本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及植物抗旱相關蛋白AsTMK1及其編碼基因和應用。
背景技術：
：小麥作為我國重要的糧食作物之一，在國民經濟中占有非常重要的地位。然而，每年因干旱、鹽堿等逆境脅迫條件嚴重影響著小麥的產量和品質，制約著我國小麥糧食安全。蛋白激酶是一類催化蛋白質磷酸化反應的酶，目前研究比較多的是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的促分裂原活化蛋白激酶(MitogenActivatedProteinKinase,MAPK)。在擬南芥原生質體中，MKK2能被冷、鹽脅迫激活，因此，克隆、分離抗逆相關MAPK蛋白激酶基因改良和提高作物的抗逆性具有非常重要的意義。技術實現要素：本發明的目的是提供一種植物抗旱相關蛋白AsTMK1。本發明的再一目的是提供編碼上述植物抗旱相關蛋AsTMK1的基因。本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發明的另一目的是提供包含上述基因的轉基因細胞系。本發明的另一目的提供上述植物抗旱相關蛋白AsTMK1的應用。本發明所提供的抗旱相關蛋白AsTMK1，來源于燕麥，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本發明的蛋白激酶由371個氨基酸殘基組成，是MAPK類蛋白激酶。自SEQIDNO.1的氨基末端第20-40位氨基酸殘基是ATP結合域，自SEQIDNO.1的第116-138位氨基酸殘基為絲氨酸/蘇氨酸結合域。為了使蛋白AsTMK1便于純化，可在由SEQIDNO.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表1標簽的序列標簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRPoly-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL根據本發明所公開的SEQIDNO.1序列，本發明的轉錄因子AsTMK1可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。根據本發明的AsTMK1編碼基因具有如SEQIDNO.2所示cDNA序列。含有AsTMK1基因的表達盒、重組表達載體、轉基因細胞系及重組菌均屬于本發明的保護范圍。可用現有的植物表達載體構建含有AsTMK1基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因3’端轉錄的非翻譯區均具有類似功能。使用AsTMK1構建重組植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子、玉米的泛素啟動子(Ubiquitin)，它們可單獨使用或與其它植物啟動子結合使用；此外，使用本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。本發明的另一個目的是提供一種培育耐逆植物的方法。本發明所提供的培育耐逆植物的方法，是將上述任一種含有AsTMK1基因的重組表達載體導入植物細胞中，得到耐逆植物。利用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體，將本發明所提供的MAPK蛋白激酶AsTMK1基因導入植物細胞，可獲得對干旱和鹽等非生物逆境脅迫耐受力增強的轉基因細胞系及轉基因植株。攜帶有編碼基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物組織培育成植株。被轉化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如：擬南芥、小麥、燕麥、擬南芥、水稻、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜宿等。本發明以燕麥(AvenasativaL.)為實驗材料，得到了抗逆相關的AsTMK1蛋白及其編碼基因，并將其導入小麥，顯著提高了轉基因小麥的抗旱性。本發明的抗旱相關蛋白及其編碼基因對改良、增強小麥抗逆性，提高產量、加速抗逆分子育種進程，以及有效節省水資源具有十分重要的理論和實際意義。下面結合附圖及具體實施例對本發明做進一步說明。附圖說明圖1顯示AsTMK1轉基因小麥分子檢測，其中，M：Marker；1：H2O對照；2：陰性對照；3-10：AsTMK1轉基因植株樣品。圖2顯示AsTMK1轉基因小麥的抗旱鑒定結果。具體實施方式以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行。以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。實施例1：燕麥抗旱、耐鹽相關AsTMK1基因的cDNA克隆。對生長30天左右的燕麥幼苗進行干旱處理5小時，用Trizol提取燕麥總RNA。應用5’RACE試劑盒(GIBCOBRL,CAT.NO.18374-058)和3’RACE試劑盒(GIBCOBRL,CAT.NO.18373-019)獲得AsTMK1基因的全長序列1113bp。用Trizol提取燕麥幼苗的總RNA，用superscriptII(invitrogen)反轉錄酶反轉錄獲得到cDNA。根據AsTMK1基因編碼區序列設計引物P1和P2。以反轉錄得到的cDNA為模板，用引物P1和P2進行PCR擴增。引物P1和P2的序列如下：P1：5’-ATGGACGGCGCTCCGGTGCC-3’，P2：5’-TTACGCGTCGACGTATCGGAA-3’。對PCR產物進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到分子量約為1kb左右的條帶。用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIANGEN)回收該片段。將該回收片段與pGEM-TEasy(Promega)連接，參照Cohen等的方法(ProcNatlAcadSci，69:2110)，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，根據pGEM-TEasy載體上的氨卞青霉素抗性標記篩選陽性克隆，得到含有回收片段的重組質粒。以該重組質粒載體上的T7和SP6啟動子序列為引物對其進行核苷酸序列測定，測序結果表明擴增到的AsTMK1基因的開放閱讀框(ORF)為SEQIDNo.2的自5’末端第1至1113位脫氧核糖核苷酸，編碼氨基酸序列是SEQIDNo.1的蛋白質。將含序列SEQIDNo.2所示AsTMK1基因的重組載體命名為pTE-AsTMK1。將AsTMK1基因的序列進行比對，在燕麥中未發現同源蛋白基因，證明AsTMK1基因是一個新的基因。進一步用引物P1和P2在燕麥基因組中進行擴增，結果顯示該基因的基因組序列大小與cDNA長度大小一致，不含有內含子序列。實施例2：用AsTMK1基因增強植物的抗旱性1、重組表達載體的構建1)Ubi-AsTMK1重組表達載體的構建以燕麥的總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，用含有KpnI和BamHI接頭序列的特異引物進行PCR擴增；然后KpnI和BamHI雙酶切PCR產物回收，將酶切產物正向插入載體pNT112的Ubi啟動子之后的KpnI和BamHI酶切位點之間，得到重組載體Ubi::AsTMK1。引物序列如下：AsTMK1[KpnI]5’-TCAGGTACCATGGACGGCGCTCCGGTGCC-3’AsTMK1[BamHI]5’-GGGGATCCTTACGCGTCGACGTATCGGAA-3’2、轉基因小麥獲得和功能鑒定1)轉基因小麥材料的獲得將上述構建的重組表達載體pUbi::AsTMK1分別用凍融法轉化根癌農桿菌C58C1，再用pUbi::AsTMK1的根癌農桿菌C58C1轉化小麥，用含200mg/LBasta的MS培養基進行篩選，得到陽性轉基因植株。將篩選得到的陽性轉基因植株用PCR做進一步鑒定篩選，PCR所用的一對引物為P3和P4。P3(上游引物):5’-ATTGATGAACATGTTCAAAG-3’，P4(下游引物):5’-CTCCGTGACGGCGTGTTCAT-3’。對Ubi::AsTMK1轉基因小麥進行PCR鑒定，陽性轉基因植株經PCR擴增可獲得650bp左右條帶，結果獲得轉Ubi::AsTMK1小麥60株(圖1)。同時將pNT112空載體導入小麥，方法同上，作為對照，獲得10個株系的轉空載體小麥，篩選獲得的轉基因小麥用T2代表示。2)AsTMK1轉基因小麥抗旱性鑒定對AsTMK1轉基因品系進行水旱地產量鑒定。在北京房山水地小區中，HF-1、HF-17、HF-33、HS-18、HS-19等5個AsTMK1轉基因品系小區產量比對照京冬18分別增產4.8-9.4％之間，穗粒數、千粒重均比對照明顯增加。在旱地小區中，HF-1、HF-17、HF-33、HS-18、HS-19轉基因品系分別比對照京冬18增產4.03％至10.59％，這些轉基因品系在水旱地增產穩定，穗粒數、千粒重別比對照均有增加，提高了轉基因小區產量及抗旱性(表2，圖2)。HS-19轉基因品系具有繁茂性、豐產性好，持綠性和抗旱性顯著增強等特點(圖2)。表2、AsTMK1轉基因品系在北京房山旱地小區產量比較<110>北京市農林科學院<120>植物抗旱相關蛋白AsTMK1及其編碼基因和應用<160>2<210>1<211>371<212>PRT<213>燕麥<400>1MDGAPVPEFRPTMTHGGRFLLYNIFGNQFEITVKYQPPIMPIGRGAYGIVCSVMNFETRE60MVAIKKIANAFDNNMDAKRTLRETKLLRHLDHENIVGLRDVIPPAIPQSFNDVYIATELM120DTDLHHIIHSNQELSEEHCQYFLCQLLRGLKYIHSTNVIHRDLKPSNLLLNASCDLKICD180FGLARPSSESDMMTEYVVTRWYRAPELLLNSTDYSAAIDVWSVGCIFMELINCAPLFPGR240DHMHQMRLITEVFGTPTDDLGSIRNEEARRYMRHLPQFPCRPFPGQFPQVQPAALDLIER300MLTFNPLQRITVEEALEHPYLERLHDVADEPICTDPFSFDFEQHPLTEDQMKLLIFNEAL360KLNPNFRYVDA371<210>2<211>1080<212>DNA<213>燕麥<400>1atggacggcgctccggtgcccgagttccggccgacgatgacgcacggcggccgcttcctc60ctgtacaacatattcggcaaccagttcgagatcacggtcaagtaccagccgccgatcatg120cccatcggccgcggcgcctacgggatcgtctgctcggtgatgaacttcgagacgagggag180atggtggcaatcaagaagatcgcaaacgcctttgacaacaacatggatgccaagcgcacg240ctccgggagaccaagctcctcaggcacctcgaccacgagaacatagtaggcctccgagat300gtgatcccaccggcgatcccgcagtccttcaacgacgtctacatcgccaccgagctcatg360gacacggacctccaccacataatccactccaaccaagaactctcagaagaacactgccag420tacttcttgtgccaactgctgcgcggcctcaagtacatccactcga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