專利名稱：提高轉基因生物耐鹽性的基因LcGST及其制備以及利用其編碼的蛋白的制作方法
技術領域：
本發明屬于新基因的制備，特別是指一種能提高轉基因生物耐鹽性的基因LcGST 的制備以及利用其編碼的蛋白。
背景技術：
在我國，干旱、半干旱地區及鹽堿地占國土面積的1/2左右，嚴重制約了農業的發 展；在河北省，近幾年來連續干旱的嚴峻形勢以及黑龍崗地區和中西部地區土壤鹽漬化和 次生鹽漬化程度的增加，不僅造成了一些重要農作物的大量減產，也減少了地表的植被覆 蓋，惡化了生態環境。隨著科技的進步，利用基因工程手段改良、提高植物的抗旱、耐鹽能力 已經成為植物抗逆性改良的重要手段，而抗旱、耐鹽基因的篩選和鑒定則是植物抗逆基因 工程育種的首要基礎性工作。谷胱甘肽(glutathione，GSH)普遍存在于生物體內，含量豐富，其作為生物 體內主要的還原態硫之一，在還原態硫的儲存和轉運、蛋白質和核酸的合成、清除自由 基以及維持細胞膜的完整性等方面具有重要作用。谷胱甘肽S-轉移酶(Glutathione S-transferases,GSTs)是由一個大的多基因家族編碼的多功能蛋白酶，能催化GSH和親電 子的異源物質發生接合反應，并在細胞各部分內源代謝中作為多種化學物質的結合蛋白和 轉運蛋白催化依賴于GSH的生物轉化。其表達受多種環境因子的誘導，在植物的生長發育、 次生代謝和抗逆中有重要作用。
發明內容
本發明的目的之一在于提供一種能提高轉基因生物耐鹽能力的谷胱甘肽S-轉移 酶LcGST基因。本發明的目的之二在于提供該基因的制備方法。本發明的目的之三在于提供利用該基因編碼的蛋白。本發明的整體技術構思是提高轉基因生物耐鹽性的基因LcGST，其序列如下ATGGCTGACG AGGTGGTTCT TCTTGATTTC TGGGCAAGTC CATTTGGCATATCGCACTTG CTGAAAAGGG TATCAACTAT GAGTACAAAG AAGAGGATTTAGTCCTCTAC TTCTCCAATC GAACCCTGTT CACAAGAAGA TTCCAGTTCTGGAAAACCCA TTGCTGAATC TCTGATTGCT GTTCAGTATA TTGATGAGGTGCATCTCCCT TGTTGCCTTC TGATCCTTAC CAGAGAGCTC AAGCTAGATTTATGTTGATA AGAAGATATA TGAAATTGGT AGGAACATAA TTTGGAAGAAAGAGAAGCTG CCAAGAAGGA ATTCATAGAT TGCCTCAAGT TGCTGGAGGAGACAAGACTT ACTTCGGAGG AGACAAGCTT GGGTATGTTG ATATAGCACTTACACTTGGT TTAAAGGCTA TGAGACCCTT GGCAACTTCA ACATAGAGAG
GAGAGTCAGA GAGGAACAAG CATCCACAAT GTGGAATGAT CTGGGCTGAT AAATGAAGAA ACAGCTCGGA TGTTCCATTC TGAGTGCCCC
4
AAGCTCATTG CTTGGGCCAA GAGATGCCTG CAGAAAGAGA GCGTTTCAAA GTCTCTCCATGACCAAGACA AGATCTATGA GTTCATTGTG GAAATCAGAA AGAAGTTAGG CATCGAGTAG。百脈根是一種建設生態農業的優質草種，在保持水土，防止土壤荒漠化等方面起 到了巨大作用。百脈根具有基因組小、再生容易以及易于遺傳轉化等特點，近幾年已被作為 豆科植物中的模式植物而用于分子生物學的研究。本發明申請人利用美國國立生物技術信 息中心(NCBI)中已知的大豆谷胱甘肽S-轉移酶基因作為探針，在百脈根EST數據庫中檢 索，利用DNAMAN軟件對檢索到的EST序列進行電子拼接，獲得了含有完整開放閱讀框的拼 接序列，并對該基因進行了克隆。具體方法如下提高轉基因生物耐鹽性的基因LcGST的制備，制備方法包括(1)首先以已知的大豆谷胱甘肽S-轉移酶基因的編碼序列在美國國立生物技術 信息中心百脈根的表達序列標簽數據庫中為LcGST基因尋找證據，獲得同源性很高3條EST 序列，序列號分別為BW597792. UBW599863. 1和BW594579. 1，利用DNAMAN軟件對檢索獲得 的EST序列進行電子拼接，獲得了相應的含有完整開放閱讀框的拼接序列；(2)依拼接序列設計特異性引物，LcGST基因的外側上游引物為 5，-GTTCTTCCTCAAACTTCAACC-3，，外側下游引物為 5，-TTTCAAACCCTGTACAATCG-3，；內側上 游引物為 5，-ATAGGTACCGAGCTCACCATGGCTGACGAGGTG-3，，內側下游引物為 5，-CTGGGATCCCT CGAGCTACTCGATGCCTAACTTG-3，，將內側上、下游引物分別引入Kpn I和BamH I酶切位點；(3)利用設計的特異性引物以百脈根培養21天后的葉片組織cDNA為模板進行巢 式PCR擴增，獲得目的條帶；(4)PCR終產物回收后與pMDIS-T連接，連接產物采用熱激轉化法轉入大腸桿菌 DH5a的感受態細胞，并篩選陽性克隆，進行測序，測序與預期結果一致。利用可提高轉基因生物耐鹽性的基因LcGST編碼的蛋白，其序列如下Met Ala Asp Glu Val Val Leu Leu Asp Phe Trp Ala Ser Pro PheMet Arg Val Arg lie Ala Leu Ala Glu Lys Gly lie Asn Tyr GluLys Glu Glu Asp Leu Arg Asn Lys Ser Pro Leu Leu Leu Gln SerPro Val His Lys Lys lie Pro Val Leu lie His Asn Gly Lys ProAla Glu Ser Leu lie Ala Val Gln Tyr lie Asp Glu Val Trp AsnAla Ser Pro Leu Leu Pro Ser Asp Pro Tyr Gln Arg Ala Gln AlaPhe Trp Ala Asp Tyr Val Asp Lys Lys lie Tyr Glu lie Gly Arglie lie Trp Lys Lys Asn Glu Glu Arg Glu Ala Ala Lys Lys Glulie Asp Cys Leu Lys Leu Leu Glu Glu Gln Leu Gly Asp Lys ThrPhe Gly Gly Asp Lys Leu Gly Tyr Val Asp lie Ala Leu Val ProTyr Thr Trp Phe Lys Gly Tyr Glu Thr Leu Gly Asn Phe Asn lieSer Glu Cys Pro Lys Leu lie Ala Trp Ala Lys Arg Cys Leu GlnGlu Ser Val Ser Lys Ser Leu His Asp Gln Asp Lys lie Tyr Glulie Val Glu lie Arg Lys Lys Leu Gly lie Glu0本發明的基因制備中具體的工藝步驟和工藝條件是步驟(3)是利用設計的特異性引物，以百脈根培養21天后葉片組織的cDNA為模 板在擴增儀上按照94°C預變性5分鐘；30個PCR循環94°C變性30秒，52°C退火30秒，72°C
Gly Tyr Asn Ile Asp Arg Asn Phe Tyr Phe Glu Lys Phe
5延伸1分鐘；72°C延伸10分鐘的程序進行PCR擴增；以此PCR產物稀釋100倍后取1 μ 1作 模板進行PCR擴增，按照94°C預變性5分鐘；30個PCR循環94°C變性30秒，56°C退火30 秒，72°C延伸1分鐘；72°C延伸10分鐘的條件進行，兩次PCR反應均按如下成份及用量進
行
ddH2010. 5μ 1
IOx PCR Buffer2μ 1
dNTP(2. 5mmol/L)2μ 1
10umol/L的上游引物2μ 1
10umol/L下游引物2μ 1
模板1 μ 1
Taq plus DNA polymerase(5U/μ 1)0. 5μ 1
所述的步驟⑷是將內側引物擴增的PCR產物從瓊脂糖凝膠上切下，按上海生物
工程有限公司的EZ Spin Column DNA Gel Extraction KitUNlQ-IO柱式DNA膠回收試劑 盒說明書進行膠回收，在16°C下經T4DNA連接酶連接12小時，10 μ 1連接反應體系如下IOXLigation Buffer1 μ 1pMD18-T 載體(50ng/ μ 1)1 μ 1膠回收產物7μ1T4DNA 連接酶(350U/ μ 1)1 μ 1將連接產物轉化DH5 α感受態細胞，并篩選陽性克隆，送往上海生工進行測序，測 序與預期結果一致，將其命名為LcGST。本發明所具備的實質性特點和取得的顯著技術進步在于其一、目前百脈根被認為是豆科模式植物，通常被用來研究豆科植物和根瘤菌的 共生關系，由其基因組中進行抗旱、耐鹽相關基因的克隆研究報道較少，本發明所克隆的 LcGST基因在此種植物中為首次報道。其二、利用本發明所克隆的LcGST獲得的轉基因生物的耐鹽性顯著提高。這不僅 有助于揭示豆科植物抗旱、耐鹽的機理，為生物的抗旱耐鹽代謝途徑的研究提供重要理論 基礎，也為植物基因工程領域提供了更多的候選功能基因，對利用基因工程手段進行植物 遺傳性狀的改良具有重要參考價值。
本發明的附圖有圖1是本發明中兩次PCR產物在的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，分別獲得約 700bp左右的一條特異帶圖。圖中M是DL 2000Marker，l是內側引物PCR擴增產物，2是外側引物PCR擴增產物。圖2是LcGST編碼氨基酸的同源比對結果。圖中GmGST、VvGST, RcGST分別來源于大豆、葡萄和蓖麻，GenBank注冊號分別為 ACL80571、ABL84692、XP_002532823。將LcGST基因推斷的編碼氨基酸序列在NCBI數據庫中進行blast對比分析，發現它與多種植物體內的谷胱甘肽S-轉移酶均有一定相似度，經DNAMAN軟件對其與大 豆GmGST、葡萄VvGST、蓖麻RcGST進行相似性分析顯示，相似性分別為80. 6 %、76. 3 %和 73. 5% (圖2)，證明所克隆基因的編碼產物為谷胱甘肽S-轉移酶。圖3是質粒pET_32a(+)-LcGST雙酶切檢測結果。圖中 1 是 pET_32a(+)-LcGST 的酶切產物，2 是 DL 2000Marker,3 是 DL 15000Marker，4 是 pET_32a(+)的酶切產物。圖4是E. coli BL21(DE3)中誘導前和誘導后目的融合蛋白表達的SDS-PAGE檢測結果。圖中1、3、5分別為含重組質粒pET-32a(+)_LcGST、空質粒pET_32a(+)和不含 外源質粒的大腸桿菌BL21(DE3)未經IPTG誘導取得的總蛋白；2、4、6分別為含重組質粒 pET-32a(+)-LcGST、空質粒pET-32a(+)和不含外源質粒的大腸桿菌BL21 (DE3)經IPTG誘 導2小時后取得的總蛋白；7為標準蛋白。其中箭頭a表示融合蛋白；箭頭b表示標簽蛋白。圖5是NaCl處理條件下含重組質粒pET_32a (+) -LcGST、空質粒pET_32a (+)的大 腸桿菌生長情況分析。
具體實施例方式以下結合附圖對本發明的實施例做進一步的描述，但不應理解為對本發明的限 定，本發明的保護范圍以權利要求記載的內容為準。本實施例中的基因序列以及由其編碼的蛋白質序列如前述，其中基因的制備方法 及功能鑒定包括1、提高轉基因生物耐鹽性的基因LcGST的制備(1)首先通過電子拼接獲得基因序列以已知的大豆的谷胱甘肽S-轉移酶基因的編碼序列在美國國立生物技術信息中 心(NCBI)百脈根表達序列標簽數據庫中為LcGST基因尋找證據，獲得同源性很高的3條 EST序列，序列號分別為BW597792. UBW599863. 1和BW594579. 1。利用DNAMAN軟件對檢索 獲得的EST序列進行電子拼接，獲得了相應的含有完整開放閱讀框的拼接序列。(2)以拼接序列設計特異性引物，LcGST基因的外側上游引物為 5，-GTTCTTCCTCAAACTTCAACC-3，，外側下游引物為 5，-TTTCAAACCCTGTACAATCG-3，；內側上 游引物為 5，-ATAGGTACCGAGCTCACCATGGCTGACGAGGTG-3，，內側下游引物為 5，-CTGGGATCCCT CGAGCTACTCGATGCCTAACTTG-3，，將內側上、下游引物分別引入Kpn I和BamH I酶切位點；(3)利用設計的特異性引物以百脈根培養21天后的葉片組織的cDNA為模板進行 巢式PCR擴增，獲得目的條帶；(4)PCR終產物回收后與pMD18-T連接，并轉化感受態細胞DH5a，熱激轉化后，篩 選陽性克隆，進行測序，測序與預期結果一致。步驟(3)是利用設計的特異性引物，以百脈根培養21天后葉片組織的cDNA為模 板在擴增儀上按照94°C預變性5分鐘；30個PCR循環94°C變性30秒，52°C退火30秒，72°C 延伸1分鐘；72°C延伸10分鐘的程序進行PCR擴增；以此PCR產物稀釋100倍后取1 μ 1作 模板進行PGR擴增，按照94°C預變性5分鐘；30個PCR循環94°C變性30秒，56°C退火30 秒，72°C延伸1分鐘；72°C延伸10分鐘的條件進行，兩次PCR反應均按如下成份及用量進
7仃ddH20IOxPCR BufferdNTP(2. 5mmol/L)10umol/L的上游引物10umol/L 下游引物模板Taq plus DNA polymerase(5U/μ 1)
10. 5μ 1
2μ 1 2μ 1 2μ 1 2μ 1
1 μ 1 0. 5μ 1 步驟(4)是將內側引物擴增的PCR產物從瓊脂糖凝膠上切下，按上海生物工程有 限公司的EZ Spin Column DNA Gel Extraction Kit UN1Q-10柱式DNA膠回收試劑盒說明 書進行膠回收，在16°C下經T4 DNA連接酶連接12小時，10 μ 1連接反應體系如下將連接產物轉化DH5ci感受態細胞，熱激轉化后篩選陽性克隆，對獲得的陽性克 隆送往上海生工進行測序，測序與預期結果一致，將其命名為LcGST。2、LcGST推斷氨基酸序列的同源性分析將LcGST基因推斷的編碼氨基酸序列在NCBI數據庫中進行blast對比分析， 發現它與多種植物體內的谷胱甘肽S-轉移酶均有一定相似度，經DNAMAN軟件對其與大 豆GmGST、葡萄VvGST、蓖麻RcGST進行相似性分析顯示，相似性分別為80. 6%、76. 3%和 73. 5% (如圖2所示)，證明所克隆基因的編碼產物為谷胱甘肽S-轉移酶。3、百脈根谷胱甘肽S-轉移酶基因可提高轉基因生物耐鹽性的實驗分析(1)原核表達載體的構建與轉化子獲得將pET_32a(+)空質粒與含有目的片段的克隆載體分別用限制性內切酶Kpn I和 BamH I進行37°C、3小時的雙酶切反應，25 μ 1雙酶切反應體系成份及用量如下ddH203. 5 μ 110ΧΚ Buffer2. 5 μ 1質粒17 μ 1BamHI (8-20U/ μ 1)1 μ 1ΚρηΙ(4-12υ/μ 1)1 μ 1酶切產物經0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收目的條帶并利用Τ4 DNA連接 酶連接目的條帶，將連接產物轉化大腸桿菌，篩選含重組質粒的陽性克隆，并用Kpn I和 BamH I雙酶切分析所篩選的陽性克隆。結果如圖3所示，質粒pET_32a(+)的大小約為 5900bp，經雙酶切后出現pET-32a(+)線性片段；目的基因LcGST是一段全長約為680bp的 DNA，質粒pET-32a(+)-LcGST經雙酶切后電泳檢測，出現合適條帶，說明原核表達載體質粒 pET-32a(+)-LcGST構建成功。將構建的pET_32a (+)-LcGST原核表達載體利用熱激法轉入 BL2KDE3)菌株中，獲得含有重組質粒的大腸桿菌工程菌株。(2)重組蛋白的誘導表達與鑒定IOXLigation BufferpMD18-T 載體(50ng/ μ 1)膠回收產物T4DNA 連接酶(350U/ μ 1)
分別將含有重組質粒和含有空質粒(對照)的BL21 (DE3)菌株在37°C、IPTG的 終濃度為1. Ommol/L的條件下誘導2小時，取菌液煮沸裂解，5000轉/分鐘離心5分鐘，取 15μ1上清液進行SDS-PAGE垂直式凝膠電泳，其中分離膠為12%，濃縮膠為5%。分離膠(12% )的配制成份如下30% 儲備膠4.0ml1. 5mol/L Tris-HCl (pH = 8. 8)2. 5mlddH203.3ml10% SDS0. Iml10% AP0.1mlTEMED8μ 1濃縮膠(5%)的配制成份30% 儲備膠0.67ml0. 5mol/LTris-HCl (pH = 6. 8)0. 5mlddH202.75ml10% SDS40 μ 110% AP40 μ 1TEMED8μ 1電泳時，濃縮膠電流10mA，分離膠電流15mA，電泳至溴酚藍行至電泳槽前沿時停止(需約4小時)，用考馬斯亮蘭染色液室溫染色1-2小時。將膠從染 色液中取出，在脫色搖床慢搖脫色至條帶清晰，將脫色好的膠板拍照。照片如圖4所示，經 IPTG誘導的含有重組質粒pET-32a(+)-LcGST的大腸桿菌BL21 (DE3)與含空質粒對照相比， 在45KDa以下出現一條差異帶，且表達量明顯增強。預測目的融合蛋白包括GST蛋白(約 24. IKDa)和pET-32a標簽蛋白(約20. 7KDa)，分子量大約為44. 8KDa，因此分析此差異帶為 pET-32a (+) -LcGST在大腸桿菌BL21中表達的目的融合蛋白。(3)轉化子的耐鹽性鑒定分別挑取含重組質粒pET_32a(+)-LcGST和含空質粒對照的大腸桿菌BL21 (DE3) 單菌落37°C、200轉/分鐘振蕩培養過夜后用液體LB培養基調整至相同菌液濃度，分別取 100 μ 1 菌液轉入含有 0、100、200、300、400、500mmolNaCl 的液體 LB 培養基(含 1. Ommol/L IPTG)中進行脅迫處理，37°C、200轉/分鐘振蕩培養2小時后752型紫外分光光度計檢測 600nm下OD值，每個處理進行三次重復，將平均值進行對比分析(見圖5)，顯示相同鹽處理 條件下轉基因重組菌株的細胞數量與對照菌株相比均增加，其中300mmol/L NaCl脅迫處理 時增加最高，達到53. 1%，表明LcGST在大腸桿菌中的表達提高了宿主菌的耐鹽性。大腸桿菌菌株DH5 α和BL21 (DE3)均為公知公用菌株，熱激轉化方法為常規方法。 產物回收均按按照上海生工生物工程有限公司的EZ Spin ColumnDNA Gel Extraction Kit UN1Q-10柱式DNA膠回收試劑盒進行。
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權利要求
提高轉基因生物耐鹽性的基因LcGST，其特征在于其序列如下ATGGCTGACG AGGTGGTTCT TCTTGATTTC TGGGCAAGTC CATTTGGCAT GAGAGTCAGAATCGCACTTG CTGAAAAGGG TATCAACTAT GAGTACAAAG AAGAGGATTT GAGGAACAAGAGTCCTCTAC TTCTCCAATC GAACCCTGTT CACAAGAAGA TTCCAGTTCT CATCCACAATGGAAAACCCA TTGCTGAATC TCTGATTGCT GTTCAGTATA TTGATGAGGT GTGGAATGATGCATCTCCCT TGTTGCCTTC TGATCCTTAC CAGAGAGCTC AAGCTAGATT CTGGGCTGATTATGTTGATA AGAAGATATA TGAAATTGGT AGGAACATAA TTTGGAAGAA AAATGAAGAAAGAGAAGCTG CCAAGAAGGA ATTCATAGAT TGCCTCAAGT TGCTGGAGGA ACAGCTCGGAGACAAGACTT ACTTCGGAGG AGACAAGCTT GGGTATGTTG ATATAGCACT TGTTCCATTCTACACTTGGT TTAAAGGCTA TGAGACCCTT GGCAACTTCA ACATAGAGAG TGAGTGCCCCAAGCTCATTG CTTGGGCCAA GAGATGCCTG CAGAAAGAGA GCGTTTCAAA GTCTCTCCATGACCAAGACA AGATCTATGA GTTCATTGTG GAAATCAGAA AGAAGTTAGG CATCGAGTAG。
2.根據權利要求1所述的可提高轉基因生物耐鹽性的基因LcGST的$路，其特征在于 所述的制備方法包括如下步驟(1)首先以已知的大豆谷胱甘肽S-轉移酶基因的編碼序列在美國國立生物技術信息 中心百脈根的表達序列標簽數據庫中為LcGST基因尋找證據，獲得同源性很高3條EST序 列，序列號分別為BW597792. UBW599863. 1和BW594579. 1，利用DNAMAN軟件對檢索獲得的 EST序列進行電子拼接，獲得了相應的含有完整開放閱讀框的拼接序列；(2)依拼接序列設計特異性引物，LcGST基因的外側上游引物為 5，-GTTCTTCCTCAAACTTCAACC-3，，外側下游引物為 5，-TTTCAAACCCTGTACAATCG-3，；內側上 游引物為 5，-ATAGGTACCGAGCTCACCATGGCTGACGAGGTG-3，，內側下游引物為 5，-CTGGGATCCCT CGAGCTACTCGATGCCTAACTTG-3，，將內側上、下游引物分別引入Kpn I和BamH I酶切位點；(3)利用設計的特異性引物以百脈根培養21天后的葉片組織cDNA為模板進行巢式 PCR擴增，獲得目的條帶；(4)PCR終產物回收后與pMDl-T連接，連接產物采用熱激轉化法轉入大腸桿菌DH5α的 感受態細胞，并篩選陽性克隆，進行測序，測序與預期結果一致。
3.根據權利要求2所述的可提高轉基因生物耐鹽性的基因LcGST的制備，其特征在于 所述的步驟(3)是利用設計的特異性引物，以百脈根培養21天后葉片組織的cDNA為模板 在擴增儀上按照94°C預變性5分鐘；30個PCR循環94°C變性30秒，52°C退火30秒，72°C 延伸1分鐘；72°C延伸10分鐘的程序進行PCR擴增；以此PCR產物稀釋100倍后取1 μ 1作 模板進行PCR擴增，按照94°C預變性5分鐘；30個PCR循環94°C變性30秒，56°C退火30 秒，72°C延伸1分鐘；72°C延伸10分鐘的條件進行，兩次PCR反應均按如下成份及用量進 行ddH2010. 5 μ 1IOx PCR Buffer2 μ 1dNTP(2. 5mmo 1/L)2μ 1lOumol/L的上游引物2μ110umol/L下游引物2μ1模板1 μ 1Taq plus DNA polymerase(5U/μ 1) 0. 5 μ 1
4.根據權利要求2所述的提高轉基因生物耐鹽性的基因LcGST的制備，其特征在于所 述的步驟(4)是將內側引物擴增的PCR產物從瓊脂糖凝膠上切下，按上海生物工程有限公 司的EZ Spin Column DNA Gel Extract ion KitUNlQ-IO柱式DNA膠回收試劑盒說明書進 行膠回收，在16°C下經T4DNA連接酶連接12小時，10 μ 1連接反應體系如下將連接產物轉化DH5 α感受態細胞，并篩選陽性克隆，送往上海生工進行測序，測序與 預期結果一致，將其命名為LcGST。
5.利用如權利要求1所述的基因LcGST編碼的蛋白，其特征在于其序列如下 Met Ala Asp Glu Val Val Leu Leu Asp Phe Trp Ala Ser Pro Phe Gly Met Arg Val Arg lie Ala Leu Ala Glu Lys Gly lie Asn Tyr Glu Tyr Lys Glu Glu Asp Leu Arg Asn Lys Ser Pro Leu Leu Leu Gln Ser Asn Pro Val His Lys Lys lie Pro Val Leu lie His Asn Gly Lys Pro lie Ala Glu Ser Leu lie Ala Val Gln Tyr lie Asp Glu Val Trp Asn Asp Ala Ser Pro Leu Leu Pro Ser Asp Pro Tyr Gln Arg Ala Gln Ala Arg Phe Trp Ala Asp Tyr Val Asp Lys Lys lie Tyr Glu lie Gly Arg Asn lie lie Trp Lys Lys Asn Glu Glu Arg Glu Ala Ala Lys Lys Glu Phe lie Asp Cys Leu Lys Leu Leu Glu Glu Gln Leu Gly Asp Lys Thr Tyr Phe Gly Gly Asp Lys Leu Gly Tyr Val Asp lie Ala Leu Val Pro Phe Tyr Thr Trp Phe Lys Gly Tyr Glu Thr Leu Gly Asn Phe Asn lie Glu Ser Glu Cys Pro Lys Leu lie Ala Trp Ala Lys Arg Cys Leu Gln Lys Glu Ser Val Ser Lys Ser Leu His Asp Gln Asp Lys lie Tyr Glu Phe lie Val Glu lie Arg Lys Lys Leu Gly lie Glu0·10 X Li gat ion Buffer PMD18-T 載體(50ng/ μ 1) 膠回收產物
全文摘要
本發明屬于新基因的制備，特別是指一種提高轉基因生物耐鹽性的基因LcGST以及利用其編碼的蛋白。外側上游引物為5’-GTTCTTCCTCAAACTTCAACC-3’，外側下游引物為5’-TTTCAAACCCTGTACAATCG-3’；內側上游引物為5’-ATAGGTACCGAGCTCACCATGGCTGACGAGGTG-3’，內側下游引物為5’-CTGGGATCCCTCGAGCTACTCGATGCCTAACTTG-3’，以百脈根培養21天后的葉片組織cDNA為模板，采用巢式PCR擴增方法首次在百脈根中獲得谷胱甘肽S-轉移酶基因LcGST，并應用其編碼了可提高轉基因生物耐鹽性的蛋白。本發明為耐鹽基因工程提供了新的候選基因，利用本發明獲得的谷胱甘肽S-轉移酶基因LcGST基因可為進一步轉化到重要作物提高轉基因植物耐鹽性奠定基礎，具有較大的經濟效益和應用價值。
文檔編號C12N15/54GK101942468SQ20101019700
公開日2011年1月12日 申請日期2010年5月28日 優先權日2010年5月28日
發明者馮雪, 孫艷香, 王彬 申請人:廊坊師范學院