專利名稱：腸道病毒71型rt-lamp核酸檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測技術應用領域，具體地說涉及腸道病毒71型各種標本(糞便、肛拭、咽拭、皰疹液、腦脊液)核酸檢測用引物及試劑盒。
背景技術：
腸道病毒71型(Enterovirus 71，簡稱EV71)為單股正鏈RNA病毒，屬于小RNA病毒科(Picoranviridae)腸道病毒屬。腸道病毒71型與柯薩奇病毒 A16(CoxsackievirusA16, CA16) ^Ι^Λμ^^Π^Ι (hand-foot-mouth disease, HFMD)白勺兩大主要病原。EV71感染除主要引起患者手足口病以外，還常常引起較為嚴重的并發癥，如無菌性腦炎、腦干腦炎、脊髓灰質炎樣麻痹等神經系統疾病和死亡，已在全世界范圍內引起 10多次大的暴發和流行。目前，人類是EV71病毒唯一已知的自然宿主，病毒主要通過人群間的密切接觸傳播。近年來，EV71在亞太地區的流行呈逐年上升的趨勢，且重癥和死亡病例的報道也逐漸增多，進一步引起人們的重視與關注。手足口病于2008年5月2日已被中國衛生部納入傳染病防治法規定的丙類傳染病進行管理。目前，經典的檢測腸病毒的方法多采用細胞分離培養、中和抗體檢測、免疫組織化學法，這些方法步驟煩瑣，檢測周期長，而且一些腸道病毒難以在細胞中進行增殖， 容易出現漏檢；基于EV71核酸擴增的分子生物學診斷技術如PCR、RT-PCR、實時熒光定量 RT-PCR(real-time fluorescent RT-PCR)等在病原微生物的檢測以及疫病診斷方面發揮著重大作用，但這些方法或者需要精密控溫設備和高級復雜的分析儀器，或者對操作人員的熟練度和專業水平要求比較高，且反應時間長，不利于現場樣品的檢測，不利于在基層推廣，無法滿足簡單、快速、準確診斷的要求；而疫病的防控和治療的關鍵在于對病原微生物的快速、準確、及早的檢測并確診。因此，建立一種快速、準確的新型診斷技術對于疫病的診斷就顯得尤為重要。環介導等溫擴增技術(LAMP)是由Notomi等于2000年報道的一種新型核酸擴增技術，它針對目的基因的6個區域設計4條引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在等溫(60 65°C )的條件下高效、特異、快速的擴增目的基因。目前， LAMP技術已經被廣泛應用病原微生物的診斷中，包括人類致病細菌和病毒，動植物病毒和寄生蟲的檢測。
發明內容
本發明目的在于提供一種用于腸道病毒71型RT-LAMP檢測的引物組和試劑盒，以能夠簡單、快速、準確地檢測樣品中是否含腸道病毒71型，滿足目前對手足口病現場檢測的需要。本發明提供的用于檢測腸道病毒71型的RT-LAMP引物組，包括四條引物，所述四條引物的核苷酸序列為F3 :TCCCTTGCATGGCAAACC ；
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B3 GGGTACTTGGACTTGGAGGT ；FIP :GGCACTCGCAGGTGACATGAAT-TTGTCAAGCTGTCAGACCCT ；
BIP :ATCCCACATTCGGGGAACACAA-ACTGAGAACGTGCCCATCA。本發明提供的腸道病毒71型的RT-LAMP檢測試劑盒，包括上述RT-LAMP引物組。本發明提供的一種腸道病毒71型的RT-LAMP檢測試劑盒，包括含有上述RT-LAMP 引物組的RT-LAMP反應液，23 μ 1所述RT-LAMP反應液的配置為10Xbuffer2. 5 μ 1，25mM MgCl2 6 μ 1，IOmM each dNTPs 3· 5 μ 1，5M Betaine 4 μ 1，5U/ μ IAMV 逆轉錄酶 0. 5 μ 1，8U/ μ 1 Bst DNA polymerase 1 μ 1, EDPC H2O 2· 5 μ 1，40 μ M 所述 FIP 1 μ 1，40 μ M 所述 BIP 1口1，10口] 所述卩3 0. 5μ 1，10μΜ 所述 Β3 0. 5μ1。上述試劑盒還可以包括10000XSTOR Green I染料。上述試劑盒的最佳檢測反應條件是63°C恒溫反應60min，80°C反應5min。操作時只需將RT-LAMP反應液和待檢RNA混勻，63°C恒溫反應60min即可完成逆轉錄和擴增過程， 80V反應5min使酶滅活，反應結束后結果判斷可取擴增產物電泳檢測，或者在擴增產物管內加入STOR Green I熒光染料，根據反應液顏色的變化來判定結果。與現有的EV71RT-PCR、Real-time RT-PCR相比，本發明 EV71 RT-LAMP 以待檢樣品 RNA為摸板，只需一步就可以完成在等溫環境中的循環置換擴增反應，省略了單獨的逆轉錄步驟和模板的變性、退火和延伸反應過程中溫度變化的耗時，而且在恒溫水浴鍋中就能進行，不需要復雜的儀器，最后用電泳檢測或加熒光染料后肉眼或紫外燈下就可以觀察結果， 具有操作方法簡單、檢測快速、結果易于判斷、成本低等特點。同時，本發明EV71 RT-LAMP 特異性好，靈敏度高。因此，本發明試劑盒及其EV71RT-LAMP檢測技術能較好滿足目前對手足口病現場檢測的迫切需要，可用于疾病預防控制機構、醫院、托幼機構的現場快速檢測， 易于在基層單位大范圍推廣應用，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益。
圖 1 是 EV71 RT-LAMP、RT-PCR、Real-time RT-PCR 靈敏度實驗的結果圖；其中，圖I-A是EV71 RT-LAMP產物加染料后在可見光下觀察的結果(上排Al)和紫外光下觀察的結果(下排A2)，圖中，1-8 分別為100TCID50標準品10°，10—1，10_2，10_3，10_4， 10_5，10_6，10_7梯度稀釋后提取RNA的RT-LAMP產物，9 陰性對照；圖 I-B 是 EV71 RT-LAMP 產物電泳條帶，圖中，M :DL2000 Marker, 1-8 分別為 100TCID50 標準品 10°，ΚΓ1，1(Γ2，1(Γ3，1(Γ4，1(Γ5，1(Γ6，1(Γ7 梯度稀釋后提取 RNA 的 RT-LAMP 產物，9:陰性對照；圖I-C是EV71 RT-PCR靈敏度實驗的結果圖，圖中，M :DL2000 Marker，1-8 分別為 100TCID50 標準品 10°，10、1(Γ2，1(Γ3，1(Γ4，1(Γ5，1(Γ6，1(Γ7 梯度稀釋后提取 RNA 的 RT-PCR 產物，9:陰性對照；圖I-D是EV71 RT-PCR Real-time靈敏度實驗的結果圖；圖2是EV71 RT-LAMP技術引物特異性實驗的結果圖；其中，圖2-A是LAMP產物加染料后在可見光下觀察的結果(上排Al)和紫外光下觀察的結果(下排A2)，圖中，1-9 :EV71病毒，10-12 :CA16病毒，13-15 滅活的脊髓灰質炎病毒 Polio I、Polio II、PolioIII，16 輪狀病毒，17 諾如病毒，18 陰性對照;
圖 2-B 是 LAMP 產物電泳條帶，圖中，M:DL2000 Marker，1-9 :EV71 病毒，10-12 CA16病毒，13-15 滅活的脊髓灰質炎病毒Polio I,Polio II、PolioIII，16 輪狀病毒，17 諾如病毒，18:陰性對照；圖3是EV71 RT-LAMP技術擴增產物特異性實驗的結果圖，圖中，M :DL2000Marker， 1-9 分別是圖2-B中9株EV71陽性RT-LAMP產物的酶切產物；圖4是EV71 RT-LAMP方法的可重復性檢測實驗的結果圖；其中，圖4-A是LAMP產物加染料后在可見光下觀察的結果(上排Al)和在紫外光下觀察的結果(下排A2)，圖中，1，3，5，7:分別為EV71陽性標準品的四次重復，2，4，6，8:分別為 1,3,5,7四次重復性實驗的陰性對照；圖4-B是LAMP產物電泳圖，其中，M :DL2000 Marker, 1,3,5,7 分別為EV71陽性標準品的四次重復，2，4，6，8 分別為1，3，5，7四次重復性實驗的陰性對照。
具體實施例方式下面實施例用于對本發明的進一步說明，但不用來限制本發明的范圍。LAMP引物的設計和合成根據GenBank公布的EV71 VPl基因序列，利用生物軟件CLAST分析其相對保守區， 利用 LAMP 在線設計軟件 PrimerExplorer V4 (http //primerexplorer. jp/e/)針對相對保守序列區設計了 4條引物，兩條外引物FIP (F2+F1C)和BIP (B2+B1C)，兩條內引物F3和B3， 分別與靶序列中6個結合區匹配，在利用Oligo 6軟件和BLAST對引物進行評價。引物序列為F3 (正向內弓丨)5，-TCCCTTGCATGGCAAACC-3，B3 (反向內弓丨)5，-GGGTACTTGGACTTGGAGGT-3，FIP(F1C+F2，正向外引)GGCACTCGCAGGTGACATGAAT-TTGTCAAGCTGTCAGACCCTBIP(B1C+B2，反向外引)ATCCCACATTCGGGGAACACAA-ACTGAGAACGTGCCCATCAF2 :5’ -TTGTCAAGCTGTCAGACCCT-3’FlC :5，-GGCACTCGCAGGTGACATGAAT-3，B2 5' -ACTGAGAACGTGCCCATCA-3‘BlC :5，-ATCCCACATTCGGGGAACACAA-3，RNA 的提取病毒樣品RNA 的抽提使用 High Pure viral RNA kit (Roche，Germany)，步驟按其操作說明書進行，病毒細胞培養物和皰疹液按上述方法直接提取；糞便樣品、肛拭子和咽喉拭子需經過預處理，在抽提前需加Hank’ Balanced Salt Solution，其中，0. Ig糞便樣品 (100 μ 1液態)加Iml Hank，s液，然后將懸液8000rpm離心5min,取200 μ 1上清液進行 RNA 抽提，用 50μ1 Elution Buffer 洗脫，于 _80°C保存。EV71 RT-LAMP擴增方法的建立:1、EV71 RT-LAMP 反應體系以待檢樣品RNA為模板，進行RT-LAMP反應。
EV7IRT-LAMP 反應體系
權利要求
1.一種用于檢測腸道病毒71型的RT-LAMP引物組，其特征在于，包括四條引物，所述四條引物的核苷酸序列為F3 :TCCCTTGCATGGCAAACC ；B3 :GGGTACTTGGACTTGGAGGT ；FIP :GGCACTCGCAGGTGACATGAAT-TTGTCAAGCTGTCAGACCCT ；BIP :ATCCCACATTCGGGGAACACAA-ACTGAGAACGTGCCCATCA。
2.一種腸道病毒71型的RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于，包括權利要求1所述的 RT-LAMP引物組。
3.一種腸道病毒71型的RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于，包括含有權利要求1所述RT-LAMP引物組的RT-LAMP反應液，23 μ 1所述RT-LAMP反應液的配置為10Xbuffer 2. 5 μ l,25mM MgCl2 6 μ 1, IOmM each dNTPs 3. 5μ1，5Μ Betaine4 μ 1，5U/μ 1 AMV 逆轉錄酶 0· 5μ 1，8υ/μ 1 Bst DNA polymerase 1 μ 1, EDPC Η202· 5 μ 1，40 μ M 所述 FIP 1 μ 1, 40 μ M 所述 BIP 1μ1，10μΜΚ $Ρ3 0· 5 μ 1，10 μ M 所述 Β3 0·5μ1。
4.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，還包括10000XSTOR Green I染料。
5.如權利要求2-4任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的檢測反應條件是 63°C恒溫反應 60min，80°C反應 5min。
全文摘要
本發明涉及生物檢測技術應用領域，特別涉及一種腸道病毒71型RT-LAMP核酸檢測試劑盒，所述試劑盒包括含四條RT-LAMP引物的RT-LAMP反應液，進一步還包括10000×SYBR Green I染料。具有特異性好、靈敏度高、操作方法簡單、檢測快速、結果易于判斷、成本低等特點，能較好滿足目前對手足口病現場檢測的迫切需要，可用于疾病預防控制機構、醫院、托幼機構的現場快速檢測，易于在基層單位大范圍推廣應用，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益。
文檔編號C12Q1/70GK102373294SQ20101025386
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月13日 優先權日2010年8月13日
發明者何雅青, 宗文萍, 胡貴方 申請人:何雅青, 宗文萍, 胡貴方