用于檢測弓形蟲的引物、試劑盒及方法

專利名稱：用于檢測弓形蟲的引物、試劑盒及方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體地，本發明涉及一種用于檢測弓形蟲的引物、試劑
盒及方法。
背景技術：
弓形蟲病是由弓形蟲寄生引起的一種感染，世界各地的弓形蟲感染非常普遍，美、 英的成年人中，大約16-40%曾經感染，有的調查達70%，而歐洲大陸和拉丁美洲的成年人， 50-80%有過感染，法國人高達90%。我國弓形蟲感染低于國外。弓形蟲可經孕婦胎盤侵入 胎兒，并可對之造成嚴重損害，如腦積水、小腦畸形、失明及智力發育障礙等。因此，快速可 靠的產前診斷是十分需要的。如果懷孕頭3個月發生先天性感染，大約40%胎兒可能有嚴 重損害，出現流產、死胎或新生兒疾病，或者出生后有眼、腦或肝臟的病變或畸形，如視網膜 脈絡膜炎、白內障、腦內鈣化、腦積水、小頭畸形、智力障礙、黃疸和肝脾腫大。懷孕末3個月 發生的感染，嚴重者不到3%。因此孕前檢查并治療是非常必要的，孕間的檢測也不容忽視。目前已有的弓形蟲檢測方法有以下幾種
1)直接鏡檢取患者血液、骨髓或腦脊液、胸腹水、痰液、支氣管肺泡灌洗液、眼房水、 羊水陰道分泌物等作涂片，或淋巴結、肌肉、肝、胎盤等活組織切片，作瑞氏或姬氏染色鏡檢 可找到滋養體或包囊，但檢出陽性率不高，不夠靈敏可信。2)動物接種或組織培養取待檢體液或組織懸液，接種小白鼠腹腔內，可產生感 染并找到病原體，第一代接種陰性時，應盲目傳代3次；或作組織(猴腎或豬腎細胞)培養以 分離、鑒定弓形蟲。但此方法時間長，檢出率低。3)免疫學檢查檢測抗體所用抗原主要有速殖子可溶性抗原(胞質抗原)和胞膜 抗原。前者的抗體出現較早(用染色試驗、間接免疫熒光試驗檢測)、而后者的抗體出現較晚 (用間接血凝試驗等檢測)。同時采用多種方法檢測可起互補作用而提高檢出率。但由于弓 形蟲在人體細胞內可長期存在，故檢測抗體一般難以區別現癥感染或以往感染。4) DNA檢測技術國內已建立多聚酶鏈反應診斷本病毒，并與探針雜交、動物接種 和免疫學檢查方法相比較，顯示具高度特異、敏感和快速等優點。PCR檢測具有高度的特異性和敏感性，可以檢測出微量的蟲體DNA，從而推斷出蟲 體存在與否，不失為一種較有效的判斷母體有無蟲血癥的病原學診斷手段。國外近年來應 用PCR診斷免疫缺陷病人弓形蟲感染取得較好的結果。但傳統的PCR診斷需要用電泳檢測， 如申請號為CN200710032159. 1的中國發明申請，電泳檢測靈敏度一般且不適用于臨床，容 易因樣品污染而增加假陽性結果導致檢測結果不準確。

發明內容
本發明的目的是提供一種用于檢測弓形蟲的引物，利用該引物可以在基因水平上 對弓形蟲迅速的進行診斷。本發明的另一個目的是提供一種利用上述的引物制備的用于檢測弓形蟲的試劑
3盒，該試劑盒在弓形蟲的檢測中具有較高的靈敏度和高效、高特異性，檢測耗時少、檢測結 果穩定。本發明的又一個目的是提供一種用于檢測弓形蟲的方法，該方法利用本發明提供 的試劑盒進行弓形蟲的檢測，檢測耗時少、檢測結果穩定。本發明的上述技術問題是通過以下技術方案得以實施的
一種用于檢測弓形蟲的引物，其特征在于該引物為弓形蟲特異性B基因，該引物的上 游引物具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列(5‘ -TCACAGGCAAGCTCGCCTGTGCTT-3‘);下 游引物具有如SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列(5' - TTTCCACCCTCCAGGAAAAGCA -3')。所 述的引物可特異性的擴增出弓形蟲B基因，該引物用于檢測弓形蟲時，最好是以人DNA保守 序列特有基因β球蛋白(β-globin)基因作為內參引物，該內參引物的上游引物核苷酸序 列為 SEQ ID NO. 3 (5' - TGACAAGGCCATGAGGCTGGTGTA -3')，下游引物核苷酸序列為 SEQ ID NO. 4(5' - GAGTCCATCACGATGCCAGTGGTA -3')。經實驗表明，通過 PCR 反應，該內參引 物較之其它根據人DNA保守序列設計的引物能夠更快速有效地識別人體DNA，可以確定模 板的提取質量，避免擴增結果的假陰性。一種用于檢測弓形蟲的試劑盒，包括PCR反應液、所述的引物和內參引物混合液、 陰性對照物、陽性對照物和滅菌雙蒸水。該試劑盒采用本發明提供的引物，是一種具有較好 靈敏度和高效、高特異性的檢測弓形蟲的工具。作為優選方案，所述的內參引物的上游引物具有如SEQ ID No. 3所示的核苷酸序 列；下游引物具有如SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。作為優選方案，所述的PCR反應液是包括pH 8. 4的Tris_HC140 mM, MgCl2 15 24mM,KCl 50 mM，(NH4)2SO4 10 m M, dNTP 0. 4mM 和終濃度 0. 06 0. 10 U/μ L 的 Taq DNA 多聚酶的混合溶液。更為優選的方案是，所述的PCR反應液是包括pH 8.4的Tris-HCl 40 mM, MgCl2 20 mM,KCl 50 mM，(NH4)2SO4 10 mM, dNTP 0. 4mM 和終濃度 0· 08 U/yL 的 Taq DNA 多聚酶的混合溶液。作為優選方案，所述的引物和內參引物混合液是由ΙΟμΜ內參引物和ΙΟμΜ弓丨物 混合配制而成，其中內參引物/引物的體積比值范圍為0. 6 1. 2。最佳的內參引物/引物 的體積比值為1 :1。作為優選方案，所述的陽性對照物為含弓形蟲特異性基因的宮頸細胞DNA，陰性對 照物為ddH20。一種檢測弓形蟲的方法，包括以下步驟1)提取樣本DNA ;2)使用本發明提供的引 物或試劑盒對步驟1)得到的DNA進行PCR擴增；3)檢測步驟2)所得到的擴增產物。該方 法是一種具有較好靈敏度和高效、高特異性的檢測弓形蟲的方法。該方法簡單、成本低廉、 適宜于廣泛推廣。作為優選方案，步驟1)中的樣本為人的靜脈全血、或宮頸懸浮細胞及分泌 物，步驟3)中的采用的檢測方法為微流體芯片檢測法。微流體芯片檢測法是在玻璃芯片上 蝕刻若干微米級通道，構建“微型實驗室”，分析樣品從上樣管道進入芯片，在電場或壓力場 作用下，進入分離管道，在分離管道內樣品完成自動分離，到達監測點，激光激發熒光發光， 儀器收集并自動處理數據，完成芯片上的自動化分析。本發明通過對患者的靜脈血細胞或者宮頸細胞及分泌物中的DNA進行弓形蟲B基 因檢測，從而診斷患者是否感染了弓形蟲，具體包括以下步驟1)將本發明提供的引物和內參引物(分別為SEQID NO :1和2所示的核苷酸序列和SEQ ID NO 3和4所示的核苷酸序列)混合，對被測樣本的DNA進行多重PCR擴增；或采用本發明 提供的試劑盒對被測樣本的DNA進行多重PCR擴增；被擴增的目標基因片段大小各不相同；
2)擴增產物通過微流體芯片進行檢測；
3)通過對各檢測峰位置的判斷，確定檢測到的片段的大小，從而確定被檢測到的基因， 判斷臨床樣本感染的病毒類別；
4)結果判斷a)未出現任何特異性峰，說明臨床樣本的DNA沒有提取出，檢測無效；b) 只出現DNA內參特異性峰，說明沒有弓形蟲感染；c)出現DNA內參和弓形蟲B基因特異性 峰，說明有弓形蟲感染。與現有的檢測方法和試劑盒相比，本發明具有以下優點
1)本發明采用PCR技術，對弓形蟲特異性基因片段進行擴增。其區別與其他已有基因 檢測的主要方面為本試劑盒檢測手段為微流體芯片檢測法，不同于電泳檢測或RT-PCR儀 檢測，檢測結果更直觀，靈敏度高，可信性好，且檢測芯片為一次性使用，不會因污染而增加 假陽性結果，適合臨床應用。2)內參引物的加入優選的人DNA保守序列特有基因的特異性引物作為內參引 物，該內參引物的設計選用了人β球蛋白(β-globin)基因，因為人體細胞中都含有此基 因，引入該內參基因可以確定臨床樣本的提取質量，避免擴增結果的假陰性。3)本發明提供的檢測弓形蟲的方法，可以在基因水平上迅速的進行診斷，具有較 好的靈敏度和特異性。該方法可直接對患者的臨床樣本(例如靜脈血、宮頸懸浮細胞)進行 檢測，不需要對樣本進行培養后再對病毒株進行檢測，節約了時間。同時，微流體芯片檢測 法比傳統的DNA電泳檢測法簡單、快捷、直觀，為臨床用藥提供了準確、及時的指導。因此， 本發明所提供的方法技術成熟，檢測結果穩定，比傳統的濾紙片法、凝膠法等更快捷、靈敏、 準確。


圖1是引物和內參引物混合液擴增DNA樣品的電泳圖，其中1-5是宮頸懸浮細 胞DNA樣品，6-10是靜脈血液DNA樣品，+是陽性對照，-是陰性對照，200和300是對應的 Marker條帶的bp數。圖2是不同比例的引物和內參引物混合液擴增感染弓形蟲的DNA樣品圖，其中各 點樣孔中內參引物和引物的體積比如下1-2:內參引物/引物=0.6，3-4:內參引物/引物 =1. 0，5-6 內參引物/引物=1. 2，-是陰性對照，200和300是對應的Marker條帶的bp數。圖3是不同組分的PCR反應液擴增感染弓形蟲的DNA樣品圖，其中1_2 =MgCl2 15mM、Taq DNA 多聚酶 0. 06U/ μ 1,3-4 =MgCl2 20mM、Taq DNA 多聚酶 0. 08U/ μ 1, 5-6 =MgCl2 24mM、Taq DNA多聚酶0. IOU/ μ 1，-是陰性對照，200和300是對應的Marker條帶的bp數。圖4是未感染弓形蟲的DNA樣品的微流體芯片檢測結果圖。圖5是感染弓形蟲的DNA樣品的微流體芯片檢測結果圖。
具體實施例方式以下參照具體的實施例及附圖來說明本發明。本領域技術人員能夠理解，這些實
5施例僅用于說明本發明，其不以任何方式限制本發明的范圍。以下實施例中所使用的技術，除非特別說明，均為本領域的技術人員已知的常規 技術；所使用的儀器設備、試劑等，除非是本說明書特別說明，均為本領域的研究和技術人 員可以通過公共途徑獲得的。本發明所述的“PCR”是指聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)，是本領域技術人員熟知的用一對寡聚DNA作為引物，通過加溫變性-退 火-DNA合成這一周期的多次循環，使目的DNA片段得到擴增的一項分子生物學技術。本發明微流體芯片檢測法使用的檢測儀器是購自寧波美生醫療器械有限公司生 產的微流體芯片電泳儀，該儀器的專利申請號為CN200910272437. X、CN200920230097. X、 CN200910272874. X、CN200910273037. 0、CN200920288540. 9、CN200910272436. 5。實施例1 試劑盒的組成與配制
本發明的試劑盒由PCR反應液、引物和內參引物混合液、陰性對照物、陽性對照物和滅 菌雙蒸水組成。1.配制 PCR 反應液Tris-HCl CpH 8.4)40 mM，MgCl2 15 24mM，KCl 50 mM, (NH4)2SO4 10 m Μ, dNTP 0.4 mM, Taq DNA 多聚酶的終濃度為 0. 06 0. 10 U/yL。其中 MgCl2最佳的濃度為20 mM, Taq DNA多聚酶的最佳終濃度為0. 08 U/ μ L ；
2.配制引物和內參引物混合液由10 μ M的內參引物和10 μ M的引物混合配制而成， 內參引物/引物體積比值范圍為0. 6 1. 2，其中優選的內參引物/引物體積比值為1:1; 內參引物(S卩Β297引物)是針對內參基因——β球蛋白(β -globin)基因設計的一對特異 性引物，可以特異擴增出β球蛋白(β-globin)基因中297bp大小的保守片段。3.滅菌雙蒸水(ddH20)；
4.陽性對照物含弓形蟲基因的宮頸細胞DNA;
5.陰性對照物ddH20。為方便描述本發明的效果，以下各實施例均采用本試劑盒的最優配比，即本發明 的試劑盒包括
1.PCR 反應液Tris-HCl CpH 8.4)40 mM, MgCl2 20 mM, KCl 50 mM, (NH4)2SO4 10 m Μ, dNTP 0. 4 mM, Taq DNA 多聚酶的終濃度為 0. 08 U/μ L ；
2.引物和內參引物混合液由10μ M的內參引物和10 μ M的引物混合配制而成，內參 引物/引物體積比為1:1 ；
3.滅菌雙蒸水(ddH20)；
4.陽性對照物含弓形蟲基因的宮頸細胞DNA;
5.陰性對照物ddH20。實施例2 臨床樣本的制備(按血液、組織提取試劑盒)
本實施例制備本發明檢測方法所使用的樣本為人體靜脈血液樣本或宮頸細胞樣本，提 取用試劑盒為寧波基內生物技術有限公司生產的血液/組織基因組提取試劑盒(注冊號 浙甬食藥監械(準)字2010第1400013號)。使用此試劑盒分別提取5個臨床宮頸懸浮細胞 樣本和5個臨床靜脈血液樣本詳述如下。1.樣本處理
a、血樣處理取新鮮血樣或將加入抗凝劑的血液樣本解凍，混勻后取100μ 1于1. 5ml
離心管中。
b、懸浮細胞樣本處理宮頸組織懸浮樣本自然沉降后，取沉降溶液底部細胞液 Iml放入EP管中，12000r/min離心2min，棄上清。2.吸附一漂洗一洗滌一溶解。具體操作同血液/組織基因組提取試劑盒說明書。實施例3 用引物和內參引物混合液擴增DNA樣本
本實施例為采用本發明所提供的引物和內參引物序列擴增實施例2所提取的10個DNA 樣品，并采用凝膠電泳檢測PCR的擴增結果。引物和內參引物序列見表1。表1 PCR擴增引物和內參引物序列
權利要求
一種用于檢測弓形蟲的引物，其特征在于該引物為弓形蟲特異性B基因，該引物的上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
2.一種用于檢測弓形蟲的試劑盒，其特征在于包括PCR反應液、如權利要求1所述的引 物和內參引物混合液、陰性對照物、陽性對照物和滅菌雙蒸水。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的內參引物的上游引物具有如SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。
4.根據權利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于所述的PCR反應液是包括pH8.4 的 Tris-HC140 mM，MgCl2 15 24 mM，KCl 50 mM, (NH4)2SO4 10 mM, dNTP 0.4mM 和終濃度 0. 06 0. 10 U/μ L的Taq DNA多聚酶的混合溶液。
5.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的PCR反應液是包括pH8. 4的 Tris-HC140 mM, MgCl2 20 mM, KCl 50 mM, (NH4)2SO4 10 mM, dNTP 0. 4mM 和終濃度 0. 08 U/ μ L的Taq DNA多聚酶的混合溶液。
6.根據權利要求2或3或5所述的試劑盒，其特征在于所述的引物和內參引物混合液 是由ΙΟμΜ內參引物和ΙΟμΜ引物混合配制而成，其中內參引物/弓丨物的體積比值范圍為 0. 6 1. 2。
7.根據權利要求2或3或5所述的試劑盒，其特征在于所述的陽性對照物為含弓形蟲 特異性基因的宮頸細胞DNA ；陰性對照物為ddH20。
8.—種檢測弓形蟲的方法，其特征在于包括以下步驟1)提取樣本DNA；2)使用權利要求1所述的引物或權利要求3所述的試劑盒對步驟1)得到的DNA進行 PCR擴增；3)檢測步驟2)所得到的擴增產物。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述的步驟1)中的樣本為人的靜脈全血、 或宮頸懸浮細胞及分泌物；步驟3)中的采用的檢測方法為微流體芯片檢測法。
10.根據權利要求8所述的方法，其特征在于該方法包括以下步驟1)用權利要求1所述的引物或權利要求3所述的試劑盒對被測樣本的DNA進行多重 PCR擴增；被擴增的目標基因片段大小各不相同；2)擴增產物通過微流體芯片進行檢測；3)通過對各檢測峰位置的判斷，確定檢測到的片段的大小，從而確定被檢測到的基因， 判斷臨床樣本感染的病毒類別；4)結果判斷a)未出現任何特異性峰，說明臨床樣本的DNA沒有提取出，檢測無效；b) 只出現DNA內參特異性峰，說明沒有弓形蟲感染；c)出現DNA內參和弓形蟲B基因特異性 峰，說明有弓形蟲感染。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，具體地，本發明涉及一種用于檢測弓形蟲的引物、試劑盒及方法。本發明引物的核苷酸序列如下上游引物5′-TCACAGGCAAGCTCGCCTGTGCTT-3′，下游引物5′-TTTCCACCCTCCAGGAAAAGCA-3′，利用此引物可在基因水平上對弓形蟲迅速的進行診斷。利用上述的引物制備的用于檢測弓形蟲的試劑盒在弓形蟲的檢測中具有較高的靈敏度和高效、高特異性，檢測耗時少、檢測結果穩定，避免了現有的電泳法因樣品污染而增加假陽性結果導致檢測結果不準確的情況的發生。本發明還提供一種用于檢測弓形蟲的方法，該方法利用本發明提供的試劑盒進行弓形蟲的檢測，檢測耗時少、檢測結果穩定，比傳統的濾紙片法、凝膠法等更快捷、靈敏、準確。
文檔編號C12N15/11GK101948911SQ20101019767
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月27日 優先權日2010年8月27日
發明者倪劍鋒, 徐輝, 楊文輝, 潘承斌 申請人:寧波基內生物技術有限公司