特異性抑制SET蛋白表達的shRNA表達載體及其構建方法和應用的制作方法

專利名稱：特異性抑制SET蛋白表達的shRNA表達載體及其構建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，尤其是涉及一種可以可在哺乳動物細胞內穩定表 達的，能特異性抑制SET蛋白表達的shRNA表達載體及其該載體的表達方法。
背景技術：
癌蛋白SET又稱I2PP2A、TAF_Ii3，在細胞中廣泛存在，是體內主要的絲-蘇氨酸蛋 白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)的胞內抑制蛋白，具有特異性、非競爭性和熱 穩定性，同時SET也是組蛋白分子伴侶。其在急性未分化型白血病中首次被鑒定，近年來的 研究表明，SET是一個多功能蛋白，涉及細胞凋亡、腫瘤發生、轉錄調節、核小體裝配、組蛋白 結合等方面。Madeira A等報道在Alzheimer，s疾病中SET蛋白參與了神經元凋亡過程，為 此疾病機理提供了新的線索；PP2A活性的缺失或改變與腫瘤發生有一定聯系，許多細胞毒 素的促腫瘤作用與抑制PP2A的活性有關，PP2A被認為可能是一個潛在的腫瘤抑制因子。而 SET蛋白作為PP2A的胞內抑制蛋白，其與腫瘤發生也密切相關，如Wilm’ s腫瘤中SET mRNA 和蛋白表達都顯著上升，通過癌蛋白SET的磷酸化可促進前列腺癌細胞生長，肝細胞癌變 中觀察到I2PP2A/SET基因表達上調，PP2A活性受抑制；SET蛋白能誘導原癌基因C-Jun的 表達和影響轉錄因子AP-I的活性，同時也能增強激活蛋白-Kactivator protein-Ι)的轉 錄活性；SET作為組蛋白分子伴侶，能抑制組蛋白和核小體的乙酰化，從而導致組蛋白依賴 性轉錄的沉默和DNA去甲基化激活受阻。三氯乙烯(Trichloroethylene，TCE)為不飽和鹵代脂肪羥類化學物，是電子、制 革和五金行業常用的有機清洗溶劑，經吸入和皮膚接觸后可引起肝臟、腎臟、心臟及皮膚的 損害。近年來，三氯乙烯中毒事件呈上升趨勢，死亡事件也時有報道。三氯乙烯中毒主要表 現為藥疹樣皮炎，但肝臟功能損害情況亦相當嚴重。劉建軍等利用蛋白質組學技術研究三 氯乙烯刺激肝細胞后蛋白質差異表達，結果發現其中的SET差異蛋白在TCE低劑量時表達 上調，并且隨著TCE劑量的增加，其表達繼續上升。自 1998 年 Fire 等人發現 RNA 干擾(RNA interference, RNAi)現象以來，RNAi 技 術已被證實是一種特異、高效、經濟的抑制基因表達的手段而受到極大的重視和歡迎。2001 年，RNAi技術被成功應用于哺乳動物細胞，其應用前景更加誘人，已經成為疾病研究和治療 的熱點。研究者們可以利用這項技術對目標基因或蛋白質進行特異性表達沉默，通過觀察 其表達被抑制的細胞或者生物體的從形態到各項生理生化指標的變化，對該基因或蛋白質 的功能及參與的信號網絡進行研究。這比傳統的基因敲除方法要簡單而且方便得多，因此 短短幾年，就有了很多突破性的成果，其中研究得最多的是與疾病相關的一些基因和蛋白。RNA干擾是與靶基因序列同源的雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA)所誘導 的一種特異性的轉錄后基因沉默現象(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。 外源性或內源性的雙鏈RNA進入細胞后，在三磷酸腺苷(ATP)依賴性RNA酶III (Dicer， DCR)的作用下被切割成3’端有2個突出堿基的21-23nt長度的小分子干擾RNA(small
4interference RNA, siRNA)；這些siRNA與RNAi特異性酶結合，形成RNA誘導沉默復合體 (RNA-induced silencing complex, RISC)；而后 RISC 在 siRNA 反義鏈的指導下與 siRNA 同源靶mRNA相結合，RISC中的重要組成成分Ago-2蛋白在近中點位置將其切割A，隨后靶 mRNA被細胞內RNA酶降解，轉錄后的mRNA就不能翻譯出相對應的蛋白，而RISC游離出來， 尋找新的目標分子，從而達到抑制靶基因表達的作用。現有技術中，沒有發現存在可長效穩定表達，特異性抑制SET蛋白表達的shRNA表 達載體，而且現有的其它shRNA表達載體往往存在轉染效率低，干擾效果不穩定，載體用量 大，而且通常都需要多次瞬時轉染等缺陷。

發明內容
本發明的目的之一在于提供一種可以長效穩定表達，且能特異性抑制SET蛋白表 達的shRNA表達載體，避免多次瞬時轉染造成繁瑣流程，能有效地抑制SET蛋白表達，可以 用于制備治療SET蛋白表達異常相關疾病的藥物中，解決現有技術存在的缺陷。為實現上述目的，本發明采用如下技術方案一種特異性抑制SET蛋白表達的shRNA表達載體，包括表達載體的基本序列、抗性 基因序列、多克隆位點、啟動子序列、可表達的SET shRNA的寡核苷酸鏈模板序列，所述的可 表達的SET shRNA的寡核苷酸鏈模板序列正向插入表達載體的多克隆位點序列內；所述可 表達的SET shRNA的寡核苷酸鏈模板序列依據SET mRNA靶序列設計。優選的是所述表達載體為慢病毒表達載體PLVX-ShRNAl系列，優選為 pLVX-shRNAl，所述的多克隆位點包BamH I和EcoR I限制性酶切位點，所述寡核苷酸鏈包 括Sense+Loop+Antisense+終止序列，并在兩端加上BamH I和EcoR I酶切位點；所述的 Loop為TTCAAGAGA，所述的終止序列為TTTTTT。更優的是所述的SET mRNA靶序列為 5' -GGATGAAGGTGAAGAAGAT-3 ‘ (SQE ID No
1)；所述的寡核苷酸鏈模板序列包括寡核苷酸正義鏈序列和寡核苷酸反義鏈序列，所述正 義鏈序列為5' -GATCCGGATGAAGGTGAAGAAGATTTCAAGAGAATCTTCTTCACCTTCATCCTTTTTTG-3' (S QE ID No6)；所述反義鏈序列為5' -AATTCAAAAAAGGATGAAGGTGAAGAAGATTCTCTTGAAATCTTCTTCACCTTCATCCG-3' (S QE ID No7)。更優的是所述的SET mRNA靶序列為 5' -GTGAAATAGACAGACTTAAT-3 ‘ (SQE IDNo
2)；所述的寡核苷酸鏈模板序列包括寡核苷酸正義鏈序列和寡核苷酸反義鏈序列，所述正 義鏈序列為5' -GATCCGTGAAATAGACAGACTTAATTTCAAGAGATTAAGTCTGTCTATTTCATTTTTTG-3' (S QE ID No 8)；所述反義鏈序列為5' -AATTCAAAAAATGAAATAGACAGACTTAATTCTCTTGAAATTAAGTCTGTCTATTTCACG-3'( SQE ID No 9)。更優的是所述的SET mRNA靶序列為
5
5' -GCAGCAAGAAGCGATTGAAC-3‘ (SQE ID No 3)；所述的寡核苷酸鏈模板序列包 括寡核苷酸正義鏈序列和寡核苷酸反義鏈序列，所述正義鏈序列為5' -GATCCGCAGCAAGAAGCGATTGAACTTCAAGAGAGTTCAATCGCTTCTTGCTGTTTTTTG-3'( SQE ID No 10)；所述反義鏈序列為5 ‘ -AATTCAAAAAACAGCAAGAAGCGATTGAACTCTCTTGAAGTTCAATCGCTTCTTGCTGCG-3‘( SQE IDNo 11)。更優的是所述的SET mRNA靶序列為 5' -GATGAAGAGGCACTGCATT-3 ‘ (SQE ID No
4)；所述的寡核苷酸鏈模板序列包括寡核苷酸正義鏈序列和寡核苷酸反義鏈序列，所述正 義鏈序列為5 ‘ -GATCCGATGAAGAGGCACTGCATTTTCAAGAGAAATGCAGTGCCTCTTCATCTTTTTTG-3‘ (S QE ID No 12)；所述反義鏈序列為5 ‘ -AATTCAAAAAAGATGAAGAGGCACTGCATTTCTCTTGAAAATGCAGTGCCTCTTCATCG-3‘ (S QE ID No 13)。更優的是所述的SET mRNA靶序列為 5' -GCCAAACCCATTACAGTAC-3 ‘ (SQE ID No
5)；所述的寡核苷酸鏈模板序列包括寡核苷酸正義鏈序列和寡核苷酸反義鏈序列，所述正 義鏈序列為5 ‘ -GATCCGCCAAACCCATTACAGTACTTCAAGAGAGTACTGTAATGGGTTTGGCTTTTTTG-3‘ (S QE ID No 14)；所述反義鏈序列為5' -AATTCAAAAAAGCCAAACCCATTACAGTACTCTCTTGAAGTACTGTAATGGGTTTGGCG-3' (S QE ID No 15)。本發明的目的之二在于提供一種特異性抑制SET蛋白表達的shRNA表達載體的構 建方法，包括步驟(A)依據Genbank的SET基因序列，根據shRNA設計原則選取SET mRNA靶序列，并 設計合成可表達的SET shRNA的寡核苷酸鏈模板序列；(B)將設計合成的SET shRNA的寡核苷酸鏈模板序列正向插入表達載體的多克隆 位點序列內，構建特異性抑制SET蛋白表達的shRNA表達載體。本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果本發明利用慢病毒載體為介導構建靶向人SET基因干擾載體，具有轉染效率高、 干擾效果穩定的特點，克服了質粒或逆轉錄病毒轉染效率低、干擾效果不穩定的缺點，為 SET蛋白功能科研領域以及SET蛋白表達異常相關疾病的治療提供了有力工具。


圖1為本發明所述的慢病毒表達載體pLVX-shRNAl質粒圖譜；圖2為本發明實施例shRNA重組質粒測序結果示意圖；圖3-1為實施例嘌呤霉素篩選完后的Western blotting檢測結果示意圖；圖3-2為實施例篩選細胞培養15d后的Western blotting檢測結果示意6
圖3-3為實施例篩選細胞培養2個月后的Western blotting檢測結果示意圖；圖4-1本發明實施例嘌呤霉素篩選后SET的RT-PCR結果示意圖；圖4-2本發明實施例篩選細胞培養15d后SET的RT-PCR結果示意圖。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明做進一步詳細說明。實施例1靶向人SET的短發夾環RNA(shRNA)寡核苷酸鏈的設計與合成本實施例利用慢病毒介導的RNA干擾技術構建了靶向人SET基因的慢病毒干擾重 組載體，并包裝出病毒轉導入L-02肝細胞中，通過Western Blot和實時熒光定量PCR技術 分別從SET蛋白和mRNA水平來驗證SET的表達，篩選出了高效抑制SET表達的最佳干擾片 段，構建了高效抑制SET表達的shRNA慢病毒表達載體，具體方法和步驟如下材料慢病毒表達載體pLVX-shRNAl vector和慢病毒轉染包裝試劑盒(Lenti-X Packaging system)購自Clontech公司，其帶人TO啟動子，嘌呤霉素(puromycin)抗性抗 性基因、BamH I和EcoR I酶切位點(見圖1)；限制性內切酶BamH I和EcoR I、T4 DNA連 接酶購自New England BioLabs公司；DNA凝膠回收試劑盒購自美國MBI Fermentas公司； 大腸桿菌E. coli DH5 α、購自大連寶生物公司；高純質粒提取試劑盒為Omega公司產品； IOOObp DNA Marker購自TaKaRa公司；shRNA寡核苷酸鏈由上海生工公司合成；SET兔抗鼠 一抗購自GloboZymes公司，HRP標記的羊抗鼠二抗購自美國sigma公司，ECL試劑盒為美國 GE公司產品。靶向人SET的短發夾環RNA(shRNA)寡核苷酸鏈的設計與合成針對人SET mRNA序 列(Genbank Accession NM 001122821)，根據 shRNA 設計原則及 www, clontech. com 上的 在線設計軟件選擇5條19nt靶序列，經BLAST同源性比對分析，5條靶序列與人類其他基 因編碼序列無同源性，分別起始于SET基因第801、159、120、336、677位點。寡核苷酸鏈由 Sense (下劃線部分)+Loop (TTCAAGAGA) +Antisense+終止序列(TTTTTT)組成，并在兩端加 上 BamHI 禾Π EcoR I 酶切位點，分別命名為 siRNAl、siRNA2、siRNA3、siRNA4、siRNA5，另外設 計對照序列siRNA c，不針對人任何基因，具體序列如表1。寡核苷酸鏈由上海生工公司合 成。表1靶向SET基因shRNA寡核苷酸鏈序列Table 1 the sequences of shRNA oligonucleotides targeting SET gene
權利要求
一種特異性抑制SET蛋白表達的shRNA表達載體，其特征是包括表達載體的基本序列、抗性基因序列、多克隆位點、啟動子序列、可表達的SETshRNA的寡核苷酸鏈模板序列，所述的可表達的SET shRNA的寡核苷酸鏈模板序列正向插入表達載體的多克隆位點序列內；所述可表達的SET shRNA的寡核苷酸鏈模板序列依據SET mRNA靶序列設計。
2.如權利要求1所述的特異性抑制SET蛋白表達的shRNA表達載體，其特征是所述 表達載體為慢病毒表達載體pLVX-shRNAl，所述的多克隆位點包BamH I和EcoR I限制性酶 切位點，所述寡核苷酸鏈包括Sense+Loop+Anti sense+終止序列，并在兩端加上BamH I和 EcoR I酶切位點；所述的Loop為TTCAAGAGA，所述的終止序列為TTITTT。
3.如權利要求2所述的特異性抑制SET蛋白表達的shRNA表達載體，其特征是所述 的 SET mRNA 靶序列為 5' -GGATGAAGGTGAAGAAGAT-3 ‘ (SQEID No 1)；所述的寡核苷酸鏈 模板序列包括寡核苷酸正義鏈序列和寡核苷酸反義鏈序列，所述正義鏈序列為5 ‘ -GATCCGGATGAAGGTGAAGAAGATTTCAAGAGAATCTTCTTCACCTTCATCCTTTTTTG-3 ‘ (SQE ID No 6)；所述反義鏈序列為5 ‘ -AATTCAAAAAAGGATGAAGGTGAAGAAGATTCTCTTGAAATCTTCTTCACCTTCATCCG-3 ‘ (SQE ID No 7)。
4.如權利要求2所述的特異性抑制SET蛋白表達的shRNA表達載體，其特征是所述 的 SET mRNA 靶序列為 5' -GTGAAATAGACAGACTTAAT-3 ‘ (SQE ID No 2)；所述的寡核苷酸 鏈模板序列包括寡核苷酸正義鏈序列和寡核苷酸反義鏈序列，所述正義鏈序列為5 ‘ -GATCCGTGAAATAGACAGACTTAATTTCAAGAGATTAAGTCTGTCTATTTCATTTTTTG-3 ‘ (SQE ID No 8)；所述反義鏈序列為5 ‘ -AATTCAAAAAATGAAATAGACAGACTTAATTCTCTTGAAATTAAGTCTGTCTATTTCACG-3‘ (SQE ID No 9)。
5.如權利要求2所述的特異性抑制SET蛋白表達的shRNA表達載體，其特征是所述 的 SET mRNA 靶序列為 5' -GCAGCAAGAAGCGATTGAAC-3 ‘ (SQEID No 3)；所述的寡核苷酸鏈 模板序列包括寡核苷酸正義鏈序列和寡核苷酸反義鏈序列，所述正義鏈序列為5 ‘ -GATCCGCAGCAAGAAGCGATTGAACTTCAAGAGAGTTCAATCGCTTCTTGCTGTTTTTTG-3 ‘ (SQE ID No 10)；所述反義鏈序列為5 ‘ -AATTCAAAAAACAGCAAGAAGCGATTGAACTCTCTTGAAGTTCAATCGCTTCTTGCTGCG-3‘ (SQE ID No 11)。
6.如權利要求2所述的特異性抑制SET蛋白表達的shRNA表達載體，其特征是所述 的 SET mRNA 靴序列為 5' -GATGAAGAGGCACTGCATT-3 ‘ (SQE IDNo 4)；所述的寡核苷酸鏈 模板序列包括寡核苷酸正義鏈序列和寡核苷酸反義鏈序列，所述正義鏈序列為5 ‘ -GATCCGATGAAGAGGCACTGCATTTTCAAGAGAAATGCAGTGCCTCTTCATCTTTTTTG-3 ‘ (SQE ID No 12)；所述反義鏈序列為5 ‘ -AATTCAAAAAAGATGAAGAGGCACTGCATTTCTCTTGAAAATGCAGTGCCTCTTCATCG-3 ‘ (SQEID No 13)。
7.如權利要求2所述的特異性抑制SET蛋白表達的shRNA表達載體，其特征是所述 的SET mRNA靶序列為5」GCCAAACCCATTACAGTAC-3 ‘ (SQE IDNo 5)；所述的寡核苷酸鏈 模板序列包括寡核苷酸正義鏈序列和寡核苷酸反義鏈序列，所述正義鏈序列為5 ‘ -GATCCGCCAAACCCATTACAGTACTTCAAGAGAGTACTGTAATGGGTTTGGCTTTTTTG-3 ‘ (SQE ID No 14)；所述反義鏈序列為5 ‘ -AATTCAAAAAAGCCAAACCCATTACAGTACTCTCTTGAAGTACTGTAATGGGTTTGGCG-3 ‘ (SQE ID No 15)。
8.—種構建權利要求1-7任一項所述特異性抑制SET蛋白表達的shRNA表達載體的方 法，包括步驟(A)依據Genbank的SET基因序列，根據shRNA設計原則選取SETmRNA靶序列，并設計 合成可表達的SET shRNA的寡核苷酸鏈模板序列；(B)將設計合成的SETshRNA的寡核苷酸鏈模板序列正向插入表達載體的多克隆位點 序列內，構建特異性抑制SET蛋白表達的shRNA表達載體。
9.權利要求1-7任一項所述的特異性抑制SET蛋白表達的shRNA表達載體在制備治療 SET蛋白表達異常相關疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種特異性抑制SET蛋白表達的shRNA表達載體及其構建方法和應用，所述shRNA表達載體，包括表達載體的基本序列、抗性基因序列、多克隆位點、啟動子序列、可表達的SET shRNA的寡核苷酸鏈模板序列，所述的可表達的SET shRNA的寡核苷酸鏈模板序列正向插入表達載體的多克隆位點序列內；所述可表達的SET shRNA的寡核苷酸鏈模板序列依據SET mRNA靶序列設計。本發明利用慢病毒載體為介導構建靶向人SET基因干擾載體，具有轉染效率高、干擾效果穩定的特點，克服了質粒或逆轉錄病毒轉染效率低、干擾效果不穩定的缺點，為SET蛋白功能科研領域以及SET蛋白表達異常相關疾病的治療提供了有力工具。
文檔編號C12N15/113GK101948859SQ20101025572
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月17日 優先權日2010年8月17日
發明者劉建軍, 周麗, 李 杰, 楊細飛, 蔣英芝 申請人:深圳市疾病預防控制中心