專利名稱：基于PCR擴增的200bpDNAladder模板p222及其制備體系的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和基因工程研究領域中電泳耗材DNAmarkeHDNA分子量 標準)的制備方法的革新。具體地說，本發明以一種專有的PCR模板設計，建立了一套全新 的基于PCR擴增方法的200bp DNA ladder的制備體系。
背景技術：
DNA分子量標準是指一組分子量已知的DNA分子的混合物，電泳后按照其分子量 的大小和遷移率的不同，在凝膠上形成一個DNA片段分布的梯度(ladder)，用以指示電泳 過程中未知DNA樣品的分子量。目前，DNA分子量標準多是購自生物公司；同時由于其應用 的普遍性和必要性，為了節約開支，很多實驗室都自己制備常用的分子量標準。國內市場 上的DNA分子量標準從最初的以進口產品為主、到目前以國產產品為主和許多自制品的出 現，其神秘的面紗正在慢慢退去。按照DNA分子量標準制備所涉及的關鍵技術(過程)，其 制備方法可以分為限制性內切酶酶切和PCR擴增兩種方法；其中限制性內切酶酶切的DNA 分子的來源又可以分為天然的基因組DNA和人工構建的質粒載體；PCR擴增又可分為單片 段的擴增和多片段的擴增。1.通過限制性核酸內切酶酶切制備DNA分子量標準利用DNA分子中存在的限制性內切酶酶切位點(天然的或人為加入的)，采用合 適的內切酶對其進行消化，從而形成一組分子量各異的DNA片段，用來作為DNA分子量標 準。按照被消化DNA的來源可以分為兩種天然來源的特種DNA(如基因組)和人工構建的 質粒DNA。天然來源的基因組DNA的限制性內切酶酶切是通過分離某種來源的基因組DNA 分子，然后用一種或幾種限制性內切酶進行消化，從而產生一系列的DNA片段組合，目前最 常見的此類DNA分子是Lamda噬菌體的基因組DNAU DNA)，由其產生的DNA分子量標準有 XDNA/Hindlll，λ DNA/EcoRI+HindIII等，也可以是某種具有多個常見酶切位點質粒，如 pBR322DNA/AluI marker和pBR322DNA/BsuRI (HaeIII)marker,但是所用的內切酶都是不常 用的，因而成本較高。人工構建載體(質粒)的限制性內切酶酶切是通過一次性把所需要 的各種DNA片段克隆到高拷貝數的載體上，轉入大腸桿菌，通過發酵培養和質粒DNA的分離 純化，經過適當的酶切即可以獲得大量的目標DNA片段。這種方法的優勢在于通過大腸桿 菌的發酵擴增質粒獲得目的DNA片段，其制備規模很容易放大(50升的發酵體系很容易建 立，而PCR擴增一般只能在小于500微升的體系內進行)，獲得的DNA片段條帶在凝膠上條 帶銳利，過程重復性高。不存在PCR擴增再現性不好的缺點。但是由于DNA小片段分子量 小，電泳時條帶相對于高分子量的DNA大片段非常弱，所以上述重組載體不適用于制備DNA 小片段。這是利用重組載體制備各種DNA marker體系中存在的明顯缺陷。目前各種DNA 小片段的制備主要以PCR擴增的方法為主。2.通過PCR擴增制備DNA分子量標準由于PCR(Polymerase Chain Reaction)技術強大的DNA片段的擴增能力，同時由 于目前Taq DNA聚合酶工程菌株的廣為流傳，目前利用PCR方法生產DNA分子量標準不存在技術問題，成本主要是引物合成和dNTP的購置，其他PCR試劑如Taq DNA聚合酶，模板DNA， 反應Buffer等均可自制。由于生產效率低，濃度強度高，因而限制了其大規模的制備和應用。長期以來，分子生物學試劑與基因工程研究領域缺少作為PCR模板用的復合重組 載體設計方案和一種用于200bp DNA ladder中片段擴增的專用載體，以及與之相應的制備 體系。利用本發明中的載體可以復合體的方式制備DNA小片段，然后通過PCR產物的酶切 得到所需的目標DNA小片段；以克服普通PCR擴增產生DNA片段生產效率低，勞動強度高等 缺陷；從而能夠快速、大規模的地生產DNA分子量標準200bp ladder。
發明內容
鑒于此，我們設計和重組構建了用作PCR擴增模板p222，并建立了相應的200bp DNA ladder的制備體系，恰恰滿足了上述需求；其目的在于提供了一種專門用于200bp DNA ladder制備用的PCR擴增模板p222。本發明的進一步目的在于提供一種利用上述的PCR擴增模板p222制備200bp DNA ladder中所需的DNA分子的制備體系。為了實現上述目的，本發明提供的制備用模板P222是一種專門用于200bpDNA ladder制備用的PCR擴增模板，其中含有3個200bp的重組DNA片段，每個200bp片段兩端 均有兩個EcoRI酶切位點，三條重組DNA片段的結構為E200E200E200E。本發明中200bp DNA ladder的PCR擴增模板p222的構建方法，包括如下步驟分別以Lambda噬菌體基因組DNA為模板，利用PCR的方法擴增獲得如下片段 200E、E200E、E200bp，其中200E的3，末端、E200bp的5，末端，以及E200Ebp的兩個末端帶 有EcoRI限制向內切酶的位點，三種DNA片段經EcoRI酶切后，以一種順序連接的方式進行 連接，然后以末端引物PFlR對連接產物進行擴增，篩選獲得200-200-200bp連接產物。同 時為其末端添加TA克隆中所需要的突出端A(腺嘌呤核苷酸)；將上述連接產物TA克隆到 克隆載體pGEM-Teasy中，即得到設計模板p222。制備200bp DNA ladder中所需的DNA分子的制備體系以p222為擴增模板，在其兩端(200-200-200)序列選擇合適位點作為引物位點， 擴增獲得如下PCR產物200/400/600-拉00-200-200丨.-200/400/600,共九種PCR產物。經 EcoRI酶切后，所得產物均為200bp DNA ladder中的片段。PCR引物的組合可以調節目標 DNA片段之間的數量比例，從而使其具有相當的質量關系。本發明中的PCR模板載體p222是一種專門用于200bp DNA ladder片段制備用 的PCR擴增模板；通過靈活的引物位點選擇，可以特異性的以復合體的形式擴增DNA片段 (200-1200bp)；所獲得的PCR產物過EcoRI的酶切可以釋放其中的目標DNA片段。本發明的有益效果在于設計了一種PCR擴增模板p222，其中含有3條由4個 EcoRI酶切位點分隔的200bp重組DNA片段；以此重組載體為PCR擴增模板能夠以復合體 的形式高效制備200bp ladder中的DNA片段(通過EcoRI酶切)。與傳統的PCR擴增方法 相比具有消耗少(如dNTP、DNA聚合酶、引物、反應緩沖液、實驗耗材等)、效率高(多片段 的同時擴增)、省時省力等優點；其優勢還在于通過引物位點的選擇可以靈活的調整制備 片段的種類及其之間的數量關系。
圖1是基于PCR技術的200bp DNAladder制備用重組模板p222的圖譜。具體實施實例參照附圖，本發明提供的p222是一種專門用于200bp DNA ladder制備用的PCR 擴增模板；其圖譜中含有3個200bp的重組DNA片段，每個200bp片段兩端均有兩個EcoRI 酶切位點，三條重組DNA片段的結構為E200E200E200E。其200bp DNA ladder 制備體系為以p222為PCR擴增模板，在其核心序列(200-200_200bp)兩側選擇合適位點作為 引物序列，擴增可以獲得如下類型的PCR產物復合體200/400/600- |200-200-200丨-200/400/600，共 9 種擴增復合體；每種復合體經EcoRI部分或完全酶切后，所得產物均為200bp DNA ladder中的 DNA片段。
權利要求
基于PCR擴增的200bp DNA ladder模板p222，其特征在于其圖譜中含有3個200bp的重組DNA片段，每個200bp片段兩端均有兩個EcoRI酶切位點，三條重組DNA片段的結構為E200E200E200E。
2.根據權利要求1所述的基于PCR擴增的200bpDNA ladder模板p222的制備體系， 其特征在于以重組載體P222為模板，在其核心序列(200-200-200bp)兩側選擇合適位 點作為引物序列，擴增可以獲得如下類型的PCR產物復合體=200/400/600- |200-200-200|. -200/400/600,共9種復合體；每一種復合物經EcoRI酶切后，所得產物均為200bp DNA ladder中的片段。
全文摘要
基于PCR擴增的200bp DNA ladder模板p222，其圖譜中含有3個200bp的重組DNA片段，每個200bp片段兩端均有兩個EcoRI酶切位點，三條重組DNA片段的結構為E200E200E200E。其制備體系以重組載體p222為模板，在其核心序列(200-200-200bp)兩側選擇合適位點作為引物序列，擴增可以獲得如下類型的PCR產物復合體200/400/600--200/400/600，共9種復合體；經EcoRI酶切后，所得產物均為200bpDNAladder中的片段。
文檔編號C12N15/11GK101880661SQ20101019781
公開日2010年11月10日 申請日期2010年6月11日 優先權日2010年6月11日
發明者葉春和, 葉春江, 谷勁松 申請人:濟南大學