專利名稱：小麥黃矮病毒的多重pcr檢測方法
技術領域：
本發明屬于植物病毒學技術領域，特別是涉及小麥黃矮病毒的多重PCR檢測方 法。
背景技術：
小麥是全世界最主要的糧食作物之一，我國的種植面積居世界首位。但是，病毒病 及其它病害嚴重影響了小麥的產量和質量。大麥黃矮病毒病(Barleyyellow dwarf virus, BYDV)是一種全球性的病毒病害。每年對世界糧食生產造成一定程度的危害，大發生時會 造成嚴重減產。在我國，該病主要流行于北方麥區，引起的小麥黃矮病是重要的流行病害。 1987年僅陜西和甘肅兩省就因該病害的流行損失5億多公斤小麥，1998年大面積流行發生 范圍遍及陜西、山西、寧夏、內蒙和河北等多個省(自治區)。為了保證小麥生產的產量和質 量，準確鑒定小麥病害，了解其流行動態，以盡早做好防范措施。因此小麥生產上急需一種 較為靈敏、準確和快速的病害檢測方法。早期的檢測方生物學、血清學、電鏡觀察、核酸雜交和PCR技術都先后用于檢測 小麥病毒，但是一些傳統的檢測方法靈敏度不是很高，而且都只針對單一病毒的檢測，對多 種病毒混合檢測時，需要耗費較多的時間和試劑。多重PCR(M-PCR)是在普通 PCR(polymerase chain reaction)的基礎上加以改 進，于一個PCR反應體系中加入多對特異性引物，針對多個DNA模板或同一模板的不同區域 擴增多個目的片段的PCR技術。與常規的單一 PCR相比，多重PCR可以同時檢測多種病害， 極大地提高檢測效率，降低檢測成本。目前國內有單重和熒光PCR檢測BYDV-PAV、GPV、GAV， 而在田間經常表現為多種病害復合侵染；并且其癥狀極其相似，需要用分子方法進行區分。 利用單一 PCR對多種病毒進行系統檢測的工作量較大，因而多重RT-PCR在小麥病害的檢測 中的優越性更為明顯。
發明內容
本研究針對我國小麥病害發生的現狀，利用設計的特異性引物對，摸索和優化多 重PCR反應體系的條件參數等，建立了能從小麥葉片組織中同時檢測BYDV種群PAV、GPV, GAV三種病毒的復合侵染田間樣品的多重PCR檢測方法。具體的，本發明提供了一種利用多重PCR反應同時檢測小麥黃矮病種群中PAV、 GPV、GAV三種病毒的方法，該方法包括小麥病毒總RNA的提取、逆轉錄反應制備cDNA模板， 多重PCR反應，電泳檢測，確定病毒種類，其特征在于逆轉錄反應制備cDNA模板應用引物 SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 4 和 SEQ IDN0. 6，多重 PCR 反應中應用引物 SEQ ID N0. 1-6。SEQ ID NO. 1-6的核苷酸序列如下SEQ ID NO. 1 :5，-ATGAATTCAGTAGGCCGTAGG-3，(PAV F)SEQ ID N0. 2 5' -CTATTTGGCCGTCATCAAGTG-3，(PAV R)SEQ ID N0. 3 5' -GGTCGCCCTTAGAAATG-3，(GPV F)
SEQ ID NO. 4:5，-GCCTCGGTGATGAACTG-3，(CPV R)SEQ ID NO. 5 5' -GTAGAAATAACCGCAGGAG-3，(GAV F)SEQ ID N0.6 :5，-GACTTGAGTATTCCACCTGA-3，(GAV R)上述方法中，優選地，在多重PCR反應的反應體系中，緩沖液濃度為0.4 X-0.9 X ； dNTPs濃度為0. 1-0. 5mM ；Mg2+濃度為1. 0-3. 5mM ；退火溫度為51-55°C ；循環次數為20-45 次；延伸時間為30-55s。上述方法中，優選地，多重PCR反應的反應體系中，緩沖液濃度為0.4X、0.5X、 0. 6X、0. 7X、0. 8X 或 0. 9X ；dNTPs 濃度為 0. lmM、0. 2mM、0. 3mM、0. 4mM 或 0. 5mM ；Mg2+濃度 為 1. OmMU. 5mM、2. OmM,2. 5mM、3. OmM 或 3. 5mM ；退火溫度為 51°C、52°C、53°C、54°C或 55°C ； 循環次數為20、25、30、35、40或45次；延伸時間為30、35、40、45、50或55s。上述方法中，更加優選地，多重PCR反應的反應體系中，緩沖液濃度為0.8X或 0. 9 X，dNTPs濃度為0. 4mM或0. 5mM,Mg2+濃度為2. 5mM或3. 5mM,退火溫度54°C，延伸時間 45s，循環次數30次。上述方法中，尤其優選地，多重PCR反應的反應體系中，TaqDNA聚合酶濃度為 0. 04U/ μ L-0. 06U/y L。上述方法中，尤其優選地，多重PCR反應的反應體系中，緩沖液濃度為0. 9Χ， dNTPs濃度為0. 4mM, Mg2+濃度為3. 5mM, Taq DNA聚合酶濃度為0. 06U/ μ L。上述方法中，多重PCR反應的反應體系中，3對引物之間的摩爾比例為 PAV GPV GAV = 2 1 1。應用本發明的多重PCR反應檢測小麥黃矮病的方法對田間復合侵染的小麥材料 檢測具有快速、省時、節約成本等優勢。
圖1是三種病毒單重PCR檢測結果M =DNA分子量標準；1 健康小麥；2_4分別為 PAV, GPV, GAV感染的小麥圖2是應用多重PCR對陜西各地區BYDVs種群的田間檢測1 =DNA分子量標準；2 健康小麥；3-12 鳳翔、眉縣、長武、旬邑、彬縣、楊凌、武功、周至、成陽、合陽和韓城感染黃 矮病的小麥。
具體實施例方式為了理解本發明，下面以實施例進一步說明本發明，但不限制本發明。引物的設計和合成根據BYDV-PAV株系楊凌分離物、GPV株系中國分離物、GAV株系中國分離物的外殼 蛋白基因序列、DNAMAN軟件計算引物Tm值，選擇Tm值較一致的各條引物，保證在同一個退 火溫度下同時檢測到PAV、GPV和GAV 3種病毒。通過Primer Primier 5. 0和Blast序列 比對方法對引物進行互補性測試，選擇互補性最低的引物對，優化多重PCR的引物，核苷酸 序列為SEQ ID NO. 1-6，由南京思特公司合成。 單重PCR反應總RNA 提取小麥黃矮病株材采集自鳳翔、眉縣、長武、旬邑、彬縣、楊凌、武功、周至、成陽、合陽 和韓城。分別稱取PAV，GPV, GAV感染的小麥(分別標記為樣品2、樣品3、樣品4)各0. Ig 于_80°C深凍研缽中，加液氮充分研磨，迅速轉入到無RNase的無菌1. 5mL eppendof管中， 力口入 ImL BIOzol Extraction Reagent 混勾，放置 15min。力口入 0. 2mL 氣仿禾口 0. 3ml 苯酷溶 液上下倒置混勻，4°C 12000Xg離心15min。取上清液轉入新印pendof管中，加入與上清 液等體積的異丙醇，振蕩混勻，_20°C放置30min。4°C 12000Xg離心15min，棄上清液。用 ImL 75%乙醇(DEPC水配制)洗滌沉淀，4°C 12000 X g離心5min，棄上清液，自然干燥。加 入30 μ L DEPC水溶解沉淀。_80°C保存備用，獲得3種病毒的總RNA，同時以健康煙草(標 記為樣品1)總RNA為陰性對照，提取方法同上。RT 反應分別對每種病毒的總RNA進行逆轉錄反應。用M-MLV反轉錄酶反轉錄合成各病 毒cDNA第一鏈25yLRT反應體系如下2yL總RNA，lyL病毒引物(SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 4 和 SEQ ID NO. 6) (10 μ mol/L)，7 μ LDEPC-H2O, 70°C變性 5min，迅速置冰上 2min ；再加 入 5 μ L 5 X RT buffer, 5 μ LdNTP (各 2. 5mmol/L)，0· 5 μ LRNase 抑制劑(40U/ μ L)禾口 1 μ L M-MLV反轉錄酶(200U/ μ L)，離心后，42°C水浴lh，95°C滅活5min，置冰上待用，獲得3種病 毒的cDNA。PCR 反應分別對每種病毒的cDNA進行PCR反應。25 μ LPCR標準反應體系14. 4 μ LddH20， 2. 4 μ LlO XPCR buffer [750mmol/LTris-HCl (pH8. 8), 200mmol/L, (NH4) 2S04,0. 1 % Tween 20], 2 μ L25mmol/L, MgCl2, 2 μ LdNTP (各 2. 5m mol/L)，1 μ L 上游和下游引物混合物(SEQ ID Ν0. 1-6)(各 10 μ mol/L)，0· 2 μ LTaq DNA 聚合酶(5U/ μ L)禾口 2 μ LcDNA 模板。PCR 反應循 環參數94°C預變性3min ；94°C變性30s，48°C退火30s，72°C延伸lmin，循環30次；72°C終 止補償延伸IOmin。取5 μ LPCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分析比較。電泳檢測取5 μ L PCR反應產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，在0. 5 X TAE緩沖液環境中，110V 穩壓電泳40min，然后用凝膠成像系統觀察并記錄結果，分別得到3條特異性條帶，得到每 種病毒的擴增引物條帶位置，參見說明書附圖中的圖1。多重PCR反應
將RT產物作為多重PCR反應的模板，各BYDV特異性引物(SEQ IDN0. 1-6)同時加 入一個離心管中進行PCR反應。25 μ L反應體系的梯度設計，緩沖液濃度為0. 9 X，dNTPs濃 度為0. 4mM, Mg2+濃度為3. 5mM, Taq DNA聚合酶濃度為0. 06U/ μ L，退火溫度54°C，延伸時 間45s，循環次數30次。3對引物之間的比例為PAV GPV GAV = 2 1 1PCR反應產物的純化(1)電泳檢測PCR產物，紫外切割目標條帶；(2)將切割的凝膠裝入一個預先稱量好的干凈1. 5ml離心管后，稱重。(3)加相當于兩倍體積凝膠的結合液DB (0. Ig凝膠相當于100 μ L溶液)。(4)將上述裝有溶液的離心管放入56°C水浴，至膠完全溶解。每1-2分鐘振蕩一 次以加速溶解。(5)溶化后的凝膠溶液慢慢加入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中)，離心 12000rpm, lmin,棄濾液。如過凝膠總體積超過750 μ L，可分兩次將溶液加入同一個吸附柱 AC中，中間重復離心一次。(6)加入700 μ L預先處理好的漂洗液WB于吸附柱AC中，離心12000rpm，lmin，棄濾液。(7)將吸附柱AC放回空離心管中，空離12000rpm，2min。(8)將吸附柱AC放入干凈的離心管中，慢慢加入預先預熱的30 μ 1洗脫緩沖液 EB,室溫靜置 2min，離心 12000rpm，lmin。連接、轉化和篩選將純化的目標片段與pMD18-T simple vector進行連接，在PCR管中加入5. 5 μ 1 的 PCR 純化產物，0. 5μ L 的pMD18-T vector, 6 μ 1 的 solution 后，16°C Ih 或 4°C 過夜連接。 轉化感受態大腸桿菌E. Coli JM109病篩選。CaCl2法制備感受態大腸桿菌，轉化和篩選方 法如下(1)取_70°C保存的感受態細胞置于冰上融化，加入10 μ L連接產物，冰浴30min。(2)放入42°C水浴熱激90sec后，立即置于冰上數分鐘。(3)加入預冷的液體LB培養液900 μ L，37°C搖床低速培養lh。(4)室溫下8000 Xg離心0. 5min，吸去上清至剩余200 μ L，用移液器將沉淀輕輕懸浮。(5)將懸浮液100 μ L均勻涂布在含50-100mg/mL Amp的LB平板(預先涂布4 μ L 200mg/mL IPTG和40 μ L 20mg/mL的Χ-gal)上，先于37°C將平板正放30min。然后倒置培 養 10-14h。(6)篩選白色單菌落置3mL含50_100mg/mL Amp的LB培養液中，37°C培養8_12h。重組質粒DNA的少量提取經過PCR鑒定為陽性克隆的菌液擴繁后，進行重組質粒的提取(1)取4. 5ml已擴繁菌液進行離心9000rpm，30s,棄上清，收集菌體。(2)加入250 μ 1溶液Pl (第(1)步)渦旋振蕩至菌體沉淀徹底懸浮。(3)加入250 μ 1溶液Ρ2 (第(2)步)，溫和地上下翻轉6_10次，至菌液清亮。(4)加入400μ 1溶液Ρ3(第(3)步)，立即溫和地翻轉，13000rpm離心lOmin，取 上清。
(5)加入500μ 1溶液P4(第(4)步)于收集管上的吸附柱內，13000rpm常溫離心 lmin，棄濾液進行平衡；將步驟(4)的上清液加入帶有收集管的吸附柱AC中，13000rpm常 溫離心lOmin，棄濾液。(6)加入500μ 1去蛋白液PE于AC管中，13000rpm離心lmin，棄濾液。(7)加入500 μ 1已預先處理的漂洗液WB，13000rpm離心lmin，棄濾液。(8)重復步驟(7) 一次。空柱13000rpm離心2min。(9)加入60_10(^1洗脫緩沖液冊于吸附柱內，靜置11^11，13000印111離心11^11洗 脫DNA，-20°C保存備用。重組質粒鑒定，目的片段的測定和同源性分析對重組質粒進行PCR檢測，將含有目標片段的陽性重組質粒寄送南京金思特生物 技術有限公司測序。根據序列測定結果，在GenBank中用BLAST搜索同原序列，進行同源性 分析。測序結果表明，PAV、GPV和GAV的擴增產物分別由600、342、274bp，與設計的PCR 產物大小相同。所得序列與參考序列的同源率分別達到99. 24%、100%和100%。證明了 多重PCR檢測結果的可靠性。利用多重PCR對陜西田間采集樣品進行檢測，得出病毒侵染在田間的不同組合 (圖2)。在楊凌的標樣中檢測出PAV、GPV和GAV，這證明多重PCR體系完全可以用于BYDV 三種病毒種的檢測，田間確實存在三種病毒的混合侵染，也說明了多重PCR可以快速靈敏 的檢測低濃度的病毒存在。本發明的方法已經通過具體的實施例進行了描述。本領域技術人員可以借鑒本發 明的內容適當改變原料、工藝條件等環節來實現相應的其它目的，其相關改變都沒有脫離 本發明的內容，所有類似的替換和改動對于本領域技術人員來說是顯而易見的，都被視為 包括在本發明的范圍之內。
權利要求
一種利用多重PCR反應同時檢測小麥黃矮病種群中PAV、GPV、GAV三種病毒的方法，該方法包括小麥病毒總RNA的提取、逆轉錄反應制備cDNA模板，多重PCR反應，電泳檢測，確定病毒種類，其特征在于逆轉錄反應制備cDNA模板應用引物SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6，多重PCR反應中應用引物SEQ ID NO.1 6，多重PCR反應的反應體系中，緩沖液濃度為0.4× 0.9×；dNTPs濃度為0.1 0.5mM；Mg2+濃度為1.0 3.5mM；退火溫度為51 55℃；循環次數為20 45次；延伸時間為30 55s。
2.根據權利要求1所述的方法，其中多重PCR反應的反應體系中，緩沖液濃度為0.8X 或0. 9 X，dNTPs濃度為0. 4mM或0. 5mM, Mg2+濃度為2. 5mM或3. 5mM,退火溫度54°C，延伸 時間45s，循環次數30次。
3.根據權利要求1所述的方法，多重PCR反應的反應體系中，TaqDNA聚合酶濃度為 0. 04U/ μ L-0. 06U/y L。
4.根據權利要求1所述的方法，多重PCR反應的反應體系中，緩沖液濃度為0.9Χ， dNTPs濃度為0. 4mM, Mg2+濃度為3. 5mM, Taq DNA聚合酶濃度為0. 06U/ μ L。
5.根據權利要求1-4任一項所述的方法，其中多重PCR反應的反應體系中，3對引物之 間的摩爾比例為PAV GPV GAV = 2 1 1。
全文摘要
本發明涉及小麥黃矮病毒的多重PCR檢測方法，該方法包括小麥病毒總RNA的提取、逆轉錄反應制備cDNA模板，多重PCR反應，電泳檢測，確定病毒種類，其中逆轉錄反應制備cDNA模板應用引物SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.6，多重PCR反應中應用引物SEQ ID NO.1-6。應用本發明的多重PCR檢測小麥黃矮病的方法對田間復合侵染的小麥材料檢測具有快速、省時、節約成本等優勢。
文檔編號C12Q1/68GK101921876SQ20101026764
公開日2010年12月22日 申請日期2010年8月31日 優先權日2010年8月31日
發明者吳云鋒, 楊洋 申請人:西北農林科技大學