(Segregation analysis)提示了這一惡性腫瘤的多基因遺傳背景6’7。與連鎖研究策略相比，基于候選基因的病例_對照關聯研究對鑒定新的易感基因位點具有更大的效能。這種研究已經鑒定了與HBV相關HCC 的多個易感基因(如ESR1)及遺傳變異位點8’9。但是，總體而言，鑒定與HCC的發生和發展相關的易感基因的進展仍然十分緩慢。1ρ36區域發生雜合缺失(Loss of heterozygosity, L0H)的現象在人類惡性腫瘤包括HCC中廣泛存在12_14。值得關注的是，新近一項研究提示1ρ36. 21-36. 32發生的LOH 可能是肝癌致病機制中的早期事件，提示在此區域存在潛在的抑癌基因14。特別地，在包含 UBE4B-KIF1B-PGD 的 1ρ36. 22 區域，發明人運用免疫組化(immunohistochemistry, IHC)的方法檢測了其蛋白表達。結果發現與配對HCC組織相比，癌旁非腫瘤肝組織中總KIFlB(包括KIFlB α和KIFlBP )、KIFlBa和P⑶的表達水平更高(η = 20例，Wilcox P值分別為 0. 0020,0. 046和0. 0039)。而且，在癌旁非腫瘤肝組織中，與rsl7401966AA攜帶者相比，G等位攜帶者總KIFlB表達水平更高(P = 0.0084)。此外，發明人在67例無關個體來源的EBV 轉化外周血淋巴細胞中，采用實時定量逆轉錄PCR的方法檢測KIFlBii的mRNA表達水平。 結果清楚表明在G等位攜帶者中，KIFlBii轉錄水平顯著增加(P = 3.7X10_4)。總的說來， 這些結果與早先報道的KIFlB β作為潛在的抑癌基因是一致的，且包含UBE4B-KIF1B-P⑶ 的1ρ36. 22區域可能在HBV相關HCC的發病機制中發揮作用。但是，目前尚沒有基因組區域1ρ36. 22 (UBE4B-KIF1B-P⑶)多態性與HBV相關HCC 發生的易感性之間存在相關性的研究報道。

發明內容
發明人克服上述現有技術的不足和缺陷，提供一種HBV相關HCC的易感基因、易感多態性位點、多態性位點的檢測方法、檢測試劑盒及其應用。通過基于病例對照人群和核心家系的大樣本遺傳關聯研究以及大量的實驗室實驗判明，與在基因組1ρ36. 22區域(UBE4B-KIF1B-P⑶)攜帶rsl7401966G等位的慢性HBV 攜帶者相比，攜帶rsl7401966A等位的慢性HBV攜帶者更易罹患HCC ；與攜帶rsl7401966GG 基因型的慢性HBV攜帶者相比，攜帶AA或AG基因型的慢性HBV攜帶者更易罹患HCC。因此本發明鑒定了一個與HBV相關HCC發生關聯的新的易感基因組區域、易感等位和易感基因型，該易感基因組區域1ρ36. 22包括但不限于UBE4B、KIF1B、P⑶等易感基因。本發明還提供了一種檢測與HBV相關HCC發生關聯的易感多態性位點rsl7401966 的方法，該方法包括但不限于SNPstream分型或TaqMan分型等。本發明還提供了一種通過檢測rsl7401966多態性位點的基因型來判斷個體對 HCC是否易感的方法。本發明還提供了用于檢測多態性位點rsl7401966的引物和探針。本發明進一步提供了用于檢測與HBV相關HCC發生風險關聯的rsl7401966的試劑盒，以及上述試劑盒在人群中預防與控制HCC的應用。一、如上所述，本發明提供了檢測與HCC易感性關聯的1ρ36. 22區域 (UBE4B-KIF1B-P⑶)多態性位點rsl7401966的方法，該方法包括但不限于SNPstream分型和TaqMan分型等方法。1、SNPstream分型，包括如下步驟，其特征在于對rsl7401966進行基因型判別1)對包含多態性位點rsl7401966的基因組區域，根據堿基互補的原則設計特異性的擴增引物對和延伸引物；2)用1)中的特異性引物對進行PCR擴增，然后對PCR產物進行純化；3)以1)中的特異性延伸引物在每個SNP位點進行延伸反應，生成特異性的延伸產物；4)延伸產物與檢測板雜交，掃描成像并生成基因型。2、TaqMan分型，包括如下步驟，其特征在于對rsl7401966進行基因型判別1)對包含多態性位點rsl7401966的基因組區域，根據堿基互補的原則設計特異性的擴增引物對和探針；2)用1)中的特異性引物對進行PCR擴增，根據熒光探針所產生信號的不同即可得知rsl7401966的基因型。二、本發明還提供了與HBV相關HCC發生關聯的易感等位和易感基因型，即 1ρ36. 22區域(UBE4B-KIF1B-P⑶)多態性位點rsl7401966A等位為HCC的易感等位，AA或 AG為HCC的易感基因型。并提供了通過檢測rsl7401966來判定人群或個體對HCC發生的易感性的方法。該方法包括但不限于SNPstream分型或TaqMan分型等。其特征在于1、針對樣本基因組DNA，采用SNPstream分型或TaqMan分型的方法判定 rsl7401966的基因型；2、當某一個體的rsl7401966表現為AG基因型或AA基因型(即攜帶1個或2個A等位)，則表明該個體患HCC的可能性更高。三、本發明還提供了檢測多態性位點rsl7401966基因型的特異性引物和探針的序列，其特征在于能夠特異性地擴增出包含rsl7401966的DNA片段，并準確鑒定rsl7401966的基因型。正反向引物序列根據序列互補的原則在待檢測多態性位點 (rsl7401966)的上下游設計，一般而言，引物長度為20bp左右，所擴增的目的片段(包含 rsl7401966)的長度為IOObp左右。設計軟件包括但不限于autoprimer或primer3等。優選地，引物和探針序列為SNPstream 分型正向引物5‘ -CTTCAGCCTCATTTTTTTTTTATAC-3 ‘反向引物5,-TTCCCTGCTTTGAAAATTTG-3 ‘延伸引物5'-GTGATTCTGTACGTGTCGCCAAACACATAGTGCCTCTATGAGTCC-3'TaqMan 分型正向引物5，-TTTCCAGCACTTAATGAAAACACATAG-3，
反向引物5，-CAAAGTTAAATTTCCCTGCTTTGAA-3，MGB 探針 1:5' (FAM) -TATGAGTCCATATTGAGTC-3 ‘MGB 探針 2:5' (HEX) -TATGAGTCCGTATTGAGT-3 ‘四、本發明進一步提供了檢測與HBV相關HCC發生風險關聯的易感基因組區域 1ρ36. 22 (UBE4B-KIF1B-P⑶)多態性位點rsl7401966的試劑盒，其特征在于裝有一個或多個容器，容器內裝有用以檢測多態性位點rsl7401966基因型的一種或多種組分。與之同時提供的可以是經政府食品與藥品監督管理部門審核的、有關藥品或生物制品制造、使用及銷售方面的信息。以基于TaqMan分型方法檢測rsl7401966的試劑盒為例，在DNA的PCR 擴增方法實施中，檢測樣品的多態性位點rsl7401966的基因型的試劑盒，含有PCR的引物對和探針(正向引物5，-TTTCCAGCACTTAATGAAAACACATAG-3，，反向引物5，-CAAAGTTAAATTTCCCTGCTTTGAA-3，，MGB 探針 1 5 ‘ (FAM) -TATGAGTCCATATTGAGTC-3 ‘，MGB 探針 2 5 ‘ (HEX) -TATGAGTCCGTATTGAGT-3 ‘)，以及用于 PCR 反應的包含 dNTPs 和 DNA 聚合酶在內的預混緩沖液等。使用方法說明如下對樣品基因組DNA，用本發明提供的引物和探針，按照如下反應體系和條件進行 PCR擴增5μ 1反應體系為IOng/μ 1基因組DNA 1 μ 1，20 μ M的上下游引物各0. 25 μ 1， ΙΟμΜ 的探針各 0. 125μ 1，以及 2. 5μ 1 2Χ 預混緩沖液(Applied Biosystems TaqMan Genotyping MasterMix ；包括 dNTP 及 Taq DNA 聚合酶)。PCR 條件為50°C 2 分鐘；95°C 10 分鐘；950C 15秒和60°C 1分鐘,共計40循環。PCR反應在Applied Biosystems 7900HT快速實時PCR儀上完成，并即時得到基因型。具體見實施例。本領域技術人員已知，以上所列分型方法及試劑盒的組分僅是示意性的，可包括發明內容1-3中任一項提到芯片、雜交板、引物、探針、dNTPs、各種酶制劑及各種緩沖液及其它溶液的一種或多種。 五、本發明還提供了與HBV相關HCC發生風險關聯的易感基因組區域 1ρ36. 22 (UBE4B-KIF1B-P⑶)的多態性位點rsl7401966基因型的檢測方法及其在HBV相關HCC人群預防和控制中的應用。例如，由于本發明證實了 rsl7401966基因型與HBV相關HCC發生的易感性存在關聯，因此，在HBV相關HCC人群的預防和控制中，就需要對所咨詢的對象開展rsl7401966基因型的檢測，以判斷該對象是否攜帶有HBV相關HCC易感基因型rsl7401966AG或AA (即攜帶1個或2個A等位，表現為對HBV相關HCC具有更高的易感性)。對具有基因型rsl7401966AG或AA的個體，則可對之進行科學的干預，例如建議及早進行治療性預防等，這樣可以針對性地降低這些易感人群的HBV相關HCC的發生風險。


圖1 :rsl7401966在合并所有六個人群后進行薈萃分析得到的森林圖O^orest plot)。圖中顯示了每個人群的OR值(藍色方塊所處位置)和95% CI (藍色水平線)。垂直虛線表示六個人群中的最終OR值。上面6行分別代表六個人群的數據，其下方的藍色菱形代表合并效應值。每個藍色方塊的面積與該人群在薈萃分析中的權重成正比。薈萃分析指出聯合 P 值為 1. 7 X IO"18,聯合 OR 值為 0. 61 (95% CI = 0. 55-0. 67))。P異質性=0. 60。圖2 :rsl7401966基因型與診斷年齡之間的關聯分析。豎線表示標準差。風險基因型攜帶者的HCC診斷年齡提前了 1. 1歲(AA vs. AG+GG，P = O. 020，t檢驗)。圖3 :1ρ36. 22區域的局部關聯圖。rsl7401966及其周圍SNP對應的橫坐標是其所在的基因組位置(NCBI組裝版本36)，縱坐標是關聯P值(-IogltlP)。rsl7401966在薈萃分析中的P值以藍色菱形顯示，在GWAS階段的P值以大的紅色菱形表示。其它位點的顏色代表其與rs17401966之間的LD程度紅色表示r2 ^ 0. 8，橙色表示0. 5 < r2 < 0. 8，黃色表示0. 2 < r2 < 0. 5，白色表示r2 < 0. 2。淺藍色線表示估計的重組率(來自HapMap計劃)。從 Santa Cruz GenomeBrowser (http //Renome. ucsc. edu/)基因組瀏覽器中得出基因的位置(NCBI組裝版本36)。rsl7401966位于KIFlB基因的內含子M。圖的下部顯示了 rsl7401966(紅色箭頭所示)前后共約1Mb范圍內的LD結構，以廣西病例對照人群共707 個個體的基因型數據計算。SNP之間的LD值以r2估計，同時紅色的程度表示r2值的大小， 最深的紅色表示r2 = 1。重組圖和LD結構都清晰顯示出重組熱點的邊界。rsl7401966定位于一個約2441Λ范圍的LD區域，該區域包括了 KIF1B、P⑶和UBE4B基因的3，端。
具體實施例方式實施例1該實施例設計并合成了一套擴增引物對和一條延伸引物，并且在這些引物的基礎上，設計了一種檢測與HCC發生風險關聯的易感基因組區域1ρ36. 22 (UBE4B-KIF1B-P⑶)多態性位點rsl7401966基因型的方法。1、基因組DNA的提取采取本領域酚/氯仿法提取外周血白細胞的基因組DNA。1)取檸檬酸鈉或EDTA-Na2抗凝全血5ml (盡量不用肝素抗凝)，置于50ml有蓋離心管；2)加入3-5倍體積冷蒸餾水，反復顛倒混勻，冰中放置5分鐘，4°C 2000rpm離心 20分鐘；3)緩慢傾倒上清，沉淀加入預冷的0. 1 % Triton-XlOO (體積同上)，輕柔混勻沉淀，如上離心，棄上清；4)沉淀加入裂解液(50Mm Tris-Cl-IOmM EDTA, pH8. 0)，徹底打碎沉淀，然后加入10% SDS至終濃度為0. 5%，混勻；5)加入蛋白酶K(10mg/ml)至終濃度為200 μ g/ml，混勻，55°C 3小時或37°C過夜消化(以過夜消化為佳)；6)加入等體積平衡酚，倒轉混勻，4000rpm離心10分鐘，將上清轉移至另一個有蓋離心管；7)轉移上層水相，重復酚抽提一次；8)轉移上層水相，加入等體積的氯仿異戊醇04 1)，倒轉混勻，4000rpm離心 10分鐘；9)轉移上層水相，加入1/10體積的3mol/L乙酸鈉(pH5. 2)和2. 5倍體積預冷的無水乙醇混勻；10)置液氮冷凍10分鐘或-20°C 60分鐘后，4000rpm離心10分鐘；11)以70%乙醇洗滌沉淀1 2次，吹干或真空抽干；12)以 0.5ml TE (IOmM Tris-Cl-EDTA，pH8. 0)或蒸餾水溶解 DNA 沉淀，電泳檢測 DNA片段大小，或測^0Λ80ηπι OD比值。2、引物設計、合成及準備1)使用 autoprimer 軟件(http:// www. autoprimer. com/, Beckman 公司提供)對 rsl7401966進行12重引物設計。因此，除了 rsl7401966之外，最多還可加入其它11個SNP 位點并同時進行分型檢測。所有引物序列由上海英駿公司合成，經變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAG^純化。2)利用SNPstream分型的PCR條件對每對PCR引物進行測試，確保引物特異性。 PCR程序為95°C 15分鐘預變性，接下來的45個循環中包括三步，即94°C 30秒、55°C 20秒和72°C 1分鐘，PCR結束后保持在4°C待用。電泳檢測PCR擴增的效率和產物的特異性(產物的特異性由測序結果最終確定)。3)配制PCR引物池(共12X2個)，每條引物終濃度為10 μ M。4)配制延伸引物池(共12個)，每條延伸引物終濃度為10 μ Μ。3、多重PCR反應1)準備12重PCR反應混合液。按照一個384孔板的用量，各組分體積如下PCR 引物池 11. 25μ l，dNTP 67. 50 μ 1，10XPCR Buffer II 225. 00 μ 1,MgCl2 (25mM) 450. 00 μ 1, AmpliTaq Gold DNA Polymerase (5U/ μ 1) 45. 00 μ 1, ddH20 551. 25 μ 1，共計 1350. 00 μ 1。2)向384孔板的每個孔內加入3 μ 1配好的PCR反應混合液，再將稀釋好的IOng/ μ 1基因組DNA加入到對應的孔內，每孔加2 μ 1。3) 200g離心后，在PCR儀上進行擴增，PCR程序為95°C 15分鐘預變性，接下來的 45個循環中包括三步，即94°C 30秒、55 °C 20秒和72 °C 1分鐘，PCR結束后保持在4°C待用。3、多重PCR產物的純化1)配制Clean-up混合液。按照一個384孔板的用量，各組分體積如下Exo I (20U/ μ 1)45 μ 1，SAP(lU/y 1)448 μ 1，10XSAP Buffer 135 μ 1，ddH20 667 μ 1，共計 1350 μ 1。2)將PCR反應后的384孔板200g離心，再加入配制好的Clean-up混合液，每孔3μ1。封膜并以200g離心。3)在PCR儀上進行純化過程，程序為37°C 30分鐘，96°C 10分鐘，保持在4°C待用。4、單堿基延伸1)配制引物延伸反應混合液。按照一個384孔板的用量，各組分體積如下 ExtensionDilution Buffer 1692. 5 μ 1, Extension Primer Mix 13. 5 μ 1, 20XExtension Mix 90. O μ 1, ddH20 1336. 5 μ 1，DNA Polymerase 9. 4 μ 1，共計 3150 μ 1。2)將純化后的PCR產物200g離心，向每孔中加入7 μ 1配制好的引物延伸反應混合物。封膜并以200g離心。3)在PCR儀上進行延伸反應。PCR程序為96°C 3分鐘，接下來的46個循環中包括兩步，即94°C 20秒和40°C 11秒，PCR結束后保持在4°C待用。5、雜交反應1)配制 12 重 SNPware 雜交板清洗液 I。用 ddH20 將 20XSNPware Wash Buffer I 稀釋到終濃度為IX的雜交板清洗液I。2)清洗SNPware雜交板3次。每次吸取10 μ 1雜交板清洗液I，加入到雜交板上的每個孔中。將SNPware雜交板翻過來放在無塵紙上，放在離心機的托盤內進行離心，使雜交板上每個孔中的清洗液全部脫離。離心速度為200g，時間為1分鐘。按照上述步驟共重復清洗3次。注意離心力不可超過200g，以免損壞雜交板。3)配制雜交混合液。按照一個384孔板的用量，各組分體積如下=Hybridization Solution3402 μ 1, Hybridization Additive 198 μ l，#if 3600 μ 1。4)向PCR板每孔中加入8 μ 1上述雜交混合液，在離心機上稍微離心使其混合均勻。取出15 μ 1加入到SNPware雜交板上對應的孔內，并用槍頭反復吹打使之混勻。5)將加入混合液的SNPware雜交板放入一個密封的盒子中，盒內預先放幾張濕潤的紙巾，保證孵育過程中盒內濕度，防止雜交板蒸干。于42°C溫箱孵育濁士 15min。6)配制 SNPware 雜交板清洗液 II。用 ddH20 將 64XSNPware Wash Buffer II 稀釋到終濃度為IX的雜交板清洗液II。7)雜交完成后，吸取10μ 1雜交板清洗液II，加入到雜交板上的每個孔中，清洗雜交后的SNPware雜交板。8)將SNPware雜交板翻過來放在無塵紙上，一起放在離心機的托盤內進行離心， 使雜交板上每個孔中的清洗液全部脫離。離心速度為200g，時間為1分鐘。按照上述步驟共重復清洗3次。注意離心力不可超過200g，以免損壞雜交板。6、基因型判讀1)清洗完畢后，用無塵紙蘸取少量無水甲醇擦拭雜交板背面玻片，使其清晰無痕跡，然后在掃描儀上掃描原始數據。2)使用SNPstream V2. 2軟件包對原始數據進行分析得到rsl7401966和其它11 個SNP位點在每個個體中的基因型。實施例2該實施例設計并合成了一套擴增引物對和一對探針，并且在這些引物和探針的基礎上，設計了一種檢測與HCC發生風險關聯的易感基因組區域1ρ36. 22 (UBE4B-KIF1B-P⑶)多態性位點rsl7401966基因型的方法。1、基因組DNA的提取同實施例1。2、引物和探針合成根據rsl7401966所在基因組區域設計引物對和探針序列，其中正向引物5，-TTTCCAGCACTTAATGAAAACACATAG-3，，反向引物5，-CAAAGTTAAATTTCCCTGCTTTGAA-3，，MGB 探針 1 5 ‘ (FAM) -TATGAGTCCATATTGAGTC-3 ‘，MGB 探針 2 5' (HEX)-TATGAGTCCGTATTGAGT-3‘。所有引物和探針由商業公司(如上海基康公司等)合成，以ddH20將引物稀釋成20 μ Μ,將探針稀釋成10 μ Μ。注意探針需_20°C避光保存。3、PCR 反應對樣品基因組DNA，用本發明提供的引物對和探針，按照如下反應體系和條件進行PCR擴增。5μ 1反應體系為dOng/y 1基因組DNA 1 μ 1，20 μ M的上下游引物各 0.25 μ 1，10 μ M 的探針各 0. 125 μ 1，以及 2. 5 μ 1 2Χ 預混緩沖液(Applied Biosystems TaqManGenotyping Master Mix ；包括 dNTP 及 Taq DNA 聚合酶)。PCR 條件為50°C 2 分鐘； 950C 10 分鐘；95°C 15 秒和 60°C 1 分鐘，共計 40 循環。PCR 反應在 Applied Biosystems 7900HT快速實時PCR儀上完成。4、數據分析和基因型判讀1)在Applied Biosystems 7900HT快速實時PCR儀上的SDS軟件中，選擇 Analysis — Analysis Settings。2)在Marker下拉菜單中選擇Marker。3)在 Analysis kttings 對話框中，選擇自動分型 Auto Caller，輸入 Quality value或者接受默認設置，點OK接受分析參數，并退出窗口。4)菜單Analysis — Analyze, SDS軟件即開始分析數據，并在Results頁面顯示
計算結果。5)切換到Result頁面的Allelic discrimination子頁面，在Marker下拉菜單中選擇Marker，在下面界面中按Excel方式選擇需要查看的樣品孔，即在中間的圖譜上顯示信號點的分布情況。擴增曲線的縱坐標代表FAM的相對熒光信號強度，橫坐標代表HEX的相對熒光信號強度。6)正常的基因型信號聚為4類，靠近原點處為空白對照NTC;靠近X軸的是HEX信號(GG純合子)；靠近Y軸的是FAM信號(AA純合子)；靠近對角線位置的樣品既有FAM信號也有HEX信號(AG雜合子)。7)從File菜單中選擇Export，輸出基因型數據。實施例3該實施例用實施例1和2建立起來的方法，對六個人群的rsl7401966基因型進行了分析。1、試驗對象本研究包括五個獨立病例對照人群(共計2，317例病例和1，790例對照)以及一個核心家系人群(159個核心家系)。所有入選者均為中國成年人，其中廣西病例對照人群、 廣西家系和廣東病例對照人群從中國南方招募，上海病例對照人群和江蘇病例對照人群從中國東部招募，北京病例對照人群從中國北部招募。HCC病例均為慢性HBV攜帶者、新近確診、未經放化療治且不合并其它腫瘤。HCC的診斷標準包括組織活檢陽性；血清甲胎蛋白水平彡400ng/ml，合并一項影像學診斷陽性。對照也均為慢性HBV攜帶者，其入選標準為 無癌癥病史，且性別與年齡(士5歲)分布與肝癌病例匹配。所有病例和對照均無直系親屬關系。HBV攜帶者HBsAg和HBcAb均為陽性并持續6個月以上。吸煙者的定義為研究對象在確診或收集資料之前至少吸煙一年以上。吸煙資料包括吸煙史、每天吸煙量、吸煙起始年齡和戒煙年齡等。吸煙者以“包-年”數(pack-year) 為累計吸煙劑量指標，計算公式為(每日吸煙支數+20支)X吸煙年數。輕度與重度吸煙的界定標準為對照人群吸煙者中“包-年”的均值，在本研究中“包-年” ^ 19為輕度吸煙，> 19為重度吸煙。飲酒者的定義為每周飲酒一次或以上，且持續6個月或以上。所有入選者均為HCV、HDV、HIV陰性，且無其他類型的肝病。本研究由北京放射與輻射醫學研究所醫學倫理委員會批準執行。每名參與者均簽署知情同意書，并通過結構化調查問卷提供社會人口學和臨床信息。下面列出的是六個人群的詳細情況廣西病例對照人群發明人此前于2002年7月至2004年10月自廣西腫瘤醫院 (中國南寧)招募了 248例罹患HCC的慢性HBV攜帶者和239例未患HCC的慢性HBV攜帶
-W 9 百 ο在本發明中，發明人于2005年5月至2008年1月從該醫院又招募了 112例病例。 所有360例病例均為無關中國成年人，居住在廣西扶綏及其周邊地區，該地區是中國南部一個眾所周知的HCC高發區。病例的回應率(response rate)為91%。發明人另外招募了 116例未患HCC的慢性HBV攜帶者作為對照，這些對照與病例之間無直系親屬關系。對照是于同期在同一地區開展的社區腫瘤早期篩查計劃中隨機挑選的。對照的回應率為90%。 在GWAS階段，經過嚴格的質量控制，有7例病例和1例對照被排除。因此，最終的廣西病例對照人群為348例病例和359例對照。北京病例對照人群這個病例對照人群共包括276例罹患HCC的慢性HBV攜帶者和266例未患HCC的慢性HBV攜帶者。所有病例均于2003年3月至2009年2月期間在中國醫學科學院腫瘤防治研究所腫瘤醫院招募，這是中國北部的一個三級轉診中心(中國北京)。HCC患者均為居住于位于中國北部的北京市及其周邊省份的無關中國成年人，回應率為88%。于同期在同一地區開展的6，450名個體的社區營養調查中，招募非腫瘤個體作為對照1CI。基于體檢及血清HBV標志物檢查，以及與病例在年齡和性別上的匹配情況來挑選對照，其回應率為83%。廣東病例對照人群這個病例對照人群共包括751例罹患HCC的慢性HBV攜帶者和509例未患HCC的慢性HBV攜帶者，于2003年8月至2007年11月在位于中國南部廣東省廣州市的中山大學腫瘤防治中心招募。病例的回應率為91%。對照為無關獻血者，回應率為94%。所有病例對照均為無關中國漢族成年人，并自稱是居住于廣州及其周邊地區的廣東人。上海病例對照人群這個病例對照人群于2003年2月至2008年7月在位于中國東部上海市的東方肝膽外科醫院招募。入選和排除標準此前已有報道“。在本研究中，只有慢性HBV攜帶者入選。此外，由于DNA耗盡，只有部分病例和對照入選。因此，這個病例對照人群總共包括4 例HCC患者和440例對照。所有入選者均為居住于中國東部上海市及其周邊地區的無關中國人。病例和對照的回應率分別為86%和92%。江蘇病例對照人群自2005年8月至2009年5月，在位于江蘇省的啟東市肝病研究所、南京醫科大學第一附屬醫院、海門市疾病預防控制中心、南通市腫瘤醫院共招募507 例病例。江蘇省的啟東市、海門市和南通市位置接近，地處中國東部，是另外一處眾所周知的HCC高發區。回應率為89%。215例對照是于同期在江蘇省開展的社區非傳染病篩查項目中隨機挑選的，回應率為92 %。廣西核心家系人群自2005年7月至2008年2月在廣西腫瘤醫院(中國南寧) 招募159個核心家系。HBV相關的HCC患者作為先證者，其入選標準與前述廣西人群是一樣的。先證者的回應率為95%。先證者的診斷年齡只有35. 9歲，這是因為TDT分析要求其父母均在世。廣西核心家系人群中的先證者與廣西病例對照人群中的病例之間無重復。六個人群的社會人口學信息如表1所示。2、rsl7401966基因型的確定在廣西病例對照人群中(GWAS階段)，rsl7401966的基因型頻率分布如表2所示。 與A等位相比，G等位與HCC發生風險降低有關。以加性模式為例，統計結果顯示每增加一個G等位的患病風險降低0. 53倍[95%置信區間(95% Cl) = 0. 41-0. 70 ；P = 5. 8X IO"6] (表2)；也即A等位為HCC的易感等位，每增加一個A等位的患病風險增加1. 89倍。采用實施例1中的方法，在北京病例對照人群中(重復驗證階段1)對rsl7401966 進行了分型，以驗證其在廣西病例對照人群中的關聯結果。以加性模式為例，統計結果顯示每增加一個G等位的患病風險降低0.49倍[95% CI = 0.37-0.67 ；P = 3. 5X 10_6](表2)； 也即A等位為HCC的易感等位，每增加一個A等位的患病風險增加2. 04倍。進一步采用實施例2中的方法，在另外三個病例對照人群中(重復驗證階段2)驗證rsl7401966的關聯結果。以加性模式為例，統計結果顯示在三個病例對照人群中，每增加一個G等位的患病風險分別降低0. 65倍[95% CI = 0. 54-0. 79 ；P = 1. 4X IO"5](廣東病例對照人群)、0· 66倍[95% CI = 0. 52-0. 83 ；P = 4. 4X 10_4](上海病例對照人群)和 0. 58倍[95% CI = 0. 45-0. 75 ；P = 3. 9 X IO"5](江蘇病例對照人群)；也即在三個病例對照人群中A等位均為HCC的易感等位，每增加一個A等位的患病風險分別增加1. 54、1. 52 和1. 72倍。接下來，發明人采用實施例2中的方法在廣西核心家系人群(重復驗證階段3)中對rsl7401966進行了分型。同樣的，傳遞/不平衡檢驗(Transmission/disequilibrium test, TDT)發現rsl7401966與HCC存在顯著關聯(x2 = 5. 08,P = 0. 024)，關聯方向與前述基于人群的結果一致(表3)。3、深入分析rsl7401966基因型與HCC發生的易感性之間的相關性將兩個重復驗證階段共四個病例對照人群進行合并分析，rsl7401966與HCC存在顯著的關聯，且達到了全基因組關聯所需的顯著性水平(P = 5. 1X10_15)。進一步與GWAS 階段數據合并分析，在總共2，310例病例和1，789例對照中，關聯P值達到了 3. 4X 10_19。 將所有五個病例對照人群和一個核心家系人群合并進行薈萃分析(meta-analysis)，結果表明聯合P值達到了 1.7X10_18，聯合比值比(odds ratio，OR)為0.61(圖1)。此外，在各人群之間不存在顯著的異質性(異質性檢驗P值為0. 60)。發明人詳細評估了 rsl7401966影響HCC發生風險的遺傳模式。在所有病例對照人群中，rsl7401966的基因型頻率都是比較類似的。在合并人群中，rsl7401966的次要等位G以劑量效應的方式在HCC發生中起保護作用(OR雜合子=0. 64,95% CI = 0. 56-0. 73 ；OR 純合子=0. 35,95% CI = 0. 26-0. 47 ；Piii5 = 3·4Χ10_19)。基于發明人的數據，加性模型和顯性模型都比隱性模型更加適用，但是加性模型更加簡約。發明人進一步按照性別和年齡分層來檢測rsl7401966對HCC發生風險的影響。在合并后的病例對照人群中發現，遺傳效應在男性中更加明顯(異質性檢驗P值為0. 027 ；表 4)。按照年齡分層則沒有發現遺傳效應存在任何顯著性差異(異質性檢驗P值為0. 13)，但是，僅基于病例(case-only)的分析結果表明，與AA純合子攜帶者相比，保護性G等位的攜帶者的 HCC 診斷年齡(age at diagnosis)晚 1. 1 歲(P = 0. 020 ；圖 2)。4、解析rsl7401966所在區域(1ρ36. 22)的HCC易感基因新鑒定的HCC發生相關的易感基因組區域1ρ36. 22至少包括UBE4B、KIF1B、P⑶等基因(圖3)。KIFlB基因編碼驅動蛋白超家族成員，參與細胞器和泡囊的轉運15。KIFlB基因有多個可變剪接體，目前在多種惡性腫瘤中檢測到KIFlB β的種系性(germline)和體細胞性 (somatic)失活突變16_18。此外，近期兩項獨立的研究均發現在神經母細胞瘤中1ρ36.2區域的KIFlBii是潛在的腫瘤抑制基因，作用于EglN3脯氨酸羥化酶的下游通路并誘導凋亡
19,20
O泛素通路調控細胞增殖、凋亡、細胞周期和DNA修復等多種細胞功能，該調控網絡的失調涉及包括HCC在內的多種腫瘤21’22。UBE4B編碼泛素連接因子E4，參與多泛素鏈組裝23。盡管目前關于UBE4B參與HCC的證據很少，UBE4B仍然很有可能是HCC的候選易感基因。在最終死亡的神經母細胞瘤中發現，UBE4B基因的剪接位置(splice site)發生突變 24O與早期/預后良好的神經母細胞瘤患者相比，晚期/預后不良的神經母細胞瘤患者體內 UBE4B的表達顯著降低M。此外，UBE4B在p63介導的順鉬誘導所致凋亡的調控中發揮重要作用M。P⑶基因參與戊糖磷酸代謝，盡管P⑶參與HCC發生的生物學可能性尚有待深入闡明，PGD蛋白酶的失調在多種惡性腫瘤中經常出現26’27，提示其功能的重要性。總之，以往的研究以及發明人的關聯研究和功能研究均提示，rsl7401966所在區域(1ρ36. 22)的HCC易感基因包括UBE4B、KIF1B、PGD等基因。因此，用本發明的方法解析了基因組區域1ρ36. 22 (UBE4B-KIF1B-P⑶)的 rsl7401966基因型與HCC發生的易感性之間的相關性。應理解，在閱讀了本發明的上述內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，但所作改動或修改的等價形式同樣落在本申請權利書所限定的范圍之內。這些改動或修改包括但不限于1、HCC發生相關的多態性位點本發明鑒定的HCC發生的易感區域1ρ36. 22至少包括一個跨度約2441Λ的較大基因組片段(包含rsl7401966)，如圖3所示。該區域中有多個多態性位點與rsl7401966呈
12較強的LD狀態，它們同樣能夠指示HCC的發生風險。因此，對這些多態性位點的檢測同樣落在本申請權利書所限定的范圍之內。2、HCC發生相關的易感基因本發明鑒定的HCC發生的易感區域位于1ρ36. 22，該區域由緊密相連的多個較小區域組成，如圖3所示。其中一個區域包括UBE4B、KIF1B和P⑶等易感基因。但是，本領域技術人員已知，位于1ρ36. 22的其它區域的基因也有可能是與HCC發生相關的易感基因，對這些基因的檢測同樣落在本申請權利書所限定的范圍之內。3、檢測rsl7401966或與之呈較強LD的其它多態性位點的方法本發明提供了檢測與HCC發生的易感性關聯的1ρ36. 22區域(UBE4B-KIF1B-P⑶) 多態性位點rsl7401966的兩種方法，包括SNPstream分型和TaqMan分型等方法。但是，本領域技術人員已知，以上的分型方法僅是示意性的，用于檢測rsl7401966或與之呈較強LD 的其它多態性位點的方法可以是任何一種分型方法或其改進，可以使用本發明中列出的引物和探針或針對這些位點的其它任何引物和探針。這些分型的方法及所用引物和探針同樣落在本申請權利書所限定的范圍之內。
權利要求
1.一種與HCC發生易感性關聯的基因組區域1ρ36. 22 (UBE4B-KIF1B-P⑶)的多態性位點rsl7401966的檢測試劑盒，包括序列1 7所示擴增和延伸用基因特異性引物、探針和 dNTP,以及用于PCR反應、純化反應、延伸反應和雜交反應的各種酶制劑及緩沖液的一種或多種。
2.一種檢測1ρ36. 22區域多態性位點rsl7401966的基因型的特異性擴增引物對和延伸引物，其特征為1)對包含多態性位點rsl7401966的基因組區域，根據堿基互補的原則設計特異性的擴增引物對和延伸引物；2)所設計的特異性引物序列為正向引物(見序列表中序列1)，反向引物(見序列表中序列2)，延伸引物(見序列表中序列3)。
3.一種檢測1ρ36. 22區域多態性位點rsl7401966的基因型的特異性擴增引物對和探針，其特征為1)對包含多態性位點rsl7401966的基因組區域，根據堿基互補的原則設計特異性的擴增引物對和探針；2)所設計的特異性引物和探針序列為正向引物(見序列表中序列4)，反向引物(見序列表中序列5)，MGB探針1 (見序列表中序列6)，MGB探針2 (見序列表中序列7)。
4.權利要求2或3中所述的引物對、延伸引物或探針在制備檢測試劑盒中的應用，其特征為該檢測試劑盒可檢測與HCC發生易感性關聯的基因組區域 1ρ36. 22 (UBE4B-KIF1B-PGD)的多態性位點 rsl7401966 的基因型。
全文摘要
本發明涉及與HBV相關肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)患病風險相關的易感基因組區域1p36.22的多態性位點rs17401966的檢測方法、試劑盒及其應用。所述方法為SNPstream分型和TaqMan分型，本發明進一步涉及檢測上述易感位點的試劑盒及其應用。另外，本發明將1p36.22區域的多態性位點rs17401966與HBV相關HCC的患病風險聯系起來，確定了1p36.22是HBV相關HCC的一個新的易感基因區域，為HBV相關HCC的人群預防和控制提供了新的遺傳咨詢內容。
文檔編號C12Q1/68GK102277414SQ20101019696
公開日2011年12月14日 申請日期2010年6月10日 優先權日2010年6月10日
發明者周鋼橋, 張紅星, 翟蕓, 賀福初 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所