專利名稱：添加還原性糖促進生物合成1，3-丙二醇的方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物發酵法合成1，3-丙二醇的方法，特別是采用甘油為底物微生物發酵生產1，3-丙二醇的方法。
背景技術：
1，3_丙二醇(PDO)是一種重要的化工和醫藥中間體原料，可作為有機溶劑應用于油墨、印染、乳化劑、抗凍劑等。PDO最主要的用途，是合成新型聚酯高分子材料聚對苯二甲酸丙二酯(PTT)的單體。PTT是目前國際上公認的六大石化新產品之一。與聚對苯二甲酸乙二酯(PET)、聚對苯二甲酸丁二酯(PBT)和尼龍等比較，PTT具有良好的印染特性、富有彈性、抗紫外線、靜電性能好、可生物降解并再生利用等多種優良特性，因此PTT在紡織服裝業、地毯裝飾業、工程塑料等眾多領域有著十分廣闊的應用前景。據估計，目前僅我國每年就需求PDO上百萬噸，而且在未來十年我國對PDO的需求量還將繼續增大。PTT生產的關鍵在于單體原料PDO的來源，其生產成本直接影響著PTT的工業化生產和應用規模。1，3_丙二醇的生產方法主要有化學合成法和微生物發酵法。化學合成法目前僅有國外DuPont和Siell公司以及國內的少數幾家單位在進行小規模工業化生產。技術路線分別是德國Degussa公司的丙烯醛合成法專利技術和Siell公司開發的環氧乙烷合成法， 并用于聚合生產PTT。為了壟斷市場，這兩家跨國公司不對外銷售用于PTT生產的PD0，而只向客戶銷售PTT切片及其下游產品。同時，化學合成法存在設備投資大、工藝要求嚴格、 操作條件苛刻、有毒副產物多、產品提取難度大、三廢處理成本高以及生產原料依賴于不可再生的石油資源等問題，導致PTT材料及其原料產品PDO的價格一直居高不下，制約其進一步的發展。而微生物發酵法生產PD0，以可再生資源——碳水化合物為原料，具有操作簡便、反應條件相對溫和、副產物少、污染少且容易處理以及成本低廉等優點，引起了國內外相關企業和研究單位的高度重視，將具有廣泛的應用前景和開發潛力。隨著近年生物能源產業的蓬勃發展，導致其最大副產物甘油的價格急劇下降，因此利用甘油為原料生物合成1，3_丙二醇的方法逐漸成為研究的重點。目前利用甘油轉化成1，3_丙二醇的微生物主要為兼性厭氧微生物，可以采用厭氧條件，也可以采用微氧條件。其中，肺炎克雷伯氏桿菌、費氏檸檬酸菌和丁酸梭狀芽孢桿菌是轉化率較高的三種菌， 對底物和產物也具備良好的耐受性。以肺炎克雷伯氏桿菌為例，1,3-丙二醇的生物合成途徑主要分為氧化和還原途徑。氧化途徑主要包括以下步驟①甘油經甘油脫氫酶(⑶H)催化，生成2-羥基丙酮(DHA)，此酶為厭氧酶，以NAD+為輔酶；②DHA在ATP及2-羥基丙酮激酶的作用下，生成磷酸二羥基丙酮OHAP)；③DHAP進一步代謝生成丙酮酸，然后通過乙酰CoA進入三羧酸循環或生成其它小分子醇、酸等代謝產物。氧化途徑生成生物能ATP和還原當量NADH2,并伴隨著微生物細胞的生長。還原途徑主要有2步酶反應①甘油脫水酶 (GDHt)在輔酶B12存在下將甘油轉化為中間產物3-羥基丙醛(3-HPA)；②在NADH2#在下， 3-HPA在1，3_丙二醇氧化還原酶(PDOR)催化下生成1，3-丙二醇。還原途徑消耗氧化途徑生成的過量NADH2,使微生物細胞內的還原物質達到平衡。如CN01117^2. 7公開了一種微生物微氧發酵生產1，3_丙二醇的方法，CN01138769.6公開了一種好氧發酵生產甘油、厭氧發酵生產1，3-丙二醇的方法等。在發酵底物中添加某種物質，以促進生產1，3-丙二醇的發酵過程在本領域中進行了較多的研究，如“現代化工” 2002,22(6) :32-35頁張健等介紹了一種采用添加葡萄糖作為輔低物在厭氧條件下發酵生產1，3丙二醇；CN1446919A公開了一種采用外加維生素C 或維生素E促進1，3-丙二醇的生產；CN200510011917.2公開了一種添加反丁烯二酸促進微生物合成1，3-丙二醇的方法；CN20081002^43. 0公開了一種向發酵液中添加能改善細胞通透性的抗生素，增加發酵產率的方法。不同的添加物質對微生物發酵過程均具有一定的促進作用，但微生物發酵過程的產物濃度、生長周期長和甘油轉化率等方面均可以進一步提尚。
發明內容
針對現有技術的不足，本發明提供一種合成1，3-丙二醇的方法，本發明方法具有操作簡單，提高1，3-丙二醇的合成濃度和底物轉化率，降低發酵成本，提高經濟效益等優
點ο本發明添加還原性糖促進生物合成1，3_丙二醇的方法包括如下內容制備用于 1，3-丙二醇的發酵培養基，以甘油為發酵底物，在發酵培養基中接入肺炎克雷伯氏桿菌種子培養液，進行厭氧或微氧發酵合成1，3_丙二醇，在發酵過程中，引入在發酵體系濃度為 1 50g/L優選為4 20g/L的還原性糖，還原性糖為木糖、甘露糖和鼠李糖中的一種或幾種。本發明方法中，微生物發酵過程引入的還原性糖可以在發酵培養基中一次引入， 優選在發酵培養基中和發酵過程中分別引入，最優選在發酵進行1 15小時后引入發酵體系中。本發明方法中，可以在發酵培養基中加入少量葡萄糖，以促進微生物菌體的生長， 葡萄糖的加入量為在發酵培養基中的濃度為1 10g/L。本發明方法中，微生物發酵過程的條件和方法可以采用本領域常規的方法，如采用補料發酵方式或連續發酵方式等，優選為補料發酵方式，發酵條件為厭氧發酵條件或微氧發酵條件(空氣0. 25 0. 5vvm)，發酵溫度為35°C 37°C，在攪拌條件下進行發酵。發酵培養基中含有微生物發酵過程所需的營養物質，如N、P、K、Mg、Fe、Co等，同時在發酵過程中可以根據需要補充微生物營養物質。發酵過程優選控制發酵液中甘油濃度維持在20g/ L 2^/L。 研究表明，在以甘油為底物，采用肺炎克雷伯氏桿菌發酵生產1，3-丙二醇的過程中，引入葡萄糖可以促進菌體生長，但菌體生長過程本身對生產1，3_丙二醇沒有明顯的促進作用，菌體代謝葡萄糖的過程構成了對甘油代謝過程的抑制，葡萄糖對發酵的促進作用主要貢獻在于提高了菌體數量，減少了甘油的消耗。而對于木糖、甘露糖和鼠李糖等還原性糖來說，對肺炎克雷伯氏桿菌生長的促進作用沒有葡萄糖的效果好，而且，濃度一定濃度的還原性糖對肺炎克雷伯氏桿菌的生長還有抑制作用。但經過深入研究表明，木糖、甘露糖和鼠李糖等還原性糖在肺炎克雷伯氏桿菌代謝途徑產生并積累了大量還原當量，利用更多的還原當量來加速甘油還原途徑的進行，進一步促進了 1，3_丙二醇的生物合成，提高了1，3_丙二醇的合成濃度和轉化率，這是在甘油發酵底物中加入葡萄糖所不具有的功能的效果。也就是說，在1，3_丙二醇生產過程中，木糖、甘露糖和鼠李糖的代謝途徑與甘油的代謝途徑相互促進，產生了綜合的技術效果。由于上述還原性糖的代謝過程與甘油的代謝過程相互促進，同時由于上述還原性糖的價格較高，因此優選在發酵過程的初期或發酵培養基中不加或少加上述還原性糖，以減少在菌體快速生長期對還原性糖的過多消耗，可以減少生產成本，同時充分發揮還原性糖代謝途徑與甘油代謝途徑結合的優勢。因為葡萄糖的價格低廉，因此在菌體快速生長期可以適量添加葡萄糖，供菌體生長，將葡萄糖和上述還原性糖的各自功能有機結合，在促進 1，3_丙二醇生產的同時，可以有效降低生產成本。
具體實施例方式下面通過具體實施例進一步說明本發明的方案和效果。實施例1添加木糖增加還原當量于搖瓶中發酵菌種肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiella pneumoiae)由撫順石油化工研究院篩選，保藏于中國微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，編號為0798。LB固體培養基每升體積培養基含有蛋白胨10. Og/L，酵母膏5. Og/L, NaCl 10. Og/L, pH 7. 0。種子培養基酵母膏5.(^/1，麥芽糖3.(^/1，蛋白胨5.(^/1，妝(1 5. Og/L, pH 7. 0。發酵培養基酵母膏5. 0g/L, K2HPO4 · 3H20 10g/L，KH2PO4 2g/L，NH4Cl lg/L，NaCl 0. 5g/L, MgSO4 · 7H20 0. lg/L, FeCl3 · 6H20 30mg/L, CoCl2 · 6H205mg/L, VitaminB12 (維生素 B12) 5mg/L, glycerol (甘油)30g/L，pH 7.0，還原性糖(木糖、甘露糖、鼠李糖等)濃度為 0 20g/L。發酵過程步驟1:菌種活化由菌種保藏的甘油管中挑取一環Klebsiella pneumonia接入LB液體培養基活化 12h后，再挑取一環菌苔接入固體LB平板，37°C培養1 后置4°C冰箱保藏。步驟2:種子培養種子在250mL三角瓶中進行，裝液量為IOOmL,從步驟1的LB固體平板上挑取一單菌落于預先滅菌多的裝有IOOmL種子培養基的250mL三角瓶中，37°C，140rpm，培養10h，使菌體OD6tltl達到2 4左右。步驟3 在250mL搖瓶內微氧發酵合成1，3_丙二醇在裝有發酵培養基IOOmL(木糖含量為8g/L)的250mL的搖瓶中，菌種接種量為 2% (體積丨力了！^仙印！！！，培養時間〗。!!。所有搖瓶均為窄口瓶，塞子為橡皮塞。中間每隔證取樣，每次取樣體積為4mL，測定的項目有菌體濃度、底物甘油濃度、1，3-丙二醇的合成濃度及其他主要副產物的濃度。本發酵周期30h，共進行三組發酵實驗木糖添加組、葡萄糖添加組、空白組。甘油初始濃度均為30g/L。實驗序號1為僅使用甘油為發酵底物的對比實驗。實驗序號2為使用甘油和葡萄糖為發酵底物的對比實驗，其中葡萄糖濃度為Sg/L0實驗序號3為使用甘油和木糖為發酵底物的實驗，其中木糖濃度為8g/L。實驗序號4以甘油為起始發酵底物的實驗，發酵進行5小時后，加入占發酵底物濃度4g/L的木糖。實驗序號5為甘油和葡萄糖為起始發酵底物的實驗，其中葡萄糖濃度為3g/L，發酵進行6小時后加入占發酵底物濃度為3g/L的木糖。實驗序號6為甘油和葡萄糖為起始發酵底物的實驗，其中葡萄糖濃度為2g/L，發酵進行6小時后加入占發酵底物濃度為2g/L的木糖，發酵再進行6小時后加入占發酵底物濃度為2g/L的木糖。表1實施例1實驗結果
權利要求
1.一種添加還原性糖促進生物合成1，3-丙二醇的方法，包括如下內容制備用于1， 3-丙二醇的發酵培養基，以甘油為發酵底物，在發酵培養基中接入肺炎克雷伯氏桿菌種子培養液，進行厭氧發酵或微氧發酵合成1，3_丙二醇，其特征在于在發酵過程中，引入在發酵體系濃度為1 50g/L的還原性糖，還原性糖為木糖、甘露糖和鼠李糖中的一種或幾種。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于還原性糖在發酵體系中的濃度為4 20g/L。
3.按照權利要求1所述的方法，其特征在于微生物發酵過程引入的還原性糖在發酵培養基中一次引入，或者在發酵培養基中和發酵過程中分別引入。
4.按照權利要求1所述的方法，其特征在于微生物發酵過程引入的還原性糖為在發酵進行1 15小時后引入發酵體系中。
5.按照權利要求1、3或4所述的方法，其特征在于在發酵培養基中加入少量葡萄糖， 以促進微生物菌體的生長，葡萄糖的加入量為在發酵培養基中的濃度為1 10g/L。
6.按照權利要求1所述的方法，其特征在于微生物發酵過程采用補料發酵方式或連續發酵方式，發酵條件為厭氧發酵條件或微氧發酵條件，發酵溫度為35°C 37°C。
7.按照權利要求1或6所述的方法，其特征在于微氧發酵時空氣通入量為0.25vvm 0. 5vvm0
全文摘要
本發明涉及一種添加還原性糖促進生物合成1，3-丙二醇的方法，包括如下內容制備用于1，3-丙二醇的發酵培養基，以甘油為發酵底物，在發酵培養基中接入肺炎克雷伯氏桿菌種子培養液，進行厭氧發酵或微氧發酵合成1，3-丙二醇，在發酵過程中，引入在發酵體系濃度為1～50g/L的還原性糖。本發明根據木糖、甘露糖和鼠李糖等在菌體內的代謝途徑產生大量還原當量的特點，利用了更多的還原當量的存在能促進1，3-丙二醇生物合成的原理，在發酵培養基中加入適量還原性糖，增加還原當量，提高1，3-丙二醇的合成濃度和轉化率。本發明操作簡單，提高了生物利用率，降低了發酵成本，適合工業化生產。
文檔編號C12R1/22GK102311979SQ20101022200
公開日2012年1月11日 申請日期2010年7月7日 優先權日2010年7月7日
發明者師文靜, 李曉姝, 王崇輝, 王領民, 金平 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院