專利名稱：一種藥用重組人白細胞介素-11的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種藥用重組人白細胞介素-Ii的制備方法。屬于生物技術領域。
背景技術：
人白細胞介素-11 (IL-Il)是一種存在于人體骨髓、神經、呼吸道及消化道上皮等 多種組織，具有廣泛生理功能的細胞因子，特別是其對造血系統的作用而使其具有重要的 臨床價值。目前，重組人IL-Il (Neumega , Genetics Institute)已于1997年11月被 FDA批準正式上市，其適應癥為化療引起的血小板減少，成為了目前用于治療化療引起的血 小板減少癥的唯一首選藥物。IL-11是在20世紀80年代末才被發現的，其發現源自骨髓基質細胞株PU-34的培 養液能刺激過量IL-6抗體中和的T1165細胞株的生長。1990年，Paul SR等克隆到完整的人 IL-IlcDNA，此后其結構與功能被逐漸揭示。人IL-Il的基因位于19號染色體ql3. 3-13. 4 區，全長為7Kb，含5個外顯子和4個內含子。人IL-llcDNA編碼199個氨基酸的多肽，N端 21個aa組成信號肽，成熟蛋白由178個aa殘基組成。成熟蛋白中無半胱氨酸殘基，因而無 分子內和分子間二硫鍵的結構，并且也沒有潛在的糖基化位點，同時其Pl值高達11. 7,與 功能相關的自細胞介素6無DNA水平的同源。IL-Il主要由間充質來源的粘附細胞(如骨髓基質細胞、基質成纖維細胞、胚肺成 纖維細胞等)產生。IL-Il是生長因子家族成員，所述家族包括生長激素、G-CSF和其他生 長因子。IL-Il也是細胞因子家族成員，所述家族包括IL-6、白血病抑制因子(LIF)、制瘤 素M(OSM)和睫狀神經營養因子(CNTF)，它們均通過共同受體亞基gpl30傳遞信號。隨著 研究的深入，人們發現IL-Il是一種多功能的細胞因子，具有廣泛的生物學活性。IL-Il主 要的生物學功能是對造血系統各系細胞增殖的刺激與促進作用。例如，IL-Il與一些在細 胞增殖分化不同階段先后發揮作用的細胞因子(包括IL-3、IL-4、SCF、GM-CSF等)協同作 用，刺激多能造血干細胞、多能定向干細胞和單能定向干細胞的增殖；IL-Il單獨使用或與 其它細胞因子協同，對紅細胞生成的多個階段均有刺激作用；對髓系祖細胞的分化成熟及 B淋巴細胞的發育也有促進作用；IL-Il對巨核細胞和血小板生成的不同階段均有刺激作 用，不僅使巨核細胞集落數及大小增加，而且可提高外周血血小板的數量。此外，在不同動 物模型中還觀察到IL-Il對一些非造血組織也具有一定的生物學效應，例如在腦、脊神經 元、腸道及睪丸組織中能檢測到IL-Il的表達；調節腸上皮細胞的生長；抑制脂質形成；誘 導急性期反應蛋白的合成；刺激破骨細胞的發育以及神經祖細胞的增殖等。血小板對于在受傷部位維持止血和起始血凝塊的形成中的作用非常重要。在血小 板減少癥的患者中，無法形成血凝塊是最直接的后果，嚴重的血小板減少癥導致典型模式 的出血，重度胃腸道和中樞神經系統出血可能是致命的。如果血小板形成過程中的某一步 驟受干擾而導致無法形成血小板、血小板分布異常、血小板損壞增加和/或損耗增加，就會 表現為血小板減少癥。引起血小板減少癥的因素可分為先天性的和獲得性的，例如先天性 無巨核細胞增生；細胞毒性的化學藥物治療等。血小板減少癥是腫瘤放化療法的潛在致命性并發癥在IL-11的生物學活性中，最為突出和重要的是劑量依賴性升高外周血血小板的 數量，提示了 IL-11的重要的臨床價值，即可能是一種治療血小板減少癥的藥物。自IL-11 被發現后，美國Genetics Institute就開始了重組人IL-11 (rhIL-11)的研發工作，經過6 年多的臨床前和臨床研究，于1997年獲FDA批準上市，商品名為Neumega，用于治療腫瘤放 化療引起的血小板減少癥，替代血小板輸注。如本領域普通技術人員理解的，目前國內外多采用大腸桿菌(如中國專利 99112322. 0,99125600. X)和酵母(如中國專利200710162970. 1)表達系統來生產IL-11產 品。就表達系統本身而言，大腸桿菌和酵母表達系統各有其優缺點。然而，就無分子內/分 子間二硫鍵、無潛在糖基化位點的人IL-11而言，用酵母表達時會出現糖基化，糖基化程度 不易控制，同時，相對于大腸桿菌表達系統，酵母表達系統的發酵周期長，工藝難度大，成本 高，工藝穩定性差；用大腸桿菌表達，表達量高，利于純化。大腸桿菌表達系統因其表達量 高，工藝簡單，成本低廉，所以目前國內外大多采用大腸桿菌表達系統表達人IL-11。
發明內容
為了解決上述問題，本發明的目的在于提供了一種藥用重組人白細胞介素-11的 制備方法，本發明具有工藝簡單，表達量高，穩定性好，產品均一，生產成本低，環保，活性高 的特點，且提高藥品的安全性、可控性和有效性，適用于工業化生產。為達到上述的目的，本發明采用如下技術方案一種藥用重組人白細胞介素-11的制備方法，采用下述制備步驟1)對白細胞介素-ll(rhlL-ll)中融合蛋白的初步純化，包括菌體破碎和鰲合柱 分離步驟；2)含白細胞介素-ll(rhlL-ll)的融合蛋白的腸激酶(EK酶)酶切；3)白細胞介素-11 (rhIL-11)的精細純化，包括MacroCap SP柱層析和S-75柱層 析，得到藥用重組人白細胞介素-11。所述的步驟1)中鰲合柱分離步驟的洗脫條件采用50mMTris-Cl，285-325mM的咪 唑，吐溫80梯度洗脫。所述的步驟2)中腸激酶配方如下50mMTris-Cl，pH8. 0+500mMNaCl，體積百分比 含量為50%的甘油。所述的步驟2)中酶切采用的pH值為6-10的緩沖體系，體系中含有乙醇或DMS0 有機溶劑，且含有金屬離子作為激活劑。所述的pH值優選為7-9。所述的pH值更優選為8. 0。所述的金屬離子采用K+或Ca+。所述的K+濃度為5-8mM ；Ca+濃度為l_2mM。所述的乙醇的體積百分比含量為5-20%，DMS0的體積百分比含量為_15%。所述的乙醇含量優選為5-8%，DMS0含量優選為1_5%。本發明的有益效果是本發明采用了先進的鰲合柱洗脫條件，融合蛋白高壓破碎 后過金屬螯合柱后的一步純化就可獲得90%左右的純度。還有本發明采用了自制的高純度的重組腸激酶，腸激酶質量可控，無熱源和動物源蛋白污染，批次間重復性好。并且本發 明找到了優化的酶切條件，在pH8. 0時，含K2+在5-50mM或Ca2+l_2mM，乙醇5_8%或DMSO 1-5%條件下對IL-Il融合蛋白酶切得率可達80%以上。所以按本發明路線生產的IL-Il 的N端及C端完整，產品均一，活性高，環保，為產品的使用的安全性及有效性提供保障。
圖1是本發明重組人IL-Il金屬離子對融合蛋白酶切影響SDS-PAGE圖譜；圖2是本發明重組人IL-Il有機溶劑對融合蛋白酶切影響SDS-PAGE圖譜；圖3是本發明重組人IL-Il原液非還原SDS-PAGE圖譜；圖4是本發明重組人IL-Il原液還原SDS-PAGE圖譜；圖5是不本發明重組人IL-Il產品純度檢測(SEC-HPLC)圖譜。
具體實施例方式下面通過具體實施例，對本發明作進一步的描述。實施例1DrhIL-Il的初步純化a.菌體破碎菌體按 1 10(w/v)比例，用 50mM Tris+500mMNaCl，pH8. 0 緩沖液 重懸。少量時可采用超聲波破碎，大量時采用高壓破碎。采用100-900Psi壓力對懸浮于破 碎液的菌體進行了離心上清液的比較。結果表明200Psi有較高的收率和較高的純度。b.鰲合柱分離根據融合蛋白中存在MB殘基的特點，選用了 Chelating Sepharose FF作用初步純化的填料。采用IOOmM的咪唑洗去雜蛋白，目的蛋白洗脫條件采 用50mMTris-Cl，285-325mM的咪唑，吐溫80梯度洗脫，純化結果表明，該步純化一步純 化就能使目標融合蛋白的純度高達90%以上，達到了可用于酶切的目的要求。同時，也去除 了對EK酶的大量抑制物。2)含rhIL-11的融合蛋白的腸激酶酶切EK酶酶切采用高純度的重組EK酶，EK酶配方如下50mMTris_Cl， pH8. 0+500mMNaCl,50% (V/V)甘油。對酶切條件進行了研究，采用了 20°C的溫度防止融合 蛋白發生沉淀。a.通過對EK酶切的pH梯度條件摸索，在20°C條件下，采用50mM的Tris-Cl，pH5-9 的酶切體系進行酶切試驗，結果表明，在PH7-9的范圍內酶切效果比較理想，酶切最適pH為 8.0的體系。b.考察了該緩沖體系下各種金屬離子對酶切的影響試驗，其中K2+、Ca2+對酶活 性具有促進作用，Zn2+具有抑制作用。并考察了 K2+在5-200mM范圍內、Ca2+在l-30mM范 圍內濃度梯度對酶活性的影響，K2+在5-50mM，Ca2+l-2mM酶活性最好，然后對K2+、Ca2+對 融合蛋白酶切影響做SDS-PAGE，如圖1所示，圖1是本實施例重組人IL-Il金屬離子對融 合蛋白酶切影響 SDS-PAGE 圖譜，其中 Lanel-5 :K+濃度為 5mM，50mM，lOOmM，150mM，200mM ； Lane6-10Ca2+ 濃度為 ImM，2mM, IOmM, 20mM, 30mM ；Lane 11 control (未酶切對照)c.考察了有機溶劑對EK酶切的影響，對甲醇，乙醇，DMS0，正丙醇，乙腈，丙酮對酶 活性的影響。其中乙醇和DMSO對酶活力有意想不到的促進作用，甲醇對BEK的酶活力沒有影響，而正丙醇、乙腈、丙酮對BEK具有一定的抑制作用。然后對乙醇和DMS0對融合蛋白 酶切影響做SDS-PAGE，如圖2所示，圖2是本實施例重組人IL-11有機溶劑對融合蛋白酶 切影響SDS-PAGE圖譜，其中Lanel control (未酶切對照)，Lane2_6乙醇濃度為5%，8%， 10%, 15%,20% Lane7-11DMS0 濃度為 1 %，5%，8 %，20 %，15%，由圖可知，乙醇在 5-20% 范圍內，DMS01 % -15%范圍內對酶切均有促進作用，其中以乙醇5-8%，DMS0在1_5%具有 意想不到的效果。本實施例采用在20°C條件下，50mM的Tris_Cl，pH8的條件下進行酶切步驟，激活 劑采用5-8mM K2+或l_2mM Ca2+，有機溶劑采用5_8%乙醇，1-5% DMS0。3) :rhIL-ll 的精細純化(MacroCap SP 及 S-75 柱層析)利用rhIL-11有較高等電點的特點。在PH8. 0條件下過MacroCap SP柱，采用50mM PBNa，pH8. 0條件平衡MacroCap SP柱，上樣，洗脫條件采用450mM PBNa,pH8. 0的高鹽條件 洗脫目的蛋白，該步驟去除了絕大多數的雜蛋白，而使rh I L-11 一步得到了高效純化，采 用10mM PBNa,pH8. 0平衡的Superdex-75柱上樣并洗脫收集目標蛋白可以使純化產品-藥 用重組人白細胞介素-11的純度達到99%。如圖3，4，5所示，圖3為純化的rhIL-11蛋 白的非還原型SDS-PAGE電泳圖，上樣20ug蛋白，與上樣控制帶400ng(2)、200ng(l% )和 100ng(0. 5%)相比，無不可見的大于200ng(l% )的雜質，說明電泳純度大于99%；圖4為 純化蛋白的還原型SDS-PAGE電泳圖，上樣20ug蛋白，與上樣控制帶400ng (2)、200ng(l % ) 和100ng(0. 5%)相比，無不可見的大于200ng(l% )的雜質，說明電泳純度大于99%；圖5 為純化的rhIL-11蛋白的高效液相純度圖譜，積分統計結果見表1，表1中為高效液相純度 圖譜出現的4個峰的統計情況，其中RT為出峰的保留時間，Area為積分面積，% Area為各 峰的占總積分面積的百分比，Height為各峰的高度，從表1可以看出，表1為HPLC圖譜的 積分統計情況，保留時間為13. 17min出現的rhIL-11目的峰占總液相積分面積的99. 33%, 說明rhIL-11的HPLC純度大于99%。表 權利要求
一種藥用重組人白細胞介素 11的制備方法，其特征在于采用下述制備步驟1)對白細胞介素 11中融合蛋白的初步純化，包括菌體破碎和鰲合柱分離步驟；2)含白細胞介素 11的融合蛋白的腸激酶酶切；3)白細胞介素 11的精細純化，包括MacroCap SP柱層析和S 75柱層析，得到藥用重組人白細胞介素 11。
2.如權利要求1所述的一種藥用重組人白細胞介素-11的制備方法，其特征在于所 述的步驟2)中鰲合柱分離步驟的洗脫條件采用50mMTris-Cl，285-325mM的咪唑，吐溫 80梯度洗脫。
3.如權利要求1所述的一種藥用重組人白細胞介素-11的制備方法，其特征在于所 述的步驟3)中腸激酶配方如下50mMTris-Cl，pH8. 0+500mMNaCl，體積百分比含量50%的 甘油。
4.如權利要求1所述的一種藥用重組人白細胞介素-11的制備方法，其特征在于所 述的步驟3)中酶切采用pH值為6-10的緩沖體系，體系中含有乙醇或DMS0有機溶劑，且含 有金屬離子作為激活劑。
5.如權利要求4所述的一種藥用重組人白細胞介素-11的制備方法，其特征在于所 述的PH值為7-9。
6.如權利要求5所述的一種藥用重組人白細胞介素-11的制備方法，其特征在于所 述的pH值為8.0。
7.如權利要求4所述的一種藥用重組人白細胞介素-11的制備方法，其特征在于所 述的金屬離子采用K+或Ca+。
8.如權利要求7所述的一種藥用重組人白細胞介素-11的制備方法，其特征在于所 述的K+濃度為5-8mM ；Ca+濃度為l_2mM。
9.如權利要求4所述的一種藥用重組人白細胞介素-11的制備方法，其特征在于所 述的乙醇的體積百分比含量為5-20%，DMS0的體積百分比含量為-15%。
10.如權利要求9所述的一種藥用重組人白細胞介素-11的制備方法，其特征在于所 述的乙醇的體積百分比含量為5-8%，DMS0的體積百分比含量為1_5%。全文摘要
本發明公開了一種藥用重組人白細胞介素-11的制備方法，采用下述制備步驟1)對白細胞介素-11中融合蛋白的初步純化，包括菌體破碎和鰲合柱分離步驟；2)含白細胞介素-11的融合蛋白的腸激酶酶切；3)白細胞介素-11的精細純化，包括Macro Cap SP柱層析和Superdex-75柱層析，得到藥用重組人白細胞介素-11。本發明具有工藝簡單，表達量高，穩定性好，產品均一，生產成本低，環保，活性高的特點，且提高藥品的安全性、可控性和有效性，適用于工業化生產。
文檔編號C12P21/06GK101892279SQ20101020121
公開日2010年11月24日 申請日期2010年6月10日 優先權日2010年6月10日
發明者孫黎, 王世媛, 鄭建華, 鄭成已 申請人:廈門特寶生物工程股份有限公司