專利名稱：提高外源基因在植物體內表達水平的核苷酸序列的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，主要是一種提高外源基因在植物體內表達水平的核苷酸序列。
背景技術：
近來越來越多的研究表明，基因的3’ UTR可通過影響mRNA的穩定性調節基因表 達。已經有實驗證實，在mRNA3’UTR中存在降解相關元件，在影響mRNA穩定上起重要作用。 除此之外，3’UTR可以多種方式調控基因表達，如mRNA前體的加工過程及有效的poly (A)聚 合依賴于3’UTR中的加尾信號，而poly㈧尾巴與mRNA的穩定與翻譯密切相關；另外3’UTR 序列中包含的一些元件、序列可以調節mRNA的穩定性。富含AU區(AU_rich region, ARE) 是在3’ UTR中發現得較早的一個元件，通常被認為是一個導致mRNA穩定性下降的元件，并 且3’ UTR中ARE越多越不穩定。與此相反，轉鐵蛋白受體基因和鐵蛋白基因的3’ UTR中含 有IRE元件，在缺乏鐵離子的時候可以阻止mRNA降解。這些元件可能通過與其結合的RNA 結合蛋白影響mRNA的穩定性和正常的翻譯。鑒于3’UTR具有調節基因表達的特點，我們就 可以利用其特點來增加基因的穩定性，進而提高基因表達。
發明內容
本發明要解決上述現有技術的缺點，提供一種提高外源基因在植物體內表達水平 的核苷酸序列，本發明的序列能夠增加基因的轉錄產物提高基因表達。本發明解決其技術問題采用的技術方案這種提高外源基因在植物體內表達水平 的核苷酸序列，它是SEQ ID No :1所示的核苷酸序列，atttcttttt cttgtcaact ttattgcatt cattcatgataataattgtc ttagt。本發明提供一段核苷酸序列，將它連接到基因編碼區的下 游后再進行常規的外源基因在植物體內的表達過程，可提高外源基因表達水平1倍以上。1)序列的獲得以擬南芥總 DNA 為模板，用 Pl (ATTTCTTTTTCTTGTCAACT)禾口 P2 (ACTAAGACAATTATTATCATGAA)引物進行 PCR 反應。擴增體系如下10 X PCR buffer 5 μ 1， 15mM MgCl2IOy 1，IOmM dNTPs 2 μ 1，IOmM Pf 禾口 Pu 各 3 μ 1，Taq 酶(5U/μ 1) 1 μ 1，無菌水補 足50 μ 1。反應條件為95°C預變性3min ；93°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lm，35個循 環；72°C延伸IOmin。目的PCR產物大小約65bp，PCR產物經Qiagen凝膠純化試劑盒純化 后,利用 Promega T-vector 進行 PCR片段的 TA 克隆，條件如下2XPromega Iigasebuffer 5ul, T-vector Iul，PCR 回收片段 2ul，Promega T4_ligase lul，無菌水 lul，混勻后 4°C反 應16h。反應完畢后，取IOul反應液加入到含有IOOul大腸桿菌感受態細胞的離心管中，輕 輕混勻冰上放置30m后，42°C熱激90s，立即放置冰上2_3m，向離心管中加入LB液體培養基 890ul。將離心管放于37°C搖床上震動培養Ih后，取300ul培養液涂布于含有lOOmmol/L 氨芐青霉素、lmmol/L IPTG和10mg/L的固體LB培養基上，37°C培養14h。之后選擇白色的 菌斑送上海Invitrogen公司測序。含有插入序列的克隆命名為T-I。
2)序列的應用方法利用分子生物學實驗技術將獲得序列連到外源基因編碼區終止密碼子的下游，以融合片段作為一個整體進行常規的植物表達載體構建后進行外源基因在植物體內的表達， 即可提高外源基因在植物體內的表達水平。本發明有益的效果是本發明的序列，可提高外源基因在植物體內的表達水平。
圖1 本發明序列連接到GFP的末端后提高GFP在煙草葉片內的表達水平示意圖。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明實施例應用本發明提高GFP在煙草葉片內的表達水平①序列的克隆以擬南芥總 DNA 為模板，用 Pl (ATTTCTTTTTCTTGTCAACT)禾口 P2 (ACTAAGACAATTATTATCATGAA)引物進行 PCR 反應。擴增體系如下10 X PCR buffer 5 μ 1， 15mM MgC1210y 1, IOmM dNTPs 2μ 1, IOmM Pf 禾口 Pu 各 3 μ l，Taq 酶(5U/μ 1) 1 μ 1(購自大 連Takara公司)，無菌水補足50 μ 1。反應條件為95°C預變性3min ；93°C變性30s，55°C退 火30s，72°C延伸lm，35個循環；72°C延伸lOmin。目的PCR產物大小約65bp，PCR產物經 Qiagen凝膠純化試劑盒(德國Qiagen公司)純化后，利用Promega T-vector (美國Promega 公司)進行PCR片段的TA克隆，條件如下2XPromega ligase buffer 5ul,T-vector lul, PCR 回收片段 2ul，Promega T4_ligase lul (美國 Promega 公司)，無菌水 lul，混勻后 4°C 反應16h。反應完畢后，取IOul反應液加入到含有IOOul大腸桿菌感受態細胞的離心管中， 輕輕混勻冰上放置30m后，42°C熱激90s，立即放置冰上2_3m，向離心管中加入LB液體培養 基890ul。將離心管放于37°C搖床上震動培養Ih后，取300ul培養液涂布于含有IOOmmol/ L氨芐青霉素、lmmol/L IPTG和10mg/L的固體LB培養基上，37°C培養14h。之后選擇白色 的菌斑送上海Invitrogen公司測序。含有插入序列的克隆命名為T-I。②序列與GFP的融合根據測得的序列，設計引物P3 (ACAAACATGACGAACTCTAAATTTCTTTTTCTTGTCAACT) 和P4(GAGCTCACTAAGACAATTATTATCATGA，下劃線為SacI識別位點)，以T-I載體為模板進 行 PCR 反應。擴增體系如下10XPCR buffer 5 μ 1,15mM MgCl2IO μ 1，IOmM dNTPs 2μ 1, IOmM Pf和Pu各3μ l，Taq酶(5U/μ 1) 1 μ 1 (購自大連Takara公司)，無菌水補足50μ 1。 反應條件為95°C預變性3min ；93°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lm，35個循環；72°C延 伸lOmin。目的PCR產物大小約65bp，PCR產物(產物1)經Qiagen凝膠純化試劑盒(德 國Qiagen公司)純化。根據pBinGFP中的GFP序列和本發明序列設計引物P5 (GAATTCATG AAGACTAATCTTTTTCTCTTT，下劃線為 BamHI 識別位點)和 P6 (GTTGACAAGAAAAAGAAATTTAGAG TTCGTCATGTTTGT)，以pBinGFP質粒為模板擴增GFP序列。擴增體系如下10 X PCR buffer 5 μ 1,15mM MgCl2IOy 1, IOmM dNTPs 2 μ 1, IOmM Pf 禾口Pu各 3μ l，Taq 酶(5U/μ 1) 1 μ 1 (大 連Takara公司)，無菌水補足50 μ 1。反應條件為95°C預變性3min ；93°C變性30s，55°C退 火30s，72°C延伸lm，35個循環；72°C延伸IOmin。目的PCR產物大小約750bp，PCR產物(產物2)經Qiagen凝膠純化試劑盒(德國Qiagen公司)純化。將產物1和產物2稀釋100 倍后混合，以此為模板，用P4和P5為引物進行PCR反應。擴增體系如下10XPCR buffer 5 μ 1,15mM MgCl2IOy 1, IOmM dNTPs 2 μ 1, IOmM Pf 禾口Pu各 3μ l，Taq 酶(5U/μ 1) 1 μ 1 (大 連Takara公司)，無菌水補足50 μ 1。反應條件為95°C預變性3min ；93°C變性30s，55°C 退火30s，72°C延伸lm，35個循環；72°C延伸IOmin。PCR產物經Qiagen凝膠純化試劑盒純 化后，利用Promega T-vector (美國Promega公司)進行PCR片段的TA克隆，條件如下 2XPromega ligase buffer 5ul, T-vector Iul，PCR 回收片段 2ul，Promega T4-ligase Iul (美國Promega公司)，無菌水Iul，混勻后4°C反應16h。反應完畢后，取IOul反應液加 入到含有IOOul大腸桿菌感受態細胞的離心管中，輕輕混勻冰上放置30m后，42°C熱激90s， 立即放置冰上2-3m，向離心管中加入LB液體培養基890ul。將離心管放于37°C搖床上震 動培養Ih后，取300ul培養液涂布于含有100mmol/L氨芐青霉素、lmmol/L IPTG和IOmg/ L的固體LB培養基上，37°C培養14h。之后選擇白色的菌斑送上海Invitrogen公司測序。 測序正確的克隆命名為T-GFP-1。③融合GFP在煙草葉片內的表達將T-GFP-I中的融合片斷經BamHI和SacI酶切后連入同樣酶切的pCV1300中，構建pCVGFP-Ι載體；同時，利用同樣的方法構建只含有GFP序列、不含有本發明核苷酸序列的 PCVGFP載體。將兩個載體分別轉入農桿菌EHA105后，應用瞬時表達系統注射本氏煙草葉 片，3天后觀測煙草葉片GFP熒光變化，并通過real-time PCR檢測GFP表達情況，結果如圖 2所示。在表達有pCVGFP-Ι的區域，GFP熒光明顯較強，而在表達有pCVGFP的區域，GFP熒 光相對較弱(圖la)。real-time PCR的結果也表明，pCVGFP_l區域的GFP表達水平要高 出pCVGFP區域的GFP表達水平1倍以上(圖lb)。實施效果利用本發明序列，可提高實驗中GFP基因在植物體內的表達水平。 除上述實施例外，本發明還可以有其他實施方式。凡采用等同替換或等效變換形 成的技術方案，均落在本發明要求的保護范圍。
權利要求
一種提高外源基因在植物體內表達水平的核苷酸序列，其特征是它是SEQ ID No1所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發明涉及一種提高外源基因在植物體內表達水平的核苷酸序列，它是SEQ ID No1所示的核苷酸序列，本發明提供一段核苷酸序列，將它連接到基因編碼區的下游后再進行常規的外源基因在植物體內的表達過程，可提高外源基因表達水平1倍以上。本發明有益的效果是利用分子生物學實驗技術將本發明序列連到外源基因編碼區終止密碼子的下游，以融合片段作為一個整體進行常規的植物表達載體構建后進行外源基因在植物體內的表達，即可提高外源基因在植物體內的表達水平。
文檔編號C12N15/113GK101870973SQ201010201208
公開日2010年10月27日 申請日期2010年6月4日 優先權日2010年6月4日
發明者和瓊姬, 彭杰軍, 林林, 燕飛, 程曄, 鄭紅英, 陳劍平, 魯宇文 申請人:浙江省農業科學院