專利名稱：IL-24-Tat PTD融合蛋白及其構建方法和應用的制作方法
IL-24-Tat PTD融合蛋白及其構建方法和應用本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種新的融合蛋白及其在腫瘤治療中的應用。
背景技術：
白細胞介 素24 (Interleukin 24，IL-24)又稱為黑色素瘤分化相關基因 7 (Melanomadifferentiation associated gene 7，MDA_7)，是 Jiang等用消減雜交分析法， 從重組的纖維母細胞干擾素和蛋白激酶C活化劑密執毒素(mezerrein，MEZ)共同處理的黑色素瘤細胞株中篩選發現的一個高表達基因。后續的研究發現，將該基因導入多種腫瘤中后可引起腫瘤細胞生長阻滯和凋亡，降低腫瘤細胞克隆的形成。由此證明它是一種新的抑癌基因。隨著對MDA-7研究的深入，根據該基因的結構、染色體定位、氨基酸序列同源性以及具有細胞因子樣的特征，MDA-7被重新命名為IL-24，歸屬于IL-IO家族。IL-24表達于正常胸腺、脾和外周血液等免疫組織器官中的單核細胞、巨噬細胞、T 淋巴細胞、B淋巴細胞和NK細胞。在人的外周血單核細胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMC)中，主要是活化的T淋巴細胞和單核細胞表達IL-24 ；增殖活躍的正常黑色素細胞、早期黑色素瘤細胞和皮膚的平滑肌細胞也能檢測到IL-24表達，而在晚期黑色素瘤細胞中IL-24表達降低或缺失，轉移性黑色素瘤細胞IL-24表達缺失。很多體內、外實驗結果證實，IL-24可通過誘導凋亡來抑制黑素瘤、惡性膠質瘤、 骨肉瘤和乳腺癌、宮頸癌、結腸癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等多種癌細胞的生長而不損害正常細胞，且其抑制腫瘤生長作用不依賴于該類細胞中P53、pRB及p21等抑癌基因的活性狀態。除能誘導腫瘤細胞凋亡外，IL-24還具有其他生物學功能如抗血管生成、免疫調節，增加放療和化療敏感性等。但是在慢性淋巴細胞白血病B細胞中，IL-24呈現高表達，其機理是促進p38 MAPK的磷酸化，保護和促進了腫瘤細胞的生長。IL-24的生物學功能可以通過其受體來發揮作用。與IL-IO家族的其他蛋白一樣，IL-24蛋白能夠與II型細胞因子受體 IL-20RA/IL-20RB 和 IL-22R/IL-20RB 受體結合，從而激活 JAK/STAT (Janus familykinase/ signal transducer and activator of transcription, JAK/STAT)通路。高表達 IL-20R 和IL-22R并不能明顯提高IL-24誘導腫瘤細胞凋亡的能力，而且利用酪氨酸激酶的特異性抑制劑Genistein和AG18，或者用JAK/STAT信號通路的特異性抑制劑AG490，并不影響 IL-24對腫瘤細胞凋亡的誘導作用。因此人們推測，IL-24引起的腫瘤細胞凋亡的機制與主要通過IL-20/IL-22受體來發揮作用的炎癥細胞因子的分子機制存在著差異。IL-24目前已經成為腫瘤治療領域中的一個研究熱點，通過對IL-24所進行的近十多年體內和體外研究，以及隨之進行的臨床I期實驗，都證實了 IL-24具有廣泛的抗腫瘤活性。由于IL-24能夠選擇性的誘導腫瘤細胞的凋亡，對正常細胞沒有毒性，因此是一種理想的抗腫瘤藥物。目前作為IL-24的重組蛋白可以通過靶細胞表面的受體或其它途徑進入靶細胞，以發揮抗腫瘤作用。但目前IL-24對腫瘤治療效果有待于進一步提高。Tat蛋白轉帛g豐勾_ (Tat Protein transduction domain, Tat PTD) HiJIf 入 HIV Tat 胃白。Tat PTD目前已經被廣泛用于與蛋白，siRNA或藥物交聯，以提高這些分子進入細胞內。
發明內容
本發明所要解決的一個技術問題在于對腫瘤治療效果好的IL-24-Tat PTD融合蛋白。本發明所要解決的另一個技術問題在于為IL-24-TatPTD融合蛋白提供一種構建方法。本發明所要解決的還有一個技術問題在于為IL-24-Tat PTD融合蛋白提供一種新用途。解決上述技術問題所采用的技術方案是它是由IL-24與小肽兩部分所組成的融合蛋白，小肽位于IL-24的碳末端，其特征在于所說小肽是Tat PTD，由11氨基酸 (YGRKKRRQRRR)組成。上述的IL-24-Tat PTD融合蛋白的構建方法由下述步驟組成1、攜帶IL-M融合蛋白基因的構建采用聚合酶鏈式反應以人IL-M基因為模板擴增獲得IL-M融合蛋白基因，將所擴增的該基因產物經質量分數為1.0%的瓊脂糖電泳回片后與PGEM-T easy載體連接，將連接產物轉化感受態的DH5 α細胞，涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板中，挑取菌落接種到含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養液中，14 16小時后，經堿性裂解法提取質粒DNA，通過酶切及測序鑒定陽性克隆，獲得陽性克隆為帶有IL-M融合蛋白基因的質粒載體。2、IL-M-Tat PTD融合蛋白基因的原核表達將攜帶IL-24融合蛋白基因的載體通過ClaI和SpeI酶切并回收片段，與經同樣酶切處理的原核表達載體pGEX4-3-6His連接。連接產物轉化感受態細胞，經酶切鑒定獲得陽性克隆，即為攜帶IL-24融合蛋白基因的原核表達載體。將攜帶IL-24融合蛋白基因的原核表達載體轉化大腸桿菌BL21，經異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷誘導表達目的蛋白，經Ni柱純化后獲得IL-M融合蛋白。檢測蛋白含量，并進行SDS-PAGE檢測純化的蛋白。3、IL-24融合蛋白基因腺病毒載體的制備帶有IL-24-Tat PTD 融合蛋白的 pGEMT/IL_24_Tat PTD 載體經 ClaI 與 SpeI 雙酶切后回收目的片段，然后與經ClaI與SpeI雙酶切的腺病毒El穿梭載體pacAd5 CMV K-N PA連接后轉化獲得陽性克隆，經酶切鑒定獲得陽性克隆即為IL-M融合蛋白基因的腺病毒穿梭載體，所獲得陽性克隆載體經》ιοΙ與NotI雙酶切后獲得片段，與經MlI與NotI雙酶切后的pAd5-E4-PGK-miniCMV-eGFP-Fiber-RGD載體連接后轉化感受態細胞，經酶切鑒定得到陽性克隆即為攜帶IL14融合蛋白基因用于腺病毒載體E4修飾的穿梭載體。將用于腺病毒載體E4修飾的攜帶IL-M融合蛋白基因的穿梭載體經BioI線性化后與經SwaI酶切線性化后的pCRAd5-baClibone在大腸桿菌BJ5183中同源重組獲得陽性克隆即為攜帶IL-24融合蛋白基因的腺病毒載體。將I^acI線性化的攜帶IL-24融合蛋白基因的腺病毒載體轉染HEK293細胞，7 10天收獲病毒原液，經過進一步擴增及CsCl純化獲得攜帶IL-M融合蛋白基因的腺病毒。IL-24-Tat PTD融合蛋白在制備治療宮頸癌藥物中的用途。
IL-24-Tat PTD融合蛋白在制備治療肺癌藥物中的用途。IL-24-Tat PTD融合蛋白在制備治療惡性黑色素瘤藥物中的用途。有效成分IL-24-Tat PTD融合蛋白制備治療宮頸癌藥物、制備治療肺癌藥物、制備治療惡性黑色素瘤藥物用常規藥用制劑的形式來使用。所述的藥用常規制劑含作為活性成分的IL-24-Tat P TD融合蛋白，該活性成分在制劑中與藥學上可接受的載體如適宜于靜脈注射給藥的有機或無機固體或液體賦形劑混合，在制劑中，活性成分的IL-24-Tat PTD融合蛋白的質量含量為1 % 95 %，優選的質量含量為5 % 90 %。本發明采用Tat PTD與IL-24基因融合，構成IL-24-Tat PTD融合蛋白，提高IL-24 進入腫瘤細胞內，從而增強其抗腫瘤活性。本發明通過在IL-24的碳末端加上一個來源HIV Tat蛋白中一個蛋白轉導結構域(Tat Protein transduction domain, Tat PTD)小肽,該 Tat PTD小肽由11氨基酸(YGRKKRRQRRR)組成。
圖1是IL-24-TatPTD融合蛋白原核表達純化的結果。圖2是原核表達的IL-24-Tat PTD融合蛋白對宮頸癌細胞系Hela生長抑制結果。圖3是原核表達的IL-24-Tat PTD融合蛋白對肺癌腫瘤A549生長抑制結果。圖4是原核表達的IL-24-Tat PTD融合蛋白對黑色素瘤細胞系B16F10-G5_luc生長抑制結果。圖5是表達IL-24-Tat PTD腺病毒載體在體內抑制腫瘤生長結果。 具體實施方案下面結合附圖和實施例對本發明進一步詳細說明，但本發明不限于這些實施例。實施例1本實施例的IL-24融合蛋白，是由IL-24與Tat PTD小肽兩部分所組成的融合蛋白，Tat PTD小肽位于IL-24的碳末端，Tat PTD小肽由11氨基酸組成，序列為YGRKKRRQRRR。IL-24-Tat PTD融合蛋白全長基因序列如下ATCGATatgaattttcaacagaggctgcaaagcctgtggactttagccagacccttctgccctcctttg ctggcgacagcctctcaaatgcagatggttgtgctcccttgcctgggttttaccctgcttctctggagccaggtatcaggggcccagggcc aagaattccactttgggccctgccaagtgaagggggttgttccccagaaactgtgggaagccttctgggctgtgaaagacactatgcaagctc aggataacatcacgagtgcccggctgctgcagcaggaggttctgcagaacgtctcggatgctgagagctgttaccttgtccacaccctgct ggagttctacttgaaaactgttttcaaaaactaccacaatagaacagttgaagtcaggactctgaagtcattctctactctggccaacaacttt gttctcatcgtgtcacaactgcaacccagtcaagaaaatgagatgttttccatcagagacagtgcacacaggcggtttctgctattccggagagc attcaaacagttggacgtagaagcagctctgaccaaagcccttggggaagtggacattcttctgacctggatgcagaaattctacaagctcGGTGGAGGTTCTTatggtcgtaagaaacgacgccaacggcgacgttgaACTAGTA其相應的氨基酸序列如下MNFQQRLQSLWTLARPFCPPLLATASQMQMVVLPCLGFTLLLWSQVSGAQGQEFHFGPCQVKGVVPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAESCYLVHTLLEFYLKTVFKNYHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDSAHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKLGGGSYGRKKRRQRRR上述IL-24-Tat PTD融合蛋白的構建方法步驟如下1、人IL-24-Tat PTD融合基因的構建采用聚合酶鏈式反應以人IL-M基因為模板擴增獲得IL-24-Tat PTD融合基因。弓丨物序列如下:P1 :IL-24 Clal for AATCGATatgaattttcaacagaggctgcaaag ；P2 IL-24 TatPTD SpeI Back :tactagttcaacgtcgccgttggcgtcgtttcttacgaccatAAGAACCTCCAC Cgagcttgtagaatttctgcatc。聚合酶鏈式反應擴增條件是94°C、30秒，98°C、10秒，55°C、15秒，72°C、15秒，28 個循環。聚合酶鏈式反應產物經質量分數為1. 0%的瓊脂糖電泳后回片段即獲得IL-24-Tat PTD融合基因片段。將聚合酶鏈式反應獲得IL-24-Tat PTD融合基因片段與pGEM_T easy 載體連接。連接條件是2μ 1酶切純化片段，1μ 1 10XΤ4連接酶緩沖液，0.5 μ IpGEM-T easy載體，0. 5 μ 1 Τ4連接酶，6 μ 1三蒸水，16°C連接過夜，將連接產物轉化感受態的DH5 α 細胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板中。挑取菌落接種到含有IOOyg/ ml的氨芐青霉素的LB培養液中，14 16小時后，經堿性裂解法提取質粒DNA，通過酶切及測序鑒定陽性克隆。將所獲得陽性克隆分別命名為PGEMT/IL-M-Tat PTD。2、IL-M-Tat PTD融合蛋白基因的原核表達將pGEMT/IL-M Tat PTD通過ClaI和SpeI酶切并回收片段，與經同樣酶切處理的原核表達載體pGEX4-3-6His載體連接。連接條件是2 μ 1酶切純化片段，1 μ 1 10ΧΤ4 連接酶緩沖液，Iul酶切載體，0. 5 μ 1 Τ4連接酶，5. 5 μ 1三蒸水。連接產物采用與上述同樣的方法轉化、提取質粒DNA、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pGEX4-3-IL-M-Tat PTD_6His。將鑒定的陽性重組質粒pGEX4-3-IL-M-Tat PTD_6His轉化大腸桿菌BL21 (DE3)， 37°C過夜。挑取陽性克隆接種于含lOOyg/mL氨芐霉素的LB培養基中，37°C培養過夜，次日，按照1 100的接種量接入含100yg/mL氨芐霉素的新鮮LB培養液中， 37 °C培養至OD6ciciIim值為0. 6時，加入異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropyl β -D-l-Thiogalactopyranoside, IPTG)至濃度為 lmmol/L，16°C 225r/min 誘導表達 6-20 小時分別檢測目的蛋白的表達，以確定蛋白誘導表達的最佳時間點。以16°C 225r/min, IPTG誘導培養16小時進行培養。7000r/min離心10分鐘收集菌體，棄上清，無菌水洗滌，7000r/min離心10分鐘收集菌體，棄上清，重復兩次。以1 10 的比例加入破菌液(50mM磷酸二氫鈉，300mM氯化鈉，IOmM咪唑，pH = 8. 0)，同時加入溶菌酶至終濃度為lmg/mL，充分吹打，置4°C裂解30分鐘。用功率為100W、超聲波3秒，停10秒， 每次5分鐘進行超聲波冰浴破菌，重復4次，至溶液清亮。超聲后的菌液4°C，15，OOOg離心 1小時，棄沉淀。取上清，按鎳柱與上清的體積比為1 10加入鎳柱，置于旋轉搖床中4°C 結合1小時，結合液用重力流法進行純化，結合液加入重力柱中，待溶液滴盡后，加入5倍柱床體積的洗滌液(50mM磷酸二氫鈉，300mM氯化鈉，20mM咪唑，pH = 8. 0)，棄流出液，然后加入2倍柱床體積的洗脫液(50mM磷酸二氫鈉，300mM氯化鈉，250mM咪唑，pH = 8. 0)，收集流出液。將流出液裝入透析袋，用500mL、0. IM磷酸鹽內透析1小時，共透析4次，0. 22 μ m濾器過濾滅菌，NanodroplOOO檢測蛋白含量，并進行SDS-PAGE檢測純化的蛋白。檢測結果見圖1。3、IL-24融合蛋白基因腺病毒載體的制備帶有IL-24-Tat PTD 融合蛋白的 pGEMT/IL_24_Tat PTD 載體經 ClaI 與 SpeI 雙酶切后回收目的片段，然后與經ClaI與SpeI雙酶切的腺病毒El穿梭載體pacAd5CMV K-N pA 連接后轉化獲得陽性克隆，經酶切鑒定獲得陽性克隆即為IL-24融合蛋白基因的腺病毒穿梭載體，所獲得陽性克隆載體經》ιοΙ與NotI雙酶切后獲得片段，與經MlI與NotI雙酶切后的PAd5-E4-PGK-miniCMV-eGFP-Fiber-RGD載體連接后轉化感受態細胞，經酶切鑒定得到陽性克隆即為攜帶IL14融合蛋白基因用于腺病毒載體E4修飾的穿梭載體。將用于腺病毒載體E4修飾的攜帶IL-M融合蛋白基因的穿梭載體經BioI線性化后與經SwaI酶切線性化后的pCRAd5-baClibone在大腸桿菌BJ5183中同源重組獲得陽性克隆即為攜帶IL-M融合蛋白基因的腺病毒載體。將I^acI線性化的攜帶IL-24融合蛋白基因的腺病毒載體轉染HEK293細胞，7 10天收獲病毒原液，經過進一步擴增及CsCl純化獲得攜帶IL-24-Tat PTD融合蛋白基因的腺病毒。純化得到病毒原液命名為CRAd5-RGD. IL-24-Tat PTD，通過0擬60nm測得病毒滴度 (pt/mL)分為 5. 3 X IO12。實施例2IL-24融合蛋白，是由IL-24與RAKRRQRRR小肽兩部分所組成的融合蛋白， RAKRRQRRR小肽位于IL-24的碳末端。其構建方法與實施例1相同。實施例3IL-24融合蛋白，是由IL-24與RKARRQRRR小肽兩部分所組成的融合蛋白， RKARRQRRR小肽位于IL-24的碳術端。其構建方法與實施例1相同。實施例4IL-24融合蛋白，是由IL-24與RRRRRRRRR小肽兩部分所組成的融合蛋白， RRRRRRRRR小肽位于IL-24的碳末端。其構建方法與實施例1相同。實施例5 IL-24融合蛋白，是由IL-M與RQIKIWFQNRRMKWKK小肽兩部分所組成的融合蛋白， RQIKIffFQNRRMKffKK小肽位于IL-24的碳末端。其構建方法與實施例1相同。實施例6IL-24融合蛋白，是由IL-M與AGYLLGKINLKALAALAKKIL小肽兩部分所組成的融合蛋白，AGYLLGKINLKALAALAKKIL小肽位于IL-24的碳末端。其構建方法與實施例1相同。
7
實施例7IL- 24融合蛋白，是由IL-24與RVIRVWFQNKRCKDKK小肽兩部分所組成的融合蛋白， RVIRVffFQNKRCKDKK小肽位于IL-24的碳末端。其構建方法與實施例1相同。實施例8有效成分IL-24-Tat PTD融合蛋白制備治療宮頸癌藥物用常規藥用制劑的形式來使用。所述的藥用常規制劑含作為活性成分的IL-24-Tat PTD融合蛋白，該活性成分在制劑中與藥學上可接受的載體如適宜于靜脈注射給藥的有機或無機固體或液體賦形劑混合， 在制劑中，活性成分的IL-24-Tat PTD融合蛋白的含量為 95%。實施例9有效成分IL-24-Tat PTD融合蛋白制備治療肺癌藥物用常規藥用制劑的形式來使用。所述的藥用常規制劑含作為活性成分的IL-24-TatPTD融合蛋白，該活性成分在制劑中與藥學上可接受的載體如適宜于靜脈注射給藥的有機或無機固體或液體賦形劑混合，在制劑中，活性成分的IL-24-Tat PTD融合蛋白的含量為 95%。實施例10有效成分IL-24-Tat PTD融合蛋白制備抑制惡性黑色素瘤藥物用常規藥用制劑的形式來使用。所述的藥用常規制劑含作為活性成分的IL-24-Tat PTD融合蛋白，該活性成分在制劑中與藥學上可接受的載體如適宜于靜脈注射給藥的有機或無機固體或液體賦形劑混合，在制劑中，活性成分的IL-24-Tat PTD融合蛋白的含量為 95%。為了驗證本發明的有益效果，發明人采用本發明實施例1制備IL-24-Tat PTD融合蛋白進行了藥效試驗，各種試驗情況如下1、IL-24Tat PTD融合蛋白體外抑制宮頸癌細胞系Hela生長采用MTT方法檢測GST-IL-24和GST_IL-24_Tat蛋白對宮頸癌細胞系Hela增殖的影響，具體操作如下接種細胞取對數生長期的人宮頸癌細胞(Hela)，0. 胰酶消化后接種于96孔板，每孔細胞數為1X103。蛋白處理將2種蛋白按照0. 1、0. 2、0. 4、0. 8、1. 6mmol/L不同梯度設置處理組，每組設3個復孔。以IXPBS處理組作為對照。48小時后進行細胞下游檢測。顯色培養48小時后加入5g/L的MTT 20uL,繼續培養4小時。讀數去掉培養基，加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μ L，置于水平搖床上，室溫作用10 分鐘。酶標儀570nm處測得吸光值。取各孔光吸收值，將所得結果用SPSS 13. 0軟件的One Way ANOVA進行統計分析，各組間差異比較采用方差分析。實驗結果見圖2。由圖2可見， 所表達的GST-IL-24-Tat PTD融合蛋白對宮頸癌細胞系Hela生長具有明顯的抑制作用。2、IL_24Tat PTD融合蛋白體外抑制人肺癌細胞生長接種細胞取對數生長期的人肺癌細胞(A549)，0. 1 %胰酶消化后接種于96孔板， 每孔細胞數為1X103。其它實驗步驟與實驗1相同。實驗結果見圖3。由圖3可見，所表達的GST-IL-24-Tat PTD融合蛋白對人肺癌細胞生長具有明顯的抑制作用。3、IL_24Tat PTD融合蛋白體外抑制小鼠黑色素瘤細胞生長接種細胞取對數生長期的小鼠黑色素瘤肺轉移細胞，0. 胰酶消化后接種于96孔板，每孔細胞數為IX 103。其它實驗步驟與實驗1相同。實驗結果見圖4。由圖4可見，所表達的GST-IL-24-Tat PTD融合蛋白對小鼠黑色素瘤細胞生長具有明顯的抑制作用。4、表達 IL-24-Tat PTD 腺病毒(CRAd5_RGD. IL-24-Tat PTD)對惡性黑色素瘤的體內治療作用取處于對數生長期的B16F10-G5-1UC黑色素瘤細胞，用PBS洗滌后經0.2%胰酶消化，PBS吹打懸浮細胞，4°C，2000g離心10分鐘，棄上清；用無血清培養液重懸細胞，并用血球計數板計數，制備成6. 6 X IOVmL的細胞懸液，并按1毫升每支分裝至1. 5毫升離心管中。取健康純種4-6周齡Balb/c雌性裸鼠49只，在本實驗室適應性飼養一周后進行動物實驗，動物試驗根據國家試驗動物的護理和使用指導說明實施。先用75%酒精在其右后肢消毒，進行乙醚吸入麻醉，細胞懸液搖勻后進行皮下注射，按150 μ L(細胞總數為 IXlO6)/只進行注射。每天觀察皮下成瘤情況。皮下接種4天，裸鼠皮下出現直徑為5毫米的黑色硬結，即為種植瘤生長。49只裸鼠隨機分成7組，每組7只。對照病毒Ad5.eGFP、 CRAd5. eGFP、CRAd5-RGD. IL-24 和 CRAd5_RGD. IL-24-Tat PTD 重組腺病毒基因治療抗腫瘤實驗方案如下各組均使用瘤體內注射，每只裸鼠注射病毒總量均為2X109空斑形成單位 (PlaqueForming Units, PFU)，隔日注射1次，共注射4次，每次劑量為5X IO8PFU0開始治療后，每隔一天進行移植瘤的體積測量，根據移植瘤的長徑(a)、短徑(b)，按公式計算瘤體體積(V = aXb2/2)，繪制腫瘤體積-時間變化曲線。以對照組裸鼠平均體積超過3，OOOmm3 時，作為實驗終點，實驗結果見圖5。由圖5可見，各組裸鼠皮下種植瘤的體積均有增加，但在同一個檢測時間點比較(注射腫瘤細胞后的第16天)，CRAd5-RGD. IL-24-Tat PTD組比對照組Ad5. eGFP的腫瘤生長緩慢，說明CRAd5_RGD. IL-24-Tat PTD具有更強腫瘤抑制作用。
權利要求
1.一種IL-24-Tat PTD融合蛋白，它是由IL-24與小肽兩部分所組成的融合蛋白， 小肽位于IL-24的碳末端，其特征在于所說小肽是Tat PTD,由11氨基酸組成，序列為 YGRKKRRQRRR。
2.—種權利要求1的IL-24-Tat PTD融合蛋白的構建方法，其特征在于由下述步驟組成(1)攜帶IL-M融合蛋白基因的構建采用聚合酶鏈式反應以人IL-M基因為模板擴增獲得IL-M融合蛋白基因，將所擴增的該基因產物經質量分數為1.0%的瓊脂糖電泳回片后與pGEM-T easy載體連接，將連接產物轉化感受態的DH5ci細胞，涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板中，挑取菌落接種到含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養液中，14 16小時后，經堿性裂解法提取質粒DNA，通過酶切及測序鑒定陽性克隆，獲得陽性克隆為帶有IL-M融合蛋白基因的質粒載體；(2)IL-24-Tat PTD融合蛋白基因的原核表達將攜帶IL14融合蛋白基因的載體通過ClaI和SpeI酶切并回收片段，與經同樣酶切處理的原核表達載體pGEX4-3-6His連接，連接產物轉化感受態細胞，經酶切鑒定獲得陽性克隆，即為攜帶IL-M融合蛋白基因的原核表達載體；將攜帶IL14融合蛋白基因的原核表達載體轉化大腸桿菌BL21，經異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷誘導表達目的蛋白，經M柱純化后獲得IL-24融合蛋白；檢測蛋白含量，并進行SDS-PAGE檢測純化的蛋白；(3)IL-24融合蛋白基因腺病毒載體的制備帶有IL-24-Tat PTD融合蛋白的pGEMT/1L-M-Tat PTD載體經ClaI與SpeI雙酶切后回收目的片段，然后與經ClaI與SpeI雙酶切的腺病毒El穿梭載體pacAd5 CMV K-N pA連接后轉化獲得陽性克隆，經酶切鑒定獲得陽性克隆即為IL14融合蛋白基因的腺病毒穿梭載體，所獲得陽性克隆載體經XhοΙ與NotI雙酶切后獲得片段，與經MlI與NotI雙酶切后的pAd5-E4-PGK-miniCMV-eGFP-Fiber-RGD載體連接后轉化感受態細胞，經酶切鑒定得到陽性克隆即為攜帶IL-24融合蛋白基因用于腺病毒載體E4修飾的穿梭載體；將用于腺病毒載體E4修飾的攜帶IL-M融合蛋白基因的穿梭載體經BioI線性化后與經SwaI酶切線性化后的pCRAd5-baClibone在大腸桿菌BJ5183中同源重組獲得陽性克隆即為攜帶IL-24融合蛋白基因的腺病毒載體；將PacI線性化的攜帶IL-M融合蛋白基因的腺病毒載體轉染HEK293細胞，7 10天收獲病毒原液，經過進一步擴增及CsCl純化獲得攜帶IL-M融合蛋白基因的腺病毒。
3.權利要求11L-M-TatPTD融合蛋白在制備治療宮頸癌藥物中的用途。
4.權利要求11L-M-TatPTD融合蛋白在制備治療肺癌藥物中的用途。
5.權利要求11L-M-TatPTD融合蛋白在制備治療惡性黑色素瘤藥物中的用途。
全文摘要
一種IL-24-Tat PTD融合蛋白，它是由IL-24與Tat PTD小肽兩部分所組成的融合蛋白，Tat PTD小肽由11氨基酸(YGRKKRRQRRR)組成，位于IL-24的碳末端。構建方法包括攜帶IL-24融合蛋白基因的構建、IL-24-Tat PTD融合蛋白基因的原核表達、IL-24融合蛋白基因腺病毒載體的制備步驟。IL-24-Tat PTD融合蛋白用于制備治療宮頸癌藥物、制備治療肺癌藥物、制備治療惡性黑色素瘤藥物。
文檔編號A61K47/48GK102153657SQ20111000973
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月18日 優先權日2011年1月18日
發明者劉世海, 夏海濱 申請人:陜西師范大學