一種肝素酶Ⅱ融合蛋白及其編碼基因與表達方法

專利名稱：一種肝素酶Ⅱ融合蛋白及其編碼基因與表達方法
技術領域：
本發明涉及基因工程和發酵工程領域中一種肝素酶Ii融合蛋白及其編碼基因與 表達方法。
背景技術：
肝素酶(h印arinase)是一類作用于肝素Q^parin)或者硫酸乙酰肝素O^paran sulfate)的多糖裂解酶，在許多種微生物中發現，包括棒桿菌Corynebacterium sp.(高 寧國等，肝素酶產生菌的篩選及發酵條件，微生物學報1999 Vol. 39 :64_67)、鞘胺醇 桿菌Sphingobacterium sp.(高寧國等，鞘胺醇桿菌肝素酶的產生，微生物學報2003 Vol. 43 :813-816)、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis (王忠彥，肝素酶產生菌的篩選及 其粗酶性質的研究，四川大學學報(自然課學版)2002 Vol. 39:777-779)、環狀芽孢桿菌 Bacillus circulans(Yasutaka Tahara et al. , Purification and characterization of heparinase that degrades both heparin and heparin sulfate from Bacillus circulans BioSci.Biotechnol. Biochem. 2002 Vol. 66 :1181_1184)、解肝素擬桿 菌 Prevotella heparinolytica(Kazuyuki Sugahara et al. ， Characterization of heparinase from an oral bacterium Prevotella heparinolytica J.Biochem. 1998 Vol. 123 :283-288)、糞便擬桿菌 Bacteroides stercoris HJ-15 (Dong Hyuu Kim et al.， Purification and characterization of a novel heparinase from Bacteroides stercoris HJ-15 J. Biochem. 2000 Vol. 128 :323_328)和月干素黃桿菌 Flavobacterium hepar inum (Sas i ekharan, R. 1991 Ph. D. Thesis，Havards University)。但是來自月干素黃桿 菌的肝素酶是商業化的唯一來源。肝素酶的研究具有十分重要的意義(Sasiekharm，R. 1991 Ph. D. Thesis， Havard University ；Sasiekharan, R. et al.，A comparative analysis of the primary sequences and characteristics of heparinase I， II and III from Flavobacterium heparinum Biochemical and Biophysical Research Communication 1996 Vol. 229 770-777)肝素酶是多糖裂解酶的一種，用于研究肝素酶及其底物多糖肝素之間的相互作 用，有助于闡明多糖裂解酶的作用機制；肝素酶可以用于解析肝素等復雜粘多糖的結構及 其生物學功能；肝素酶可以用于解析人體內的凝血和抗凝血機制；肝素酶可以用作臨床血 液肝素化的去除，防止手術后出血；肝素酶用于PCR反應前血液制品的處理；肝素酶可以用 于制備低分子的抗凝血藥物低分子量肝素。來自肝素黃桿菌的肝素酶主要有三種，分別命名為肝素酶I (EC 4. 2. 2. 7)、肝素酶 II (No EC code)和肝素酶 III (EC 4. 2. 2. 8) (Robert J. Linhardt et al. , Purification and characterization of heparin lyases from Flavobacterium heparinum JBC 1992Vol. 267 =24347-24355)。肝素酶I主要作用于肝素，分子量43kDa，肝素酶II作用于 肝素和硫酸乙酰肝素，分子量85kDa，肝素酶III主要作用于硫酸乙酰肝素，分子量73kDa。 其中，對肝素酶I的研究較多，而對肝素酶II和III的研究相對較少。
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硫酸乙酰肝素蛋白聚糖是一種結構復雜的酸性蛋白聚糖，參與體內一系列的生理 和病理過程，如胚胎發育、神經突生長、血管形成、組織修復、炎癥、自身免疫、腫瘤生長和轉 移等(Kjellen L，Lindahl U· Proteoglycans-Structures and interactions Annu Rev Biochem,1991 Vol. 60 440-443 ；Bernfield M， Gotte M， Park P W， et al. Functions of cell surface heparan sulkfate proteoglycans Annu Rev Biochem，1999，68 :726_729)。 硫酸乙酰肝素的酶解是其發揮上述作用的主要因素。酶解后可以釋放并激活各種與它結合 的活性分子，從而影響各種生理及病理過程。因此，降解硫酸乙酰肝素的酶是至關重要的調 節因子，研究該酶(肝素酶II)具有重要的理論意義和應用價值。然而肝素酶II通常是從 肝素黃桿菌發酵液中提純獲得的，肝素黃桿菌生產肝素酶II的同時產生肝素酶I、III和四 種軟骨素酶(chondroitinase B, C，ABC, AC)，使肝素酶II的分離純化變得復雜，通常需要 經過多步的色譜純化，收率很低。肝素黃桿菌增長速度慢，肝素酶的生產穩定性差，而且，產 肝素酶需要價格昂貴的肝素誘導，增加了酶的成本，因而肝素酶II的異源重組表達是替代 肝素黃桿菌生產肝素酶Π的有效可行的方案。然而對肝素酶II的異源重組表達研究非常有限，到目前為止，文獻報道只有傅文 彬和Su等人對其進行了研究。傅文彬等人利用pET表達系統實現了肝素酶II在大腸桿 菌中的重組表達，SDS-PAGE電泳結果顯示有目的蛋白條帶，但表達量很低，且容易形成包 涵體，可溶性肝素酶活性僅為50U/L A_(傅文彬，余曉等，黃桿菌肝素酶II的克隆與表達， 食品與藥品，2007，Vol. 91-4) ；Su研究中所表達的肝素酶II活性有所提高，但是需要多 步純化，致使純化費用比較高，不利于工業化應用(Su H，blain F，Musil RA, Zimmermann JJF, Gu K, Bennett DC. Isolation and Expression in Escherichia coli of hepB and hepC, Genes Coding for the Glycosaminoglycan-Degrading Enzymes Heparinase II and Heparinase III, Respectively, from Flavobacterium heparinum. Appl. Environ. Microbiol. 1996，62 :2723-2734)。研究發現，通過將麥芽糖結合蛋白(MBP)與酶的融合 可以顯著提高酶重組表達的可溶性。本研究小組利用融合蛋白技術將MBP融合到肝素酶 I的氮端并低溫誘導顯著的提高了肝素酶I重組表達的可溶性。此項工作已經申請專利， 專利號為200410038098. 6。而且來自大腸桿菌的天然的MBP能夠與麥芽糖特異吸附，參與 大腸桿菌對麥芽糖的轉運和利用。MBP不但能與直鏈淀粉結合，實現親和分離，也能與馬 鈴暮淀粉實現親禾口分離(Usha Srinivasan et al. ，A convenient method for affinity purification of maltose binding protein fusions. Journal of Biotechnology 1998 Vol。62 163-167 ；廉德君等，一種改進的融合蛋白親和層析純化方法，生物化學與生物進 展1998 Vol. 25 :283_284)，從而可以大大降低酶的分離純化成本，有利于實現工業化規模 的分離純化。

發明內容
本發明的目的在于提供一種肝素酶II融合蛋白及其編碼基因。本發明提供的融合蛋白(命名為MBP-H印B)，是如下a)或b)的蛋白a)序列表中序列2的第1-1118所示的氨基酸序列組成的蛋白質；b)在序列表中序列2的氨基酸序列經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨 基酸且具有肝素酶II活性的由a)衍生的蛋白質。
該融合蛋白MBP-H印B中的MBP的氨基酸序列如SEQ ID No 2的自氨基酸第1-367 所示；該融合蛋白中的H印B的氨基酸序列如SEQ ID No 2的自氨基酸第372-1118所示。上述融合蛋白的編碼基因也屬于本發明的保護范圍之內。進一步，上述基因是如下1)或2)或3)1)編碼序列是序列表中序列1 ；2)在高嚴謹條件下與序列表中序列1的核苷酸序列雜交且編碼權利要求1所述蛋 白的核苷酸序列；3)與序列表中序列1所示的核苷酸序列具有95%以上的同源性且編碼權利要求 1所述蛋白的核苷酸序列。序列1中，MBP的編碼區是序列1的自5，端第1-1101位的堿基；H印B的編碼區是 序列1的自5’端第1114-3360位的堿基。所述高嚴謹條件是指，將雜交膜置于預雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液， pH7. 2,7% SDS)中，65°C預雜交30min ；棄預雜交液，加入雜交液(0. 25mol/L磷酸鈉緩 沖液，pH7.2,7% SDS，同位素標記的核苷酸片段)，65°C雜交12hr ；棄雜交液，加入洗膜 液I (20mmol/L磷酸鈉緩沖液，ρΗ7· 2,5% SDS)，65°C洗膜2次，每次30min ；加入洗膜液 II (20mmol/L 磷酸鈉緩沖液，ρΗ7· 2,1% SDS)，65°C洗膜 30min。含有上述基因的重組載體或轉基因細胞系也屬于本發明的保護范圍之內。進一步，上述重組載體是通過以下步驟構建的將序列表中序列1所示的DNA片段插入質粒pMAL-c2x的多克隆位點，得到重組表 達載體。含有上述基因的重組菌也屬于本發明的保護范圍之內。進一步，上述重組菌是含有上述的重組載體的重組大腸桿菌。上述重組大腸桿菌的宿主優選是TBl。本發明的另一目的在于提供一種生產肝素酶II的方法。本發明提供的方法，是將上述的重組菌誘導培養，表達得到肝素酶II。上述誘導培養條件是0. Ol-ImM的IPTG，10_42°C誘導培養15-28小時；優選是 0. 24mM的IPTG，15°C誘導培養24小時。上述誘導培養的培養基的溶劑是水，溶質是10g/L NaCl, 5g/L酵母提取物，10g/L 蛋白胨，(質量百分比)乙醇，0.6mg/L氯霉素和100 μ g/L氨芐青霉素。本發明構建了防止包涵體形成的融合表達載體，并通過amylose樹脂實現一步 親和分離。通過融合蛋白首次實現肝素酶II在大腸桿菌中90%以上有活性、正確折疊的 可溶蛋白形式存在；大腸桿菌TBI (pMAL-hepB)在37攝氏度培養2. 5小時后，加入0. 24mM IPTG，誘導溫度15攝氏度，培養基中酵母粉濃度0. 5%，乙醇1%，生產的肝素酶II酶活可 達118. 4IU/L發酵液，表達量可達179mg/L發酵液，比酶活可達0. 66IU/mg。本發明還可通 過親和分離實現了該融合蛋白的一步純化。本發明通過改變IPTG濃度，加入IPTG時間，誘 導溫度，培養基成分等優化提高了融合蛋白的產量和肝素酶活。本發明將在肝素酶II的生 產中發揮重要作用。


圖1為表達載體pMAL-h印B的構建過程示意圖。圖2為從肝素黃桿菌中PCR擴增得到的肝素酶II基因電泳圖譜。圖3為轉化子PCR驗證電泳圖譜。圖4為轉化子酶切驗證電泳圖譜。圖5為融合質粒pMAL-h印B宿主優化結果(a)為0D600、粗酶液酶活以及蛋白濃 度比較；(b)為粗酶液比酶活比較。圖6為大腸桿菌TBl/pMAL-h印B工程菌株表達MBP-HepB的SDS-PAGE圖。圖7為融合蛋白MBP-HEPB通過直鏈淀粉樹脂親和分離的SDS-PAGE電泳圖譜。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。所述引物合成及測序工作均由 Invitrogen生物技術有限公司完成；所有的限制性內切酶均購自New England Biolabs公 司；Pfu酶及dNTP購自TaKaRa公司；所有感受態細胞(如DH5 α、ΤΒ1和ToplO)購自北京 全式金生物技術有限公司；肝素酶II酶活測定底物肝素購自河北常山生化藥業股份有限 公司，其它的化學藥品均為一般分析純試劑，購自國藥集團化學試劑有限公司。實施例1、肝素酶II融合蛋白MBP-H印B的表達一、去除信號肽的肝素黃桿菌肝素酶II編碼序列的克隆
表達載體pMAL-hepB的構建過程如圖1所示，具體過程如下1、引物的設計及合成經Genbank查詢得至Ij月干素黃桿菌(Flavobacterium heparinum)月干素醇II 白勺 DNA )ψ 歹Ij (Su, H. ， Blain, F. ， Musil, R. Α. ， Zimmermann, J. J. ， Gu, K. and Bennett, D. C. Isolation and expression in Escherichia coli of hepB and hepC, genes coding for the glycosaminoglycan-degrading enzymes heparinase II and heparinase III， respectively, from Flavobacterium heparinum. Appl. Environ. Microbiol. 1996,62, 2723-2734)，再根據去除編碼信號肽堿基的肝素黃桿菌肝素酶II的DNA序列設計引物，并 在引物序列中引入限制性內切酶Sac I和Pst I的識別位點，所用的上下游引物分別為上游引物Pl :5，-ATATGAGCTCGCAAACCAAGGCCGATGTG-3‘(帶下劃線的堿基為 SacI 的酶切位點)，下游引物P2 5’ -CATACTGCAGTCATTATCTCAAAAAACGGTAGGTTCCTTC-3’ (帶下劃線的 堿基為PstI的酶切位點)，擴增后，即分別引入Sac I和Pst I酶切位點。2、PCR擴增去除信號肽的肝素黃桿菌肝素酶II的編碼序列PCR擴增的反應體系為50ng肝素黃桿菌基因組DNA模版，IOOpmol每種引物，1 X 擴增緩沖液(北京天為生物技術有限公司)，200 μ mol/L每種dNTP，1單位高保真Pfu酶； 擴增程序為95攝氏度變性5分鐘，50、52、54、56、58或60攝氏度引物退火1分鐘，72攝氏 度延伸3分鐘，30個循環后，72攝氏度延伸10分鐘結束反應。該PCR結果如圖2所示，表 明擴增得到了 2. 2kb的肝素酶II基因片段，測序表明產物的核苷酸序列如序列表中序列 1的第1114位-3360位所示(命名為H印B)。圖2中，泳道1_6分別為退火溫度為60、58、56、54、52或50攝氏度擴增結果，泳道M為分子量marker (條帶大小依次為10kb、8kb、6kb、 5kb、4kb、3kb、2kb、l. 5kb、lkb、800bp、500bp、300bp)，箭頭所指處為 2. 2kb 目標片段。3、構建含有目的片段的克隆載體參照試劑盒說明書進行操作，將步驟一中步驟2的PCR擴增的目的片段直接亞克 隆入載體pMD -19T Simple (TaKaRa公司)中，得到連接產物。4、轉化大腸桿菌及陽性克隆轉化子的篩選及測序將步驟3獲得的連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，具體方法為將10 μ 1 的連接產物與100 μ 1的大腸桿菌DH5 α感受態細胞混勻，冰浴30分鐘，42攝氏度熱激90 秒，冰浴10分鐘，然后加入800 μ 1含100 μ g/L氨芐青霉素的LB液體培養基(蛋白胨3g， 酵母提取物1. 5g, NaCl 3g，水285mL)中，180rpm、37攝氏度振搖60分鐘，涂于含100 μ g/ L氨芐青霉素的LB抗性培養平板(蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaCl 3g，瓊脂粉4.5g，水 285mL，16 μ 1 X-gal和4 μ 1 IPTG/平板)進行藍白斑篩選。37攝氏度培養12-20小時。挑 選白斑并以此為模版，用引物Pl和P2進行菌落PCR鑒定，PCR反應體系及反應條件與步驟 2相同。反應結束后，對擴增產物進行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可含轉化子的陽性克隆。 將篩選得到的陽性克隆轉至5mL含0. 05mg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，37攝氏度、 220rpm振搖12小時，將菌液交由irwitrogen生物技術有限公司進行測序，將含有具有序列 表中序列1的第1114-3360位核苷酸序列的肝素酶II蛋白編碼基因的pMD _19T Simple 重組載體命名為pMD-19-h印B。二、重組大腸桿菌表達載體的構建以pMD-19-h印B質粒為模版，用引物Pl和P2進行PCR擴增肝素黃桿菌肝素酶II 的基因，PCR反應體系及反應條件與步驟一中2相同。將pMAL-c2x載體(購自美國New England Biolabs公司)和PCR產物(以pMD_19_h印B質粒為模版的擴增產物)分別用 Sac I和Pst I雙酶切，用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)連接，轉化DH5 α，以Pl和Ρ2為 引物，通過菌落PCR篩選轉化子(如圖3所示)，提取可得到2.2kb PCR產物的轉化子中的 pMAL-c2x重組載體，分別通過Sac I和Pst I雙酶切驗證(如圖4所示)。圖3中M為分 子量 marker (條帶大小依次為 IOkb、8kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1. 5kb、Ikb、800bp、500bp、 300bp)，泳道1、2為PCR驗證的轉化子，箭頭所指處為肝素酶II基因條帶。圖4中M為分 子量 marker (條帶大小依次為 IOkb、8kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1. 5kb、Ikb、800bp、500bp、 300bp)，泳道1、2為重組質粒pMAL-h印B雙酶切后電泳圖，箭頭所指處為肝素酶II基因條 帶，泳道3、4為正確連接的重組質粒pMAL-h印B，泳道5、6為原始質粒pMAL-c2x。將通過 Sac I和Pst I雙酶切得到的2. 2kb片段的質粒進行測序，將含有具有序列表中序列1的 第1114-3360位核苷酸序列的肝素酶II融合蛋白編碼基因的pMAL_C2x重組載體命名為 pMAL-h印B。在pMAL-h印B中，h印B基因與IacZa基因之間有兩個連續的終止密碼TAATGA， 從而能夠有效地終止蛋白翻譯不會表達IacZa蛋白。三、肝素酶II融合蛋白MBP-H印B的表達提取步驟二中含有pMAL-hepB的大腸桿菌DH5 α中的質粒，按照常規方法轉化 大腸桿菌 TBI、ToplO、JM109、BL21(DE3)、BL21(DE3) (plysS)。除 Ε. coli TBI 感受態細 胞制作按照《分子克隆實驗指南》中氯化鈣法制備大腸桿菌感受態細胞的說明完成外， E. coliT0P10、E. coli DH5a、E.coli JM109、E. coli BL21 (DE3)、Ε· coli BL21(DE3) (plysS)感受態細胞均購自北京全式金生物技術有限公司。經過氨芐青霉素篩選和利用步驟一中 步驟1提供的引物進行菌落PCR鑒定，得到含有pMAL-h印B的大腸桿菌TBl、ToplO、JM109、 BL21 (DE3)和 BL21 (DE3) (plysS)，即 TBl/pMAL-h印B、ToplO/pMAL_h印B、JM109/pMAL_h印B、 BL21 (DE3) /pMAL-hepB, BL21 (DE3) (plysS) /pMAL-hepB 禾Π DH5 α /pMAL-hepB 作為表達 MBP-HepB的工程菌。以質粒 pMAL-c2x 轉化大腸桿菌 TBl、ToplO、JM109、BL21 (DE3)、BL21 (DE3) (plysS) 和 DH5 α，得到空載體對照 TBl/pMAL-c2x、ToplO/pMAL-c2x、、JM109/pMAL-c2x、BL21 (DE3) / pMAL-c2x、BL21 (DE3) (plysS)/pMAL_c2x 和 DH5 α /pMAL_c2x。以下操作對上面的工程菌平行進行。將空載體對照和工程菌分別在含氨芐青霉素抗性的LB培養基(NaCl 10g/L，酵母 提取物為5g/L，蛋白胨10g/L，l% (質量百分比)乙醇，0.6mg/L氯霉素，含100yg/L氨芐 青霉素)37攝氏度培養2. 5小時后，加入終濃度為0.24mM IPTG 15攝氏度誘導24小時。 10000rpm，8分鐘離心收集菌體并用20mmol/L Tris-HCl (pH 7. 5)洗滌兩次，重懸至OD6tltl約 為8. 000附近。將上面OD6tltl約為8. 000重懸液進行超聲破碎(輸出功率為300W，每次超 聲3秒和間歇3秒的處理198次)，12000rpm, 30分鐘離心，超聲破碎后離心所得的上清液 即為粗酶液。酶活力(單位為IU/L)的檢測采用232nm的光吸收法，IIU的酶活定義為30 攝氏度每分鐘產生1 μ mol不飽和鍵的反應效力。取肝素底物溶液0. 5ml (25g/L肝素，40mM NaCl，3. 5mM CaCl2,17mM Tris-HCl, pH 7. 5)，加入上步中所得的粗酶液，其他體積以Tris 緩沖液補充，最終的反應體積為1. 5ml，測單位時間內在232nm的吸光度變化ΔΑ232。消光 系數ε = 3800ΜΛ比酶活(單位為IU/mg蛋白)的定義為酶活力與粗酶液蛋白濃度(單 位為mg/L)的比值。蛋白濃度監測采用常規的Bradford法。結果表明空載體對照菌株TBl/pMAL-c2x、ToplO/pMAL_c2x、JM109/pMAL_c2x、 BL21 (DE3)/pMAL-c2x、BL21 (DE3) (plysS)/pMAL-c2x 和 DH5 α /pMAL-c2x 誘導培養后無酶 活，其他工程菌均表達出了可溶性的MBP-H印B融合蛋白，其中在大腸桿菌TBI中的表達 效果最佳，結果如圖5所示無論從菌的OD值、酶活或者比酶活來看，TBl均要優于其它 宿主(TBI為宿主時OD值、酶活和比酶活分別為3.87、118.24IU/I^P0.66IU/mg)。并且 經過測序，TBl/pMAL-h印B、ToplO/pMAL-h印B、JM109/pMAL_h印B、BL21 (DE3)/pMAL-h印B、 BL21 (DE3) (plysS) /pMAL-hepB和DH5 α /pMAL-hepB表達出的蛋白的氨基酸序列均如序列 表SEQ ID No 2所示；并且該融合蛋白MBP-H印B的MBP的氨基酸序列如SEQ ID No 2的 自氨基酸第1-367所示；該融合蛋白MBP-IfepB的H印B的氨基酸序列如SEQ ID No 2的自 氨基酸第372-1118所示。對最佳宿主TBl表達的蛋白進行SDS-PAGE電泳取上步超聲破碎后離心所得的 上清液(粗酶液)40 μ 1做可溶蛋白組分SDS-PAGE電泳，取上述超聲破碎后離心所得的沉 淀來做不可溶蛋白組分SDS-PAGE電泳。結果如圖6所示，圖中M為marker(由上至下分 子量依次均為 230kDa、150kDa、100kDa、80kDa(紅色)、60kDa、50kDa、40kDa、30kDa、25kDa、 20kDa、15kDa、IOkDa)，1、2分別為空載體對照TBl/pMAL_c2x的不可溶蛋白組分和可溶蛋白 組分；3、4分別為大腸桿菌TBl/pMAL-h印B的不可溶蛋白組分和可溶蛋白組分，箭頭所指處 為融合蛋白MBP-H印B(123KDa)。實施例2、通過直鏈淀粉柱純化肝素酶II融合蛋白MBP-IfepB
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本發明利用的融合伙伴(fusion partner)麥芽糖結合蛋白MBP能夠與直鏈淀粉 親和吸附實現一步分離。具體的親和分離步驟如下將終濃度為0. 24mM IPTG誘導表達24 小時的菌體lOOmL，IOOOOrpm離心5分鐘；同時設未誘導表達的菌體對照。接著按以下兩個 方案分別操作方案一用柱平衡液Column buffer (20mM Tris-HCl, 200mM NaCl，pH7. 5)洗滌兩 次，重懸在5mL Column buffer中，進行超聲破碎(輸出功率為300W，每次超聲3秒和間歇 3秒的處理198次)。方案二 滲透壓沖擊。將菌體重懸在IOOmL osmotic shock buffer I中(20-40% 蔗糖，30mM Tris-HCl,lmM EDTA) 15分鐘，攪拌。IOOOOrpm離心10分鐘，然后重懸在等體積 0. 5mM硫酸鎂中，冰浴10-15分鐘，IOOOOrpm,離心10分鐘。離心后上清液以0. 5ml/min通過2ml預平衡的直鏈淀粉親和分離柱，通過 IOmMO. 5ml/min麥芽糖洗脫并收集。每一步取40 μ 1做SDS-PAGE，目標蛋白經過直鏈淀粉(amylose)樹脂吸附后，用 IOmM麥芽糖在1個柱體積下能夠將目標蛋白洗脫。結果如圖7所示，表明經過直鏈淀粉 樹脂一步純化后目標蛋白可占95%以上。圖7中，MSmarkeH由上至下分子量依次均為 230kDa、150kDa、100kDa、80kDa(紅色)、60kDa、50kDa、40kDa、30kDa、25kDa、20kDa、15kDa、 10kDa)，l為0. 24mM IPTG誘導的大腸桿菌TBI (pMAL-h印B)的可溶蛋白組分，2，3，4，5，6分 別為0.24mM IPTG誘導的大腸桿菌TBl(pMAL-h印B)經過直鏈淀粉樹脂吸附后用麥芽糖洗 脫收集的不同濃度的蛋白組分，箭頭所指為目標蛋白。
權利要求
一種蛋白，是如下a)或b)的蛋白a)序列表中序列2的第1 1118所示的氨基酸序列組成的蛋白質；b)在序列表中序列2的氨基酸序列經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且具有肝素酶II活性的由a)衍生的蛋白質。
2.權利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據權利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2)或3)1)編碼序列是序列表中序列1；2)在高嚴謹條件下與序列表中序列1的核苷酸序列雜交且編碼權利要求1所述蛋白的 核苷酸序列；3)與序列表中序列1所示的核苷酸序列具有95%以上的同源性且編碼權利要求1所 述蛋白的核苷酸序列。
4.含有權利要求2或3所述基因的重組載體或轉基因細胞系。
5.根據權利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體是通過以下步驟構建的將序列表中序列1所示的DNA片段插入質粒pMAL-c2x的多克隆位點，得到重組表達載體。
6.含有權利要求2或3所述基因的重組菌。
7.根據權利要求6所述的重組菌，其特征在于所述重組菌是含有權利要求4或5所 述的重組載體的重組大腸桿菌。
8.—種生產肝素酶的方法，是將權利要求6或7所述的重組菌誘導培養，表達得到肝素酶。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述誘導培養條件是0.Ol-ImM的IPTG， 10-42°C誘導培養15-28小時；優選誘導培養條件是0. 24mM的IPTG，15°C誘導培養24小 時。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于所述誘導培養的培養基的溶劑是水，溶 質是10g/L NaCl，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，(質量百分比)乙醇，0.6mg/L氯霉素和100 μ g/L氨芐青霉素。
全文摘要
本發明公開了一種肝素酶II融合蛋白及其編碼基因與表達方法。本發明提供的融合蛋白(命名為MBP-HepB)，是如下a)或b)的蛋白a)序列表中序列2的第1-1118所示的氨基酸序列組成的蛋白質；b)在序列表中序列2的氨基酸序列經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且具有肝素酶活性的由a)衍生的蛋白質。上述蛋白的編碼基因也屬于本發明的保護范圍之內。將上述基因導入重組大腸桿菌中表達的蛋白肝素酶酶活可達118.4IU/L發酵液，表達量可達179mg/L發酵液，比酶活可達0.66IU/mg。本發明還可通過親和分離實現了該融合蛋白的一步純化。
文檔編號C12N9/42GK101942024SQ20101025990
公開日2011年1月12日 申請日期2010年8月20日 優先權日2010年8月20日
發明者馮權, 葉逢春, 張翀, 李曄, 蔣培霞, 邢新會 申請人:清華大學;北京思清源生物科技有限公司