預防鴨病毒性肝炎的滅活疫苗及其制備方法

專利名稱：預防鴨病毒性肝炎的滅活疫苗及其制備方法
技術領域：
本發明屬于獸醫生物制品技術領域，具體涉及預防鴨病毒性肝炎的滅活疫苗(細 胞苗)及其制備方法。
背景技術：
我國是世界上第一水禽生產大國，具有得天獨厚的水域、地理資源優勢。養鴨業是 我國水禽養殖業的重要組成部分，在我國的農業經濟中占有著非常重要的地位，然而鴨病 的肆虐不但制約著我國養殖業向規模化、集約化方向的邁進，而且影響著我國禽類產品的 進出口等國際化多邊貿易的發展，同時會給國家和地區帶來巨大的社會、經濟和人類生命 財產損失。鴨病毒性肝炎是鴨群的常見疾病，對雛鴨有著較大的危害。鴨病毒性肝炎的防 控直接影響著我國養鴨業的發展，一直以來都是我國畜牧業生產所關注的重中之重。鴨病毒性肝炎(Duck virus hepatitis, DVH)是由鴨甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV)引起的一種雛鴨的急性高度致死性傳染病，主要侵害4周以 內的雛鴨，特別是1周以下的雛鴨最易感染，死亡率較高。鴨病毒性肝炎為小RNA病毒科 Avihepatovirus病毒屬，無囊膜不分節段的正鏈RNA病毒，無血凝性，對酸、熱有較強抵抗 力。該病毒RNA全長7729 7799，只有一個開放閱讀框，翻譯產生一個含2254aa的多 聚蛋白。因DHAV抗原性差異，DHAV可分為三個基因型，分別為DHAV-1，DHAV-2 (Taiwan) 和DHAV-3 (Korea)，三個亞型之間無血清學交叉反應，目前在我國流行的主要為DHAV-I和 DHAV-2。目前鴨病毒性肝炎在世界多數養鴨國家均有發生和流行，我國許多養鴨的省市均 有該病的流行。對鴨病毒性肝炎的防控中，目前疫苗己研制成三種氫氧化鋁DHV雞胚化弱 毒苗(組織苗)、氫氧化鋁DHV雞胚化弱毒滅活苗(組織苗)及氫氧化鋁DHV雞胚化強毒滅 活苗(組織苗)。從病原入手，進一步研究分子致病機理和病毒變異機理，開發相應疫苗是 防控該病的關鍵。

發明內容
本發明的目的是提供一種預防鴨病毒性肝炎的滅活疫苗及其制備方法。本發明提供了鴨甲型肝炎病毒1 型(Duck hepatitis A virus type 1)DHAV-SD 株，CGMCC No. 3746。鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株CGMCC No. 3746是2009年4月，劉 文軍、周遠成在山東省濰坊市鴨場的發病鴨體內分離獲得的一株鴨病毒性肝炎I型病毒 (DHAV-I)，已于2010年4月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏號為CGMCCNo. 3746。鴨甲型肝炎病毒1型又稱鴨肝炎病毒1型。本發明保護鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株CGMCC No. 3746在制備1型鴨病毒性 肝炎疫苗(細胞苗)中的應用。本發明還保護將鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株CGMCC No. 3746滅活得到的1型
3鴨病毒性肝炎疫苗(細胞苗)。本發明還保護一種制備DHAV-SD株病毒液的方法，包括如下步驟將鴨甲型肝炎 病毒1型DHAV-SD株CGMCC No. 3746在宿主細胞中進行培養后破碎細胞，得到的上清即為 病毒液；所述宿主細胞為BHK21細胞或DF-I細胞。所述將鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株CGMCC No. 3746在宿主細胞中進行培養后 破碎細胞，收集上清液的方法可包括如下步驟①將鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株CGMCC No. 3746接種所述宿主細胞，進行培 養后通過凍融破碎細胞，收取上清，即為生產用種毒；②將生產用種毒接種所述宿主細胞， 進行培養后通過凍融破碎細胞，收取上清，即為制苗用種毒；③將制苗用種毒接種所述宿主 細胞，進行培養后通過凍融破碎細胞，收集上清液。所述步驟①、步驟②和步驟③中接種所述宿主細胞時MOI均可為0. 001，培養時 間均可為48 72小時；所述步驟①、步驟②和步驟③中培養時間優選為48小時；所述步 驟③中，可通過5000rpm (Thermo legend RT離心機，角轉子#3332)離心30 40min收集
上清液。所述宿主細胞為BHK21細胞時，在所述接種前可先進行如下擴增培養(1)將凍存的BHK21細胞37°C水浴融化，800rpm離心5min，取沉淀；用細胞培養液 懸浮沉淀，得到2X IO5細胞/ml的細胞懸液，37°C,5% CO2靜置培養至每毫升含有1 X IO6細 胞；(2)在步驟(1)的基礎上消化細胞，然后重懸于細胞培養液中，使每毫升含有2 X IO5細 胞，然后在如下條件下培養至每毫升含有IXlO6細胞pH7.4，溶解氧飽和度為50%、37°C， 100轉/min(Wheaton公司Micro-stir 磁力攪拌器，攪拌器貨號356907 ；攪拌桿貨號 356886)。所述細胞培養液具體可為95體積份的DMEM和5體積份的胎牛血清混合，加入雙 抗(青霉素100U/ml，鏈霉素100U/ml)。本發明還保護一種制備1型鴨病毒性肝炎疫苗(細胞苗)的方法，是將以上任一 所述方法制備的DHAV-SD株病毒液作為制苗用病毒液依次進行滅活和乳化，得到1型鴨病 毒性肝炎疫苗。所述滅活的方法具體如下在所述DHAV-SD株病毒液中加入甲醛，使甲醛的體積 百分含量為0. 1%，37°C滅活24小時，得到滅活后病毒液。所述乳化的方法具體如下將3 體積份油相、1體積份水相和(質量百分含量)硫柳汞水溶液混合，使硫柳汞的終濃度 為0.01% (質量百分含量)，得到鴨病毒性肝炎疫苗；所述油相的制備方法如下將94體積 份白油和6體積份司本-80混合，得到混合液，每100毫升混合液中加入1. 6 1. 8克硬脂 酸鋁；所述水相的制備方法如下將4體積份吐溫-80和96體積份滅活后的病毒液混勻。本發明提供的疫苗免疫雛鴨時，采用單次免疫的方式，推薦免疫劑量為0. 2ml。本 發明提供的疫苗免疫種鴨時，采用單次免疫的方式，推薦免疫劑量為1ml。本發明提供了一株有優良免疫原性的鴨肝炎病毒強毒株。將該毒株接種到敏感 細胞上，收獲細胞液，滅活后乳化，可以得到一種安全、有效、可控的鴨病毒性肝炎滅活疫苗 (細胞苗)，有利于鴨病毒性肝炎的防控。本發明可以有針對性的防治鴨病毒性肝炎的感染 與爆發，同時簡化了生產工藝，可規模化生產并應用于臨床。


圖1為DHAV PCR檢測結果；泳道1為陰性對照，2為DHAV陽性對照，3為DHAV SD 株，4 為 Marker5000。圖2為DHAV病毒粒子電鏡觀察結果。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的試驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質量百分含量。以 下實施例中的定量試驗，均設置三次重復試驗，結果取平均值。實施例1、鴨肝炎病毒SD毒株的發現和鑒定一、鴨肝炎病毒SD毒株的發現本發明的發明人從野外某鴨場(2009年4月，在山東省濰坊市的鴨場，由劉文軍、 周遠成發現)的發病鴨體內分離獲得了一株鴨病毒性肝炎I型病毒(DHAV-I)，將其命名為 DHAV-SD株，已于2010年4月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏號為CGMCCNo. 3746。二、鴨肝炎病毒SD毒株的鑒定1、病毒形態DHAV-SD株的病毒粒子呈二十面體對稱，直徑約40nm。電鏡觀察結果見圖2。2、分子生物學鑒定 提取DHAV-SD株的RNA，經反轉錄后，根據GENBANK發表的DHAV全基因序列 (FJ496340)設計的一對特異性引物(Pl和P2)，進行RT-PCR擴增，擴增產物為348bp的目 的條帶。PCR產物的電泳圖見圖1。測序結果如序列表的序列1所示。結果表明DHAV-SD 毒株為DHAV陽性。上游引物Pl :5，-CAAAGCCCATCCACTGTTTT-3，；下游引物P2 5，-CACTAGGGCTGGGTCATTGT-3，。提取DHAV-SD毒株的RNA，經反轉錄后，進行全序列測定。毒株的全序列如序列表 的序列2所示，與GENBANK發表的DHAV全基因序列具有序列差異。3、血凝性DHAV-SD株對雞、兔、豬、豚鼠紅細胞均不凝集。4、對細胞的半數感染量(TCID5tl)DHAV-SD 株第 16 代的細胞毒為 107· 1TCID5ciAiL27 代的細胞毒為 107_29TCID5(1/ml。5、對雞胚的半數感染量(EID5tl)DHAV-SD 株第 13 代的滴度為 107_25EID5。/0. 2ml。6、對雛鴨的致病力測定DHAV-SD株3代對雛鴨的致病力測定，滴度為104 45ID5(1/ml，103 9LD5(1/ml。ID50為半 數感染量，LD5tl為半數致死量。7、穩定性將DHAV-SD株在細胞傳32代，每0. Iml病毒含量均為IO7TCID5tl以上，DHAV-SD毒株在32代以內是穩定的，可以作為疫苗生產用種毒。8、免疫原性DHAV-SD株F1 F32均具有良好的免疫原性，利于疫苗的研究。9、特異性將DHAV-SD株稀釋至104TCID5(1/ml，與等量抗鴨肝炎病毒特異性血清混合，室溫放 置1小時后，接種SPF雞胚10個，觀察120小時。在24 120小時內不引起特異性死亡， 且至少存活8個。實施例2、鴨病毒性肝炎滅活疫苗(細胞苗)的制備一、雞胚成纖維細胞系DF-I的培養雞胚成纖維細胞系DF-I 購自北京中原公司(ATCC細胞系編號為CRL_12203)。細胞培養液9體積份的DMEM和1體積份的FBS混合，加入雙抗(青霉素100U/ ml，鏈霉素 100U/ml)。1、細胞復蘇將DF-I細胞凍存管從液氮中取出，迅速在37°C水浴鍋中加溫，使細胞液融化。將 凍存管在臺式離心機中SOOrpm離心5min，棄上清。將細胞沉淀在3ml培養基中吹打均勻 (6cm直徑培養皿中)，放入CO2恒溫培養箱中，37°C、5% CO2靜置培養。2、細胞傳代使用電動吸引器，沿培養皿壁吸去廢液。PBS清洗1-2次，吸去廢液。沿培養皿壁 加入胰酶，37°C消化。待到細胞形態變圓，吸去胰酶，用DMEM培養基吹打細胞，使細胞均勻 懸浮于培養基中，得到細胞懸液。將細胞懸液均勻分為幾份，加入到新的培養皿中，加入新 的DMEM培養基，置于37°C培養。3、細胞凍存將細胞培養液置于離心管中，SOOrpm離心5min。小心棄上清，用細胞凍存液重 懸細胞。將重懸好的細胞分裝，每只凍存管不超過1.5ml。凍存管先置于4°C、30min，然 后-20°C、2h，然后-80°C過夜，然后放入液氮罐中保存。二、病毒液的制備和TCID5tl的測定1、病毒液的制備DHAV-SD株接種DF-I細胞；細胞病變達80%以上時(約48小時)，收獲細胞液， 反復凍融3次，收取上清(病毒液)。2、病毒液的TCID5tl測定(1)準備細胞取生長良好的DF-I細胞，消化后用10 % FBS DMEM制備細胞懸液；調整細胞濃度 為5 X IO5個/ml，然后加入96孔細胞培養板，0. Iml/孔。37°C、5 % CO2培養使其鋪滿單層。(2)準備病毒將步驟1制備的病毒液進行10倍梯度稀釋。(3)病毒液的TCID5tl測定96孔板中細胞長滿單層后，將培養液吸出，加入病毒稀釋液，每個梯度8-16孔，每 孔0. lml,37°C,5% CO2培養96小時后觀察病變孔數并記錄。各個稀釋度的CPE結果見表 1。
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表1各個稀釋度的CPE結果
權利要求
鴨甲型肝炎病毒1型(Duck hepatitis A virus type 1)DHAV SD株，其保藏號為CGMCC No.3746。
2.鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株CGMCCNo. 3746在制備1型鴨病毒性肝炎疫苗中的應用。
3.將鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株CGMCCNo. 3746滅活得到的1型鴨病毒性肝炎疫田ο
4.制備DHAV-SD株病毒液的方法，包括如下步驟將鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株 CGMCC No. 3746在宿主細胞中進行培養后破碎細胞，收集上清液，該上清液即為DHAV-SD株 病毒液；所述宿主細胞為BHK21細胞或DF-I細胞。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于所述將鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株 CGMCC No. 3746在宿主細胞中進行培養后破碎細胞，收集上清液的方法包括如下步驟①將鴨甲型肝炎病毒1型DHAV-SD株CGMCCNo. 3746接種所述宿主細胞，進行培養后 通過凍融破碎細胞，收取上清，即為生產用種毒；②將生產用種毒接種所述宿主細胞，進行培養后通過凍融破碎細胞，收取上清，即為制 苗用種毒；③將制苗用種毒接種所述宿主細胞，進行培養后通過凍融破碎細胞，收集上清液。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于所述步驟①、步驟②和步驟③中接種所述 宿主細胞時MOI均為0. 001，培養時間均為48 72小時；所述步驟①、步驟②和步驟③中 培養時間優選為48小時；所述步驟③中，通過5000rpm離心30 40min收集上清液。
7.如權利要求4至6中任一所述的方法，其特征在于所述宿主細胞為BHK21細胞；所 述宿主細胞在所述接種前先進行如下擴增培養(1)將凍存的BHK21細胞37°C水浴融化，800rpm離心5min，取沉淀；用細胞培養液懸浮 沉淀，得到2X IO5細胞/ml的細胞懸液，37°C、5% CO2靜置培養至每毫升含有1 X IO6細胞；(2)在步驟(1)的基礎上消化細胞，然后重懸于細胞培養液中，使每毫升含有2X IO5細 胞，然后在如下條件下培養至每毫升含有IXlO6細胞pH7.4，溶解氧飽和度為50%、37°C， 100 轉 /min。
8.一種制備1型鴨病毒性肝炎疫苗的方法，是將權利要求4至7中任一所述方法制備 的DHAV-SD株病毒液作為制苗用病毒液依次進行滅活和乳化，得到1型鴨病毒性肝炎疫苗。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于所述滅活的方法如下在所述DHAV-SD株病 毒液中加入甲醛，使甲醛的體積百分含量為0. 1%，37°C滅活24小時，得到滅活后病毒液。
10.如權利要求8或9所述的方法，其特征在于所述乳化的方法如下將3體積份油 相、1體積份水相和1 % (質量百分含量)硫柳汞水溶液混合，使硫柳汞的終濃度為0.01 % (質量百分含量)，得到鴨病毒性肝炎疫苗；所述油相的制備方法如下將94體積份白油和 6體積份司本-80混合，得到混合液，每100毫升混合液中加入1. 6 1. 8克硬脂酸鋁；所 述水相的制備方法如下將4體積份吐溫-80和96體積份滅活后的病毒液混勻。
全文摘要
本發明公開了一種預防鴨病毒性肝炎的滅活疫苗及其制備方法。本發明提供了鴨甲型肝炎病毒1型(Duck hepatitis A virus type 1)DHAV-SD株，CGMCC No.3746。本發明提供的毒株為具有優良免疫原性的鴨肝炎病毒強毒株。將該毒株接種到敏感細胞上，收獲細胞液，滅活后乳化，可以得到一種安全、有效、可控的鴨病毒性肝炎滅活疫苗(細胞苗)，有利于鴨病毒性肝炎的防控。本發明可以有針對性的防治鴨病毒性肝炎的感染與爆發，同時簡化了生產工藝，可規模化生產并應用于臨床。
文檔編號C12N7/00GK101948809SQ20101024730
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月6日 優先權日2010年8月6日
發明者劉文軍, 周遠成, 孫蕾, 李晶 申請人:中國科學院微生物研究所