專利名稱：一種無需提取動物組織dna的直接pcr方法
技術領域：
本發明涉及動物分子生物學領域，具體涉及利用特定的組織裂解液對動物組織包括耳組織、血液或毛發進行快速消化，然后直接用少量的該消化液作為模板，實現PCR擴
背景技術：
基因組DNA的制備對完成PCR擴增是必不可少的，在動物遺傳育種中，PCR擴增是進行基因多態性分析、微衛星分析、基因克隆和測序等研究工作的基礎。目前，經常用于DNA 提取的動物組織包括耳組織、血液及毛。通常，動物組織樣品DNA的提取采用的是傳統的酚_氯仿抽提法，但該方法存在步驟繁瑣、耗時、耗試劑及安全性差等缺點。如果用該方法大量提取動物組織樣品時，上述的缺點將更加突出。一些在此基礎改進的方法已有報道，同時也有很多商業化的DNA提取試劑盒，但這些改進的方法及商業試劑盒存在一個共性提取過程仍需要組織樣品的裂解、DNA的乙醇或異丙醇沉淀和70%乙醇清洗DNA這三步，因此在提取大量動物組織樣品的DNA時，也同樣表現出耗時及費用高的缺點。此外，有報道用整個果蠅的胚胎、幼蟲及成蟲直接作為模板進行PCR擴增。但用整個動物組織如耳組織、毛囊直接作為模板進行PCR擴增是行不通的。
發明內容
本發明的目的是提供一種無需提取動物組織DNA的直接PCR方法，此方法可以同時處理大量動物組織樣品，實現高通量的以PCR擴增為基礎的分子操作，快速簡化操作步驟，節省成本。本發明提供一種無需提取動物組織DNA的直接PCR方法，其中PCR擴增所用的模板為動物組織經組織裂解液消化后的消化液。所述PCR反應按如下步驟進行將動物組織與組織裂解液混合，37 55 °C溫育25 30min，優選為55 °C溫育 30min，95°C變性 5min，取 2μ 1 作模板；PCR 反應體系終濃度為 250μΜ 的 dNTP，10mMTris-Cl，pH8. 3，50mM KCl, 1. 5mM MgCl2, 2ρΜ上游引物，2ρΜ下游引物，2 μ 1組織消化液，IU Taq DNA聚合酶，用ddH20補足至 20μ 1 ；PCR 反應條件94°C預變性 4min，94°C變性 30s，61°C復性 30s，72°C延伸 20 40s， 40個循環，然后72°C延伸7min，最后16°C保溫。所述的動物組織選自耳組織、血液或毛發，所述的毛發帶有毛囊。所述組織裂解液由Tris-Cl、EDTA、蛋白酶K和NaCl組成。所述Tris-Cl的濃度為IOmM IOOmM,優選10mM，pH8. 0 ；所述的EDTA濃度為1 4mM，優選為2mM，pH8. 0，所述的蛋白酶K的濃度為100ug/ml 200ug/ml，優選為200 μ g/ ml ；所述的NaCl的濃度為O 0. 8M，優選為0. 2M。
本發明提供的無需提取動物組織DNA的直接PCR方法，和目前存在的方法和試劑盒相比，該方法簡單、快速和節約成本。使用該方法，僅需一步處理動物組織樣品，然后直接取2 μ 1處理液為模板完成PCR擴增。此外，該方法特別適用于小組織樣品如一根動物毛， 因為用目前存在的方法和試劑盒，至少需要5 6根動物毛才能完成DNA的提取。該方法從樣品處理到PCR擴增都在PCR儀上完成，在動物中可以實現高通量的以PCR擴增為基礎的分子操作如基因分型、微衛星分析、親子鑒定及基因的克隆和測序。
圖1所示為不同裂解液處理豬耳組織后直接PCR法擴增的產物。圖中，1、2、3、4分別表示用裂解液1、裂解液2、裂解液3、裂解液4處理豬耳組織后直接PCR法擴增的產物。5 表示沒有經任何裂解液處理，直接用耳組織作模板PCR擴增的產物。圖2所示為裂解液中不同EDTA濃度對PCR擴增效率的影響。圖3所示為裂解液中不同EDTA濃度的PCR電泳圖。圖4所示為裂解液中不同NaCl濃度對PCR擴增效率的影響。圖5所示為馬毛、雞血、及豬耳組織經優化的組織裂解液處理后直接PCR擴增結果。圖中1、3和5表示馬毛、雞血及豬耳組織經優化組織裂解液處理后直接PCR擴增的結果；2、4和6表示用傳統酚-氯仿抽提法從馬毛、雞血及豬耳組織提取的DNA為模板PCR擴增的結果。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例1配置四種不同的組織裂解液裂解液1 :10mM Tris-Cl pH8. 0, ImM EDTA ρΗ8· 0，200 μ g/ml 蛋白酶 K ；裂解液2: IOmM Tris-Cl pH8. 0, ImM EDTA ρΗ8· 0，200 μ g/ml 蛋白酶K，0. 1 % SDS ；裂解液3:10mM Tris-Cl pH8. 0, ImM EDTA ρΗ8· 0，200 μ g/ml 蛋白酶 K，0. OlM NaCl ；裂解液4:10mMTris-Cl pH8. 0, ImM EDTA ρΗ8· 0，200 μ g/ml 蛋白酶K，0· 1 % SDS， 0.OlM NaCl ；取0. Olg的耳組織，放入一個干凈的200 μ 1 PCR管，充分剪碎，然后分別取上述4 種不同的裂解液50 μ 1，先用55°C溫育30min，然后再95°C變性5min讓蛋白酶K失活，最后直接取2μ1 4種不同的消化液作為模板，以未經任何裂解液處理的耳組織為對照，進行 PCR擴增，擴增豬myhc nb基因片段。PCR 反應體系終濃度為 250 μ M dNTP, IOmMTris-Cl, ρΗ8· 3，50mM KCl，1. 5mM MgCl2, 2pM上游引物，2pM下游引物，2 μ 1組織消化液，IU Taq DNA聚合酶，用ddH20補足至 20 μ 1。PCR 擴增的上游引物為 Pl :5，GGGGATTTGGGTTTTGGTTA 3，；下游弓丨物 Ρ2 5，CAGACGATCTACGGCAGTCA 3，。PCR 擴增條件94°C預變性 4min，94°C變性 30s，61°C 復性 30s，72°C延伸40s，40個循環，然后72°C延伸7min，最后16°C保溫。擴增結束后，取5 μ 1擴增產物進行瓊脂糖膠分析。結果發現，組織裂解液1和3 處理組在電泳分析時有明顯的PCR產物(圖1中，1和3泳道)，而組織裂解液2和4 (含有 0. 1 % SDS)處理組，檢測不到PCR產物(圖1中，2和4泳道)，泳道5也未擴增出PCR產物。 說明耳組織未經任何處理不能直接作為PCR的模板，SDS不適宜作為組織裂解液的成分。實施例2裂解液IOmMTris-Cl ρΗ8. 0, ImM EDTA ρΗ8· 0，100 μ g/ml 蛋白酶 K，0. OlM NaCl取0. Olg的耳組織，放入一個干凈的200 μ 1 PCR管，充分剪碎，然后取上述的裂解液50 μ 1，先用37°C溫育25min，然后再95°C變性5min讓蛋白酶K失活，最后直接取2μ 1 消化液作為模板，以未經任何裂解液處理的耳組織為對照，進行PCR擴增，擴增豬myhc IIb 基因片段。PCR反應體系和反應條件同實施例1。擴增結束后，取5 μ 1擴增產物進行瓊脂糖膠分析。結果發現，經裂解液消化的耳組織能擴增出700bp左右的片段，而未經消化耳組織不能擴增出條帶。實施例3對裂解液1 =IOmM Tris-Cl,pH8. 0, ImM EDTA，ρΗ8· 0，200 μ g/ml 蛋白酶K 中的EDTA 濃度進行優化，設置1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20mM 11個不同濃度。耳組織的處理方式和PCR反應體系和條件同實施例1。每個濃度做三個處理，每個處理做三個重復的PCR擴增，擴增豬myhc IIb基因片段。PCR產物經瓊脂糖凝膠檢測后發現，6mM濃度以后已經檢測不到條帶(圖2)。前3個濃度的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳純化，純化產物經NanoDrop 2000 (NanoDropTechnologies, Wilmington, DE, USA)測定。結果表明，2mM EDTA 是最佳濃度(圖3)。實施例4在優化后的組織裂解液1 :10mM Tris-Cl pH8. 0，2mM EDTApH8. 0，200ug/ml 蛋白酶 K 的基礎上，對 NaCl 的濃度進行了優化。設置 0. 01,0. 02,0. 04,0. 06,0. 08,0. 1,0. 2,0. 4、 0.6,0. 8M 10個濃度。耳組織的處理方式、PCR反應體系和條件同實施例1。每個濃度做三個處理，每個處理做三個重復的PCR擴增，擴增豬myhc IIb基因片段。所有PCR產物經瓊月旨糖凝膠電泳純化，純化產物經 NanoDrop2000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)測定。結果表明，0. 2M是組織裂解液中NaCl的最佳濃度(圖4)。實施例5取一根有明顯毛囊的馬毛放入一個干凈的PCR管，然后取5μ 1優化的組織裂解液(IOmM Tris-Cl (ρΗ8. 0), 2mM EDTA(pH8. 0)，0. 2MNaCl，200 μ g/ml 蛋白酶 K)完全浸沒毛囊，再去除毛囊上部大部的毛組織，55 °C溫育30min，95°C變性5min，然后取2μ 1該組織裂解液直接作為模板進行PCR擴增，擴增馬線粒體上的D-Ioop區。上游引物Ρ3 5，CTAGCTCCACCATCAAC ACC3，，下游引物 Ρ4 :5，ATGGCCCTGAAGAAAGAACC3，。PCR反應體系同實施例1。
PCR 擴增條件941預變性41^11，941變性308，601復性308，721延伸308，40個循環，然后72°C延伸7min，最后16°C保溫。結果表明，馬毛經優化的組織裂解液處理后直接PCR擴增的效果(圖5中第1泳道)同用酚-氯仿抽提法提取馬毛的DNA為模板的PCR擴增的效果一致(圖5中第2泳道)。實施例6取2 μ 1雞血放入一個干凈的200 μ 1 PCR管，然后用48 μ 1優化的組織裂解液 (IOmM Tris-Cl, pH8. 0,2mM EDTA, ρΗ8·0，0·2Μ NaCl，200 μ g/ml 蛋白酶 K)與之充分混勻，55°C溫育30min，95°C變性5min，然后取2μ 1該組織裂解液直接作為模板進行PCR擴增，擴增雞cyt3A80基因片段。上游引物P5:5' TGCCTGGTTGCTTATGTC 3'，下游引物P6: 5' GCTAACTGGGAATTGCTG 3'。PCR的反應體系同實施例1PCR 擴增條件941預變性％^11，941變性308，611復性308，721延伸208，40個循環，然后72 °C延伸7分鐘，最后16 °C保溫。結果表明，雞血經優化的組織裂解液處理后直接PCR擴增的效果(圖5中第3泳道)同用酚-氯仿抽提法提取雞血的DNA為模板的PCR擴增的效果一致(圖5中第4泳道)。實施例7取0. Olg的耳組織，放入一個干凈的200 μ 1 PCR管，充分剪碎，然后取50 μ 1優化的組織裂解液(IOmM Tris-Cl,pH8. 0,2mM EDTA，pH8. 0,0. 2M NaCl,200y g/ml 蛋白酶K)與之混勻，55°C溫育30min，95°C變性5min，然后取2 μ 1該組織裂解液直接作為模板進行PCR 擴增，擴增豬myhc IIb基因片段。上游引物Pl :5，GGGGATTTGGGTTTTGGTTA 3，，下游引物 P2 5' CAGACGATCTACGGCAGTCA 3’。PCR反應體系同實施例1PCR 擴增條件941預變性％^11，941變性308，611復性308，721延伸408，40個循環，然后72 °C延伸7分鐘，最后16 °C保溫。結果表明，豬耳組織經優化的組織裂解液處理后直接PCR擴增的效果(圖5中第 5泳道)同用酚-氯仿抽提法提取豬耳組織DNA為模板的PCR擴增的效果一致(圖5中第 6泳道)。序列說明SEQ ID NO. 1 6 分別是引物 PI、P2、P3、P4、P5 和 P6。
權利要求
1.一種無需提取動物組織DNA的直接PCR方法，其特征在于，以動物組織消化液為模板直接進行PCR擴增。
2.根據權利要求1所述的PCR方法，其特征在于，所述動物組織消化液按如下步驟獲得將動物組織與組織裂解液混合，37 55°C溫育25 30min，95°C變性5min。
3.根據權利要求2所述的PCR方法，其特征在于，所述動物組織消化液按如下步驟獲得動物組織與組織裂解液混合，55°C溫育30min，95°C變性5min。
4.根據權利要求1、2或3所述的PCR方法，其特征在于，所述組織裂解液由Tris-Cl、 EDTA,蛋白酶K和NaCl組成。
5.根據權利要求4所述的PCR方法，其特征在于，所述Tris-Cl的濃度為10 lOOmM， pH8. 0，所述的EDTA濃度為1 4mM，pH8. 0，所述的蛋白酶K的濃度為100 200 μ g/ml，所述的NaCl的濃度為0 0. 8M。
6.根據權利要求5所述的PCR方法，其特征在于，所述的Tris-Cl的濃度為10mM，所述的EDTA濃度為2mM，所述的蛋白酶K的濃度為200 μ g/ml，所述的NaCl濃度為0. 2M。
7.根據權利要求1所述的PCR方法，其特征在于，所述的動物組織選自耳組織、血液或毛發。
8.根據權利要求7所述的PCR方法，其特征在于，所述的毛發帶有毛囊。
9.根據權利要求1所述的PCR方法，其特征在于，所述的PCR的反應體系如下終濃度為 250 μ M dNTP, IOmMTris-Cl,pH8. 3,50mM KCl，1. 5mMMgCl2，2pM 上游引物，2pM 下游引物，2 μ 1組織消化液，IU Taq DNA聚合酶，用ddH20補足至20 μ 1。
10.根據權利要求1所述的PCR方法，其特征在于，所述PCR的反應條件如下94°C預變性％iin，94°C變性30s，61°C復性30s，72°C延伸20 40s，40個循環，然后 72°C延伸7min，最后16°C保溫。
全文摘要
本發明涉及一種無需提取動物組織DNA的直接PCR的方法，該方法通過將動物組織用組織裂解液進行消化，以消化液為模板直接進行PCR擴增。所用組織裂解液由Tris-Cl、EDTA、蛋白酶K和NaCl組成。與目前常用的方法相比，該方法可以同時處理大量動物組織樣品，實現高通量的以PCR擴增為基礎的分子操作，快速簡化操作步驟，節省成本。
文檔編號C12Q1/68GK102344919SQ201010245529
公開日2012年2月8日 申請日期2010年8月4日 優先權日2010年8月4日
發明者吳常信, 徐海岳, 李紅偉, 趙春江 申請人:中國農業大學