動態制備異型空腔細菌纖維素材料的裝置及方法

專利名稱：動態制備異型空腔細菌纖維素材料的裝置及方法
技術領域：
本發明屬于細菌纖維素材料的制備領域，特別涉及一種動態制備異型空腔細菌纖 維素材料的裝置及方法。
背景技術：
細菌纖維素(Bacterial Cellulose，簡稱BC)是一類由微生物產生的純纖維素。 細菌纖維素和植物纖維一樣都是由β-D-葡萄糖通過β-1，4-葡萄糖苷鍵結合成的直鏈， 直鏈間彼此平行，不呈螺旋構象，無分支結構，又稱為β_1，4-葡聚糖。細菌纖維素由于具 有獨特的生物親和性、生物相容性和無過敏反應，以及高的持水性、聚合度、結晶度，良好的 三維納米纖維網絡結構、高的張力和強度，尤其是良好的機械韌性，因此在人工血管、組織 工程支架、人工皮膚以及治療皮膚損傷等方面具有廣泛的用途，是國際生物醫用材料研究 白勺 °目前細菌纖維素材料的制備一般采用常規靜置培養法，獲得的是一張纖維素膜。 用常規液體深層槳葉垂直攪拌技術會引起木醋桿菌的變異退化，導致其不再合成纖維素， 而目前常用的較少引起菌種退化的動態發酵技術(在氣升式發酵罐中)僅能制備顆粒狀的 細菌纖維素材料，由于纖維素可溶于某些化學試劑，因此很早就有人希望將細菌纖維素溶 液灌注模具來“鑄造”有形狀的空腔生物材料。然而效果卻并不理想，所獲得的纖維素產品 不具有原細菌纖維素的優良特性，這可能是由于它的物理結構被改變而導致性能劣化。由 于木醋桿菌合成纖維素是一個耗氧的次級代謝過程，纖維素易形成于空氣與培養液的交界 處，因此氧氣是纖維素形成的重要因素。已有的研究表明，只要在靜置發酵液中提供表面透 氧性能良好、具有一定形狀的模具，在模具表面就可以形成該形狀的纖維素膜，這樣利用細 菌在線發酵制備有形生物醫用材料就成為可能。首次利用該原理成功制備有形狀的細菌纖維素產品是一個手套形狀的人工皮 膚(UKPatent 12, 169, 543 ；White and Brown，1989)。該技術是利用能透氧氣的手形微 型織造物(microwoven textiles)作為模具，靜態條件下培養。1990和1991年日本人 Yamanaka根據同樣的原理，利用一個能透氧的空腔圓管，如玻璃紙、特富龍、硅膠、陶瓷等 制作的模具，通過注入含活細菌的培養液在靜態發酵條件下制備人工血管獲得了成功(EP PatentO, 396，344 JP Patent 3，272，772)。他以成年雜種狗為實驗對象，將制備好的BC管 材料植入到大動脈和頸靜脈血管中，發現雖然在血管縫合處以及BC管內壁有輕微的血栓 吸附，但是BC管始終保持良好的通暢度。2001和2003年德國Klemm等人將一個內部是玻璃 圓柱而外部是玻璃圓管組成的模具浸入細菌培養液中，通過靜態發酵制備成功小直徑人工 血管(1 3mm內徑)(商品名為BASYC)，并經老鼠動物實驗證明該人工血管抗血栓效果很 好(WO Patent 0，161，026，US Patent 2，003，013，163)。大白鼠沒有經任何抗凝藥物處理， 觀察到頸動脈-BC管復合體被結締組織包裹，上面布滿類似血管滋養管的小血管，BC管完 全被活體組織包裹沒有任何排斥反應。所有植入的BC管在手術后都保持100%的暢通率， 而且沒有血栓凝結或者組織增生的現象。由此可見，中空細菌纖維素管是制備< 6mm人工
4血管的良好材料。此外，該空腔纖維管還可以作為氣管、輸尿管、軟骨支架、覆蓋神經纖維的 護套，以及某些空腔器官的替代物等(WO Patent 0，161，026 ；US Patent 2，003，013，163)。 2005年美國和瑞典國際合作小組的Svensson等人報道了以細菌纖維素作為軟骨組織工程 支架的實驗結果，并指出效果較好。2006年Backdahl等人通過研究細菌纖維素的機械性能 以及與人平滑肌細胞的相互作用指出該材料今后可以用于組織工程血管。以上研究證明了 凝膠狀的管狀BC材料以其高的機械強度、大的持水力、十分規則的內表面和極好的生物相 容性等特點，在顯微外科手術中作為血管組織替代物具有巨大的應用前景。BC除了用于人造血管等醫用材料外，還可以用于人工皮膚等傷科敷料。微生物纖 維素獨特三維網狀結構內部有很多“孔道”，有良好的透氣、透水性能，能吸收60 700倍于 其干重的水份，這些水分是以自由水的形式存在。使用BC作為傷口敷料能夠迅速吸收傷口 血液和組織液，防止傷口感染化膿，又能為慢性傷口附近的組織再生提供濕潤的環境促進 傷口愈合和減輕疼痛。同時纖維素不會和傷口粘連，不會造成二次傷害，剝離時也不會有殘 留。首次利用能透氧的手形微型織造物為模具靜態培養成功制備的手套形狀的人工皮膚在 治療大面積燒傷/燙傷的手部皮膚時具有良好效果。自1987年以來，巴西連續報道了 400 多例應用細菌纖維素膜對燒傷、燙傷、褥瘡、凍傷、皮膚移植和慢性皮膚潰瘍等治療效果良 好的實例。現已有用其制成的人工皮膚(商品名為BioFill)、紗布、繃帶和“創口貼”等傷 科敷料商品上市。另外一種叫做Xcell的BC創傷敷料也被用來促進慢性創傷的愈合，同樣 也表現出很好的治療效果。研究顯示這種BC敷料在慢性創傷的應用方面較之其他材料的 敷料能夠更有效地促進傷口愈合。與其它人工皮膚和傷科敷料相比，該膜的主要特點是在 潮濕情況下機械強度高、對液、氣及電解物有良好的通透性、與皮膚相容性好，無刺激性，可 有效緩解疼痛，防止細菌的感染和吸收傷口滲出的液體，促進傷口的快速愈合，有利于皮膚 組織生長。此膜作為緩釋藥物的載體攜帶各種藥物，利于皮膚表面給藥，促使創面的愈合和 康復。因此，該纖維素作為一種極具應用潛力的生物材料具有廣闊的市場應用前景。但是現有技術方法的不足之處在于需要特定的透氧模具和靜態發酵制備，生產周 期長，生產成本高，生產效率低，無法進行工業化生產和應用。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種動態制備異型空腔細菌纖維素材料的裝 置及方法，該方法制備的異型空腔BC材料不僅其尺寸和形狀是可控的，而且發酵裝置的模 具可拆卸，重復使用，且制備方法簡便易行，成本低廉，生產效率高，適用于工業化生產；該 異型空腔BC材料可廣泛應用于人工血管、神經纖維導管等中空器官的替代品，還可作為食 品包裹材料如肉制品腸衣、果凍外衣等。本發明的一種動態制備異型空腔細菌纖維素材料的裝置，包括溫度計口，酸液堿 液添加口，把手，通氣口，PH計口，營養補料口，轉軸，發酵罐，馬達，水浴裝置，模具，其特征 是所述的轉軸一端連接固定馬達輸出軸，轉軸另一端從發酵罐一端面中心位置伸入發酵 罐內；在發酵罐內的轉軸上固定有模具。所述的轉軸在發酵罐內腔安裝固定有轉盤，轉軸通過轉盤圓周邊緣對稱固定有2 個以上模具。所述的模具為棍形或手套形模具。
所述的模具為手套形模具，其中，手套形模為依次在轉軸上穿入1個以上手套形 模具。所述模具的橫截面形狀為圓形、方形、橢圓形、三角形、心形或五角星形。所述的模具為實心或者中空結構。所述的溫度計口、酸液堿液添加口、pH計口、營養補料口、通氣口、把手均位于發酵 罐的外表面上。所述的發酵罐為任意形狀。所述的模具的材料為玻璃、陶瓷、紫砂、金屬、硅膠、木材、纖維素、橡膠、滌綸、尼 龍(Nylon)、奧綸(Orion)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯乙醇(Ivalon)、滌綸(Dacron)、特氟綸 (Teflon)、膨體聚四氟乙烯(ePTFE)和真絲等高分子材料以及塑料等無機有機材料的一種 或幾種組合。本發明的一種動態制備異型空腔細菌纖維素材料的方法，包括(1)菌種培養將細菌纖維素生產菌株接入液體培養基擴培，于20-3(rC、100-250r/min條件下 搖床培養或者靜置培養12 48h后備用；(2)異性空腔BC材料的發酵制備將步驟(1)制備的含生產菌株的液體培養基轉移到上述發酵裝置中，然后旋轉模 具以3-20rpm的轉速進行擾動培養，于20 32°C動態培養4_20天后，即可收獲空腔異形纖 維素材料；(3)材料處理將制備的中空異形細菌纖維素材料從模具上取下，然后浸泡于0.5 2襯％的 NaOH溶液中，70-100°C水浴處理30-120min，使細菌纖維素材料呈白色半透明后即可；然后 洗滌至中性，即得異形細菌纖維素產品。所述步驟(1)中的BC生產菌株為醋酸菌屬(Acetobacter sp.)、葡萄糖酸 桿菌屬(Gluconobacter sp.)、葡糖酸醋桿菌屬(Gluconacetobacter sp.)、根瘤菌屬 (Rhizobium sp. )、7〈疊球菌屬(Sarcina sp. )、{段單胞菌屬(Pseudomounas sp.)、無色桿菌 屬(Achromobactersp.)、產喊菌屬(Alcaligenes sp.)、氣桿菌屬(Aerobacter sp·)、固氮 菌屬(Azotobacter sp·)、土壤桿菌屬(Agrobacterium sp.)、洋蔥假單胞菌(Seudomonas c印acia)、空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)或紅茶菌(kombucha)；其中優選菌株為木 醋桿菌(Acetobacterxylinum)或紅茶菌；其中，除紅茶菌以外的菌種按2 3接種環的接種量接入液體種子培養基；紅茶菌 按接入1-10片直徑0. 5cm圓片含菌BC膜的接種量接入液體種子培養基；或者先制備生產菌的液體種子，再轉接入液體發酵培養基；除紅茶菌以外的菌種 按2 3接種環的接種量接入液體種子培養基制備種子液，然后按3vol% 20vol%的接 種量轉接到液體發酵培養基；紅茶菌按接入1-10片直徑0. 5cm圓片含菌BC膜的接種量接 入液體種子培養基，以及按1 10片直徑0. 5-lcm圓片含菌BC膜的接種量轉接到液體發 酵培養基。所述的除了紅茶菌以外的液體種子培養基和液體發酵培養基的組分均為每IL 水中，甘露醇、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖或果糖20-200g、蛋白胨或胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g，
6PH3. 0-7. 5，121°C滅菌20min ；或甘露醇、葡萄糖、蔗糖或果糖20_200g，酵母浸膏5g，蛋白胨 或胰蛋白胨 5g，檸檬酸 115g，Na2HP042. 7g，水 1L，ρΗ3· 0-7. 5，121°C滅菌 20min ；紅茶菌液體種子培養基和液體發酵培養基，其組成均為(1)每IL水中，綠茶或者 紅茶I-IOg(茶葉5g時最優)，葡萄糖、蔗糖或者果糖10 200g、蛋白胨或者胰蛋白胨3g、酵 母浸膏5g，pH3. 0-7. 5，巴氏滅菌30min ； (2)將葡萄糖、蔗糖或果糖、綠茶或紅茶、以及水配 成培養基，其中糖、茶、水的質量比為5 0.1-0.4 100-200，pH3. 0-7. 5，巴氏滅菌30min; 或者(3)每IL水中，甘露醇、葡萄糖、蔗糖或果糖20-200g、蛋白胨或胰蛋白胨3g、酵母浸膏 5g，pH3. 0-7.5，121°C滅菌20min ；其中，最優培養基為(1)的配方。所述步驟(2)中的含生產菌株的液體培養基為步驟(1)制備的含生產菌株的液體 種子培養基或含生產菌株的液體發酵培養基。此外，為加速在模具上形成纖維素膜，可以在轉軸或模具內腔中注入含氧量為 I-IOOvol %的空氣，當含氧量為lOOvol %時，通入的是純氧。目前已有的BC中空異形材料的制備技術一般采用單層透氧模具制備，效率低且 外表面或者內表面粗糙，本發明利用細菌纖維素在液體中易纏繞的特性，在水平擾動的生 物反應器中，通過轉盤上模具圍繞著轉軸軸心的轉動，使得模具在液體培養基中進行緩慢 且循環浸沒的擾動培養方式，纏繞和吸附發酵液中的細菌纖維素而在模具表面形成一定形 狀的中空細菌纖維素材料。由于是亞靜態培養(轉軸的轉速很緩慢，< 20rpm，菌體在亞靜態的環境下生長)， 可以使模具在液體培養基和含氧介質中不停地交替，既給液體培養基提供足夠的溶解氧， 促進液體中菌體的快速繁殖和產生纖維素，從而利于模具的纏繞；又有利于已固定在模具 上的纖維素膜中的菌體可以接觸到營養，同時使得菌體充分接觸氧，從而促使菌體大量繁 殖和分泌纖維素，高效制備細菌纖維素材料。多種因素促使生產效率大大提升。根據所需制備的BC材料的尺寸和形狀，選擇合適的模具材料，制備出橫截面形狀 為圓形、方形、橢圓形、三角形、心形、五角星形等異形BC材料。本發明制備得到異型空腔細菌纖維素材料作為一種新型納米生物材料不僅可以 用于人工血管、覆蓋神經纖維的護套，還可用于人造氣管、輸尿管、組織工程支架、人工皮 膚、腦膜，以及某些中空器官的替代品；或者可作為一種可食用的食品包裹材料(如肉制品 腸衣、果凍外衣等)等，具有非常廣闊的應用范圍和美好的應用前景。有益效果(1)本發明制備的異型空腔BC材料相較于其他物理化學的方法，保留了其獨特的 三維網狀納米結構、高化學純度、高結晶度、高聚合度、高強度以及良好的生物相容性等優 點；且制備方法簡便易行，成本低廉，生產效率高，適合大規模工業化生產；(2)本發明制備的異型空腔BC材料的長度、內徑、厚度等尺寸和形狀均不受限制， 可以人工調控，而且材料內外均具有光滑平整的表面；(3)發酵裝置的模具可拆卸，重復使用，所制備的各種異形BC材料可以在表面毫 無損傷的情況下剝離出來；為了進一步提高異形BC材料的制備效率，在水平生物反應器中 可配備多個模具以提高產量。


圖Ia為制備管狀細菌纖維素材料的發酵裝置示意圖1，其中模具為棍子或者管 子，模具內腔可以充滿氧氣或空氣；圖Ib為制備手形細菌纖維素材料的發酵裝置示意圖2，其中模具為手形，模具內 腔可以充滿氧氣或空氣；圖2為用于制備管狀細菌纖維素材料的轉盤結構設計模型；圖3為不同棒狀模具材料制備得到的細菌纖維素結果，上為硅膠棒，中為木棒，下 為磨砂玻璃棒；圖4為制備管狀細菌纖維素材料的配備磨砂玻璃棒模具的發酵裝置實拍圖；圖5為發酵5-7天制備的管形細菌纖維素材料的實物圖；圖6為發酵5天制備的管形細菌纖維素材料的電鏡圖；其中A為外表面，B為內表 面，C為與管中心軸方向垂直截面(橫截面)，D為沿管中心軸方向截面(縱截面)；圖8為發酵1 8天制備的細菌纖維素管沿管中心軸方向測試的絕對拉力(軸向 拉力)隨時間變化的曲線圖；圖9為發酵1 8天制備的細菌纖維素管沿與管中心軸垂直方向測試的絕對拉力 (徑向拉力)和相對干重拉力隨時間變化的曲線圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。以管狀BC材料的制備為例實施例11.發酵裝置的設計組裝1. 1設計思想由于Acetobacterxylinum屬于好氧性細菌，在長期的發酵代謝過程中需要大量 的氧氣，細菌纖維素的生長屬于吸附式生長并且必須要有培養基的支持，因此要讓細菌纖 維素按照一定的形狀生長成形，細菌纖維素就必須在特定形狀的模具材料上進行好氧生 長。如果要制備的細菌纖維素材料為管狀材料，則要考慮采用棍形、棒形或管狀模具，不僅 讓細菌纖維素在這些模具上生長，而且還必須提供足夠的氧氣，為此我們設計了采用一個 配備棍形模具的水平生物反應器，讓模具在液體培養基中進行緩慢循環反復浸沒的方式進 行擾動培養，這樣培養基中產生細菌纖維素就可以纏繞吸附在模具上，時而浸沒在培養基 中補充營養，時而暴露在空氣或氧氣中的循環反復操作，直到培養形成所需的管狀細菌纖 維素材料。為加快以固定在模具上菌體的生長和合成分泌纖維素，模具中充滿1-100%氧氣 或者空氣有很大幫助。1. 2水平擾動生物反應器的結構特點反應器由上下兩個半圓柱體或其它形狀的玻璃容器組成，生物反應器的體積為 IOOOmL,有效體積為500mL，轉盤由電機帶動，反應器的裝液量為300_350mL，設備示意圖如圖la-b所示頂部開有直徑為Icm大小的開口，分別進行溫度，通氣和補料操作。反應器中 發酵液浸沒轉盤的2/5左右，確保當某根棍形模具旋轉達到最低端時，整個模具可以完全 浸沒在發酵液中。1. 3生物反應器的轉盤結構設計利用模具進行一定轉速的旋轉，將細菌纖維素纏繞在模具上，因此本實驗的最重 要的部件在轉盤固定的棒狀模具上。采用兩種不同類型結構的轉盤，一種為模具夾在兩個轉盤之間，另一個為轉盤都 在模具一端，另一端留出一定長度的模具(見圖2)，所需要的管狀細菌纖維素主要生長纏 繞于模具上，兩個轉盤主要對模具起支撐作用。1. 4反應器轉盤和棒形模具材料的篩選考慮到本試驗制備的是管狀細菌纖維素材料，所以轉盤圓片由無毒的聚乙烯塑料 片或其它無毒性的材料組成，轉軸則由玻璃棒或不銹鋼棒等有一定剛性的材料組成。由 于考慮到模具材料的毒性、對細菌纖維素的吸附性、機械強度以及加工的難易程度等因 素，因此可以是玻璃、陶瓷、紫砂、金屬、硅膠、木材、纖維素、橡膠、滌綸、尼龍(Nylon)、奧綸 (Orion)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯乙醇(Ivalon)、滌綸(Dacron)、特氟綸(Teflon)、膨體聚 四氟乙烯(ePTFE)和真絲等高分子材料以及塑料等無機有機材料的一種或幾種組合。本實 驗重點選擇了木質、玻璃、硅膠進行研究。將三種不同類型的材料分別裝在轉盤上，進行培 養，觀察纖維素的生長成形情況(見圖3)。實驗結果表明在相同天數內，形成的管狀材料 由厚到薄依次為木棒、磨砂玻璃棒、硅膠管。以磨砂玻璃棒為模具的生物反應器實拍圖見圖 4。制備得到的不同尺寸的細菌纖維素管實物圖見圖5。實施例2如圖1所示，一種動態制備異型空腔細菌纖維素材料的裝置，一種簡便高效動態 生產異型空腔細菌纖維素材料的發酵裝置，包括溫度計口 1，酸液堿液添加口 2，把手3，通 氣口 4，pH計口 5，營養補料口 6，轉軸8，發酵罐9，馬達10，水浴裝置11，模具，其特征是所 述的轉軸8 —端連接固定馬達10輸出軸，轉軸8另一端從發酵罐9 一端面中心位置伸入發 酵罐9內；在發酵罐9內的轉軸8上固定有模具。模具12的材料選自玻璃、陶瓷、紫砂、金屬、硅膠、木材、纖維素、橡膠、滌綸、尼龍、奧 綸、聚乙烯醇、聚乙烯乙醇、滌論、特氟論、膨體聚四氟乙烯、真絲、塑料中的一種或幾種組合。轉軸8在發酵罐9內腔靠近發酵罐9 一端面一側安裝固定有轉盤7，轉軸8通過轉 盤7圓周邊緣對稱固定有棍形管形模具12，且棍形管形模具12為實心或中空結構。溫度計口 1、酸液堿液添加口 2、pH計口 5、營養補料口 6、通氣口 4、把手3均位于 發酵罐9的外表面上。棍形管形模具12的橫截面形狀為圓形、方形、橢圓形、三角形、心形或五角星形。使用時，通過將含生產菌株的液體培養基轉移到本實用新型的發酵裝置中，然后 旋轉模具以3-20rpm的轉速進行擾動培養，即可收獲空腔異形纖維素材料。實施例3如圖2所示，本實施例與實施例2的區別僅在于(1)模具的形狀不同，本實施例中模具為手套形模具12，且手套形模具12為實心 或中空結構，手套形模具12的橫截面形狀為圓形、方形、橢圓形、三角形、心形或五角星形；
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(2)本實施例的裝置中不需要轉盤對手套形模具進行固定，只需在轉軸上依次穿 入1個以上手套形模具即可。實施例4本實施例與實施例2的區別僅在于模具的形狀不同，本實施例中模具為手套形模具12，且轉軸8通過轉盤7圓周邊緣 對稱固定有2個以上手套形模具；手套形模具12為實心或中空結構，手套形模具12的橫截 面形狀為圓形、方形、橢圓形、三角形、心形或五角星形。實施例5(1)菌種培養將木醋桿菌(Acetobacter xylinum)接入300mL液體培養基(本實施例以下面培 養基配方為例每IL水中，甘露醇、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖或果糖20-200g、蛋白胨或胰蛋白 胨3g、酵母浸膏5g，pH3. 0-7. 5，121°C滅菌20min ；或甘露醇、葡萄糖、蔗糖或果糖20_200g， 酵母浸膏5g，蛋白胨或胰蛋白胨5g，檸檬酸115g，Na2HP042. 7g，水lL，pH3. 0-7. 5，121°C滅菌 20min)擴培，于20-30°C、100-250r/min條件下搖床培養或者靜置培養12 48h后備用；(2)中空異形細菌纖維素材料的發酵制備將步驟(1)制備的含生產菌株的液體培養基轉移到配備有棒狀模具的生物反應 器中，然后旋轉模具以7、15、30和60rpm的轉速進行擾動培養，于30°C動態培養4_20天后， 即可收獲空腔異形纖維素材料；或者取步驟(1)活化好的菌種以10%的接種量接入到300mL發酵培養基中，置于 500mL錐形瓶中，在30°C和160rpm的條件下培養4小時，然后再將發酵液轉移到生物反應 器中，然后旋轉模具以7、15、30和60rpm的轉速進行擾動培養，于30°C條件下分別培養不同 的天數，制備得到不同厚度的管狀細菌纖維素材料。該發酵裝置由一個水平攪拌反應器和在轉盤上固定若干棍狀模具的轉軸組成，形 成了一個水平擾動的生物反應器。通過轉盤上模具圍繞著轉軸軸心的轉動，使得模具纏繞 發酵液中的細菌纖維素而在模具表面形成一定形狀的中空細菌纖維素材料。由于木醋桿菌屬于好氧性微生物且對外界的剪切力敏感，因此，在對生物反應器 設計時不僅要考慮氧氣的供應，而且還要考慮剪切力(即轉速)對菌體和細菌纖維素纏繞 成形的影響，本實驗分別選取了 7、15、30、60rpm四個較低的轉速，研究轉速對纖維素成形 的影響。表1轉速對管狀材料成形的影響
轉速(rpm) 產生的剪切力 培養5天的管狀材料厚度(mm)
7小2-4
15較小1-430較小基本不成形60較大不能成形 由表1可知，在7rpm和15rpm時，管狀材料可以成形，而當增加到30rpm或者以上 的時候，管狀材料較難形成。當轉速為7rpm時，發酵過程中在生物反應器底部會有較多類似凝膠狀的纖維素形成，而在轉速為15rpm以及更高時形成較少。這是由于當轉速較慢時， 生物反應器內剪切力不足，導致纖維素聚集在一起，纖維素的聚集對于管狀材料的成形是 不利的。(3)材料處理將制備的空腔異形BC材料從模具上取下，蒸餾水多次沖洗后，然后浸泡于0. 5 2wt %的NaOH溶液中，70-100 V水浴處理30_120min，使BC管狀材料呈白色半透明后即可， 先用含0. 5mol/L的醋酸的水溶液洗滌4 5次，再用純水反復洗滌至中性，然后冷藏，即得 異形細菌纖維素產品。(4)管狀BC材料的表征A、管狀細菌纖維素的掃描電鏡觀察對冷凍干燥得到的樣品分別進行管外表面、管內表面、與管中心軸方向垂直截面 (橫截面)，沿管中心軸方向截面(縱截面)四個部分的掃描電鏡(SEM)觀察(圖6)。由管狀細菌纖維素的電鏡掃描照片可以看出，木醋桿菌動態合成的細菌纖維素與 靜態制備的膜一樣具有超微網絡結構，由高密度微纖維互相交聯形成。照片中顯示，外表面 具有相對規則的走勢，但不明顯。從圖(6A)中可以看到細菌纖維素的生長有向著某個方向 延伸的趨勢。在圖(6B)管狀細菌纖維素的內表面SEM照片中可以發現，纖維素的生長方向 基本無規律性，這個可能是前期細菌纖維素的生長主要是靠吸附生長在玻璃柱上，生長不 規則。由管狀細菌纖維素材料的橫截面和縱截面的電鏡照片(圖6C和6D)可以看出，纖維 素的生長具有明顯的規律性，纖維素向著某個方向交織生長，纖維素的每一層之間也有交 織，形成了一個空間立體的網狀結構，這個結果與靜態培養的管狀纖維素材料明顯不同，在 靜態培養下細菌纖維素的截面電鏡明顯出現分層現象。而本實驗的動態法制備的管狀材料 沒有出現分層。B、X-射線衍射分析采用日本RIGAKU公司X-射線衍射儀對靜態膜試樣和動態管試樣進行X-射線衍 射分析。經計算得靜態發酵制備的細菌纖維素膜的結晶度為86. 54%，動態發酵制備的細菌 纖維素管的結晶度為89. 36%。C、力學性能測定將制備得到的管狀細菌纖維素，利用萬能材料測試儀分別進行軸向和徑向的強力 測試。(A)軸向強力測試(圖7)將樣品切成4cm長的管狀，設定兩夾頭之間的夾距為3cm， 移動速率為lOOmm/min，測試機的探頭最大測定強力為ION。(B)徑向強力測試(圖7)將 樣品切成Icm長的管狀，采用兩個U型鐵絲(直徑為03mm)穿過BC管，設定兩夾頭之間的 夾距為5cm，移動速率為lOOmm/min。測試機的探頭最大測定強力為10N。圖8顯示反應器發酵制備的材料軸向強力隨著培養天數的增加不斷提高，這是由 于隨著培養天數的增加，細菌纖維素的厚度也會隨之增加，生成的纖維素的量也更多。通 過過程觀察可以發現，管狀材料的生長速率是隨著細菌纖維素在玻璃棒上的纏繞逐漸加快 的。在第一天時纖維素的纏繞量比較少，但是一天后，當玻璃棒上纏繞有一定量的細菌纖維 素時，細菌纖維素的生長明顯具有加快的趨勢，第二天纏繞的厚度明顯大于第一天，依次類 推，這可能是因為培養剛開始時，玻璃棒不利于纖維素的纏繞，而當玻璃棒上具有一些纖維 素時則纏繞變得容易，纏繞增厚速度也就變快。
11
圖9顯示徑向強力的變化規律與軸向強力結果具有一定的相似性。隨著培養天數 的增加管狀材料的徑向強力逐漸加強，而且后期材料強力的增加量相對于前期的要大，這 與前面提出的管狀材料隨著天數的增加，厚度的增加量明顯加大相一致。圖中N/g代表測 得的實際力與纖維素干重的比值。由于管狀材料的干重相對很小，只有不到10mg，所以相對 于干重的強力的變化就會相對比較大，導致了它的偏差也相對較大。實施例5(1)菌種培養將紅茶菌(kombucha)按接入1_10片直徑0. 5cm圓片含菌BC膜的接種量接 入300mL液體種子培養基(本實施例以下面培養基配方為例每IL水中，綠茶或者紅茶 I-IOg(茶葉5g時最優)，葡萄糖、蔗糖或者果糖10 200g、蛋白胨或者胰蛋白胨3g、酵母浸 膏5g，pH3. 0-7. 5，巴氏滅菌30min ；每IL水中，甘露醇、葡萄糖、蔗糖或果糖20_200g、蛋白 胨或胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g，pH3. 0-7. 5，121°C滅菌20min)擴培，于20_30°C、100_250r/ min條件下搖床培養或者靜置培養12 48h后備用；(2)中空異形細菌纖維素材料的發酵制備將步驟(1)制備的含生產菌株的液體培養基轉移到配備有棒狀模具的生物反應 器中，然后旋轉模具以IOrpm的轉速進行擾動培養，于30°C動態培養4_20天后，即可收獲空 腔異形纖維素材料；或者取步驟(1)活化好的菌種按1 10片直徑0. 5-lcm圓片含菌BC膜的接種 量轉接到300mL液體發酵培養基中，置于500mL錐形瓶中，在30°C和160rpm的條件下培養 4小時，然后再將發酵液轉移到生物反應器中，，然后旋轉模具以IOrpm的轉速進行擾動培 養，于30°C條件下分別培養不同的天數，可制備得到不同厚度的管狀細菌纖維素材料。該發酵裝置由一個水平攪拌反應器和在轉盤上固定若干手套形模具的轉軸組成， 形成了一個水平擾動的生物反應器。通過轉盤上模具圍繞著轉軸軸心的轉動，使得模具纏 繞發酵液中的細菌纖維素而在模具表面形成一定形狀的中空細菌纖維素材料。獲得的產品 與圖5中類似。(3)材料處理將制備的空腔異形BC材料從模具上取下，蒸餾水多次沖洗后，然后浸泡于0. 5 2wt %的NaOH溶液中，70-100 V水浴處理30_120min，使BC管狀材料呈白色半透明后即可， 用純水反復洗滌至中性，然后冷凍干燥，即得異形細菌纖維素產品。
權利要求
一種動態制備異型空腔細菌纖維素材料的裝置，包括溫度計口(1)，酸液堿液添加口(2)，把手(3)，通氣口(4)，pH計口(5)，營養補料口(6)，轉軸(8)，發酵罐(9)，馬達(10)，水浴裝置(11)，模具(12)，其特征是所述的轉軸(8)一端連接固定馬達(10)輸出軸，轉軸(8)另一端從發酵罐(9)一端面中心位置伸入發酵罐(9)內；在發酵罐(9)內的轉軸(8)上固定有模具。
2.根據權利要求1所述的一種動態制備異型空腔細菌纖維素材料的裝置，其特征是 所述的轉軸(8)在發酵罐(9)內腔安裝固定有轉盤(7)，轉軸(8)通過轉盤(7)圓周邊緣對 稱固定有2個以上模具(12)。
3.根據權利要求2所述的一種動態制備異型空腔細菌纖維素材料的裝置，其特征是 所述的模具(12)為棍形或手套形模具。
4.根據權利要求1所述的一種動態制備異型空腔細菌纖維素材料的裝置，其特征是 所述的模具(12)為手套形模具，其中手套形模具為依次在轉軸(8)上穿入1個以上手套形 模具。
5.根據權利要求1所述的一種動態制備異型空腔細菌纖維素材料的裝置，其特征是 所述模具(12)的橫截面形狀為圓形、方形、橢圓形、三角形、心形或五角星形。
6.根據權利要求1-5中任意一項所述的一種動態制備異型空腔細菌纖維素材料的裝 置，其特征是所述的模具(12)為實心或者中空結構。
7.根據權利要求1所述的一種動態制備異型空腔細菌纖維素材料的裝置，其特征是所 述的溫度計口(1)、酸液堿液添加口(2)、pH計口(5)、營養補料口(6)、通氣口(4)、把手(3) 均位于發酵罐(9)的外表面上。
8.根據權利要求1所述的一種動態制備異型空腔細菌纖維素材料的裝置，其特征在 于所述的發酵罐(9)為任意形狀。
9.根據權利要求1所述的一種動態制備異型空腔細菌纖維素材料的裝置，其特征是 所述的模具(12)的材料選自玻璃、陶瓷、紫砂、金屬、硅膠、木材、纖維素、橡膠、滌綸、尼龍、 奧綸、聚乙烯醇、聚乙烯乙醇、滌綸、特氟綸、膨體聚四氟乙烯、真絲、塑料中的一種或幾種組I=I O
10.一種動態制備異型空腔細菌纖維素材料的方法，包括(1)菌種培養將細菌纖維素生產菌株接入液體培養基擴培，于20-3(rC、100-250r/min條件下搖床 培養或者靜置培養12 48h后備用；(2)異型空腔BC材料的發酵制備將步驟(1)制備的含生產菌株的液體培養基轉移到上述發酵裝置中，然后旋轉模具以 3-20rpm的轉速進行擾動培養，于20 32°C動態培養4_20天后，即可收獲空腔異形纖維素 材料；(3)材料處理將制備的中空異形細菌纖維素材料從模具上取下，然后浸泡于0. 5 2襯％的NaOH溶 液中，70-100°C水浴處理30-120min，使細菌纖維素材料呈白色半透明后即可，然后洗滌至 中性，即得異形細菌纖維素產品。
11.根據權利要求10述的一種動態制備異型空腔細菌纖維素材料的方法，其特征在于所述步驟(1)中的BC生產菌株為醋酸菌屬(Acetobacter sp.)、葡萄糖酸桿菌屬 (Gluconobactersp.)、葡糖酸醋桿菌屬(Gluconacetobacter sp·)、根瘤菌屬(Rhizobium sp.)、八疊球菌屬(Sarcina sp.)、假單胞菌屬(Pseudomounas sp.)、無色桿菌屬 (Achromobacter sp·)、產喊菌屬(Alcaligenes sp·)、氣桿菌屬(Aerobacter sp·)、固氮 菌屬(Azotobacter sp·)、土壤桿菌屬(Agrobacterium sp·)、洋蔥假單胞菌(Seudomonas cepacia)、空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)或紅茶菌(kombucha)；其中優選菌株為木 醋桿菌(Acetobacter xylinum)或紅茶菌。
12.根據權利要求10或11所述的一種動態制 備異型空腔細菌纖維素材料的方法，其特征在于除紅茶菌以外的菌種按2 3接種環的接 種量接入液體種子培養基；紅茶菌按接入1-10片直徑0. 5cm圓片含菌BC膜的接種量接入 液體種子培養基；或者先制備生產菌的液體種子，再轉接入液體發酵培養基，具體步驟如下除紅茶菌以外的菌種按2 3接種環的接種量接入液體種子培養基制備種子液，然后 按3vol % 20vol %的接種量轉接到液體發酵培養基；紅茶菌按接入1-10片直徑0. 5cm圓 片含菌BC膜的接種量接入液體種子培養基，以及按1 10片直徑0. 5-lcm圓片含菌BC膜 的接種量轉接到液體發酵培養基。
13.根據權利要求10所述的一種動態制備異型空腔細菌纖維素材料的方法，其特征 在于所述的除了紅茶菌以外的液體種子培養基和液體發酵培養基的組分均為每IL水 中，甘露醇、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖或果糖20-200g、蛋白胨或胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g， pH3. 0-7. 5，121°C滅菌20min ；或甘露醇、葡萄糖、蔗糖或果糖20_200g，酵母浸膏5g，蛋白 胨或胰蛋白胨5g，檸檬酸115g，Na2HP042. 7g，水1L，ρΗ3· 0-7. 5，121°C滅菌20min ；紅茶菌 液體種子培養基和液體發酵培養基，其組成均為(1)每IL水中，綠茶或者紅茶I-IOg (茶 葉5g時最優)，葡萄糖、蔗糖或者果糖10 200g、蛋白胨或者胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g， pH3. 0-7. 5，巴氏滅菌30min ； (2)將葡萄糖、蔗糖或果糖、綠茶或紅茶、以及水配成培養基， 其中糖、茶、水的質量比為5 0.1-0.4 100-200，pH3. 0-7. 5，巴氏滅菌30min;或者(3) 每IL水中，甘露醇、葡萄糖、蔗糖或果糖20-200g、蛋白胨或胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g， PH3.0-7. 5，121°C滅菌20min ；其中，最優培養基為(1)的配方。
14.根據權利要求10所述的一種動態制備異型空腔細菌纖維素材料的方法，其特征在 于所述步驟(2)中的含生產菌株的液體培養基為步驟(1)制備的含生產菌株的液體種子 培養基或含生產菌株的液體發酵培養基。
15.根據權利要求10所述的一種動態制備異型空腔細菌纖維素材料的方法，其特征 在于在異型空腔BC材料的發酵制備的過程中，通過在轉軸或模具內腔中注入含氧量為 l-100vol%的空氣，以加速纖維素膜在模具上形成。
全文摘要
本發明涉及一種動態制備異型空腔細菌纖維素材料的裝置及方法，該裝置包括溫度計口，酸液堿液添加口，把手，通氣口，pH計口，營養補料口，轉軸，發酵罐，馬達，水浴裝置，模具；其制備包括將細菌纖維素生產菌株接入液體培養基擴培后，將其轉移到配備有特定形狀模具的發酵裝置中動態擾動培養，培養后即可收獲空腔異形纖維素材料。本發明制備的異型空腔BC材料不僅其尺寸和形狀是可控的，而且發酵裝置的模具可拆卸，重復使用，且制備方法簡便易行，成本低廉，生產效率高，適用于工業化生產；該異型空腔BC材料可廣泛應用于人工血管、神經纖維導管等中空器官的替代品，還可作為食品包裹材料如肉制品腸衣、果凍外衣等。
文檔編號C12R1/065GK101914434SQ201010271720
公開日2010年12月15日 申請日期2010年9月2日 優先權日2010年9月2日
發明者楊光, 楊雪霞, 洪楓 申請人:東華大學