專利名稱：高產γ-氨基丁酸的大腸桿菌菌株及其γ-氨基丁酸生產方法
技術領域：
本發明涉及一種高產Y-氨基丁酸大腸桿菌ZS-07菌株及其γ-氨基丁酸的微生 物、酶法制備方法，屬于生物化學領域。
背景技術：
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，簡稱GABA)是廣泛存在于自然界的非蛋 白質氨基酸，是中樞神經系統重要的抑制性神經遞質。大腦長期缺乏GABA將會導致癲癇、 帕金森等疾病。同時，GABA還與腦衰老有關，其缺乏將導致老年人“耳不聰，目不明”。因 此，GABA不僅具有安神和抗抑郁作用，而且還能增強腦功能和長期記憶。近年，隨著人們對 GABA生理活性研究的不斷深入，發現其生理功能極其廣泛。例如可增加生長激素分泌，防止 肥胖，健肝利腎，改善更年期綜合征，抑制大腸癌變，改善脂質代謝，促進精子的穿卵能力， 提高受精率，以及提高飼料利用率和日增重等。雖然GABA可由腦部的谷氨酸在專一性較 強的谷氨酸脫羧酶作用下轉化而成，但是年齡的增長和精神壓力的加大等諸多因素使GABA 的積累異常困難，而通過日常飲食補充可有效改善這種狀況，從而促進人體健康。GABA在臨 床上常用于降低人體的血氨，治療各種類型的肝昏迷，同時又被廣泛地用于治療各種腦疾 病，還可以作為兒童智力的營養補充劑和促進劑，老年人的營養劑。GABA正被廣泛應用于醫 藥、食品保健、化工及農業等行業。GABA天然存在量很低，因此很難從天然組織中大量提取分離。目前，Y-氨基丁 酸的生產方法有化學合成法、植物富集法和生物合成法。化學合成法受到苛刻的反應條件 及昂貴的天然原料的限制，成本高、安全性差。植物富集法含量低，尚無法用作醫藥、醫藥中 間體和食品添加劑。與化學合成法相比，生物法合成GABA的主要優點是條件溫和、不需要 昂貴的原料，能耗低。其原理是利用生物體的谷氨酸脫羧酶作為催化劑，以L-谷氨酸為底 物，將L-谷氨酸α-脫羧，產生Y-氨基丁酸和C02。由于微生物具有生長速度快、條件簡 單、代謝過程特殊等特點，因此利用微生物生產GABA不受資源、環境和空間的限制，具有顯 著的優勢。篩選出具有高谷氨酸脫羧酶活力的優良菌株是利用微生物合成GABA的關鍵之
ο目前，在已有的利用不同種屬微生物生產GABA的報道中，利用大腸桿菌的效率相 對較高。吳曉燕等(化工進展，2005,8 889-892)利用大腸桿菌Asl. 505，以DL-谷氨酸為 底物，15h內完全轉化50g/LDL-谷氨酸形成D-谷氨酸和GABA。李永豐等(華東化工學院 學報，1981，2:7-11)用海藻酸鈉-戊二醛法固定產谷氨酸脫羧酶的大腸桿菌Asl. 505，在 pH4. 0的0. 2M醋酸緩沖液中，5h轉化5%的谷氨酸合成GABA。趙景聯等(生物工程學報， 1989,2:124-128)用海藻酸鈣包埋法制成固定化大腸桿菌細胞，與1 %谷氨酸溶液進行間 歇反應，5h轉化率達100%。張汝平等(長沙電力學院學報自然科學版，1998,4:433-435) 用海藻酸鈣包埋法制備的大腸桿菌固定化細胞，對后道味精母液提取谷氨酸后的廢液進行 轉化生產GABA，獲得的GABA純度達98. 94%，收率為49. 65%。Wang和Su利用Monascuspurpureus進行固體發酵，GABA含量分別達5004mg/kg和1200mg/kg。利用乳酸菌富集或 發酵生產GABA的報道也有很多，徐冬云等(現代食品科技，2006，3 :59-61，64)篩選出產 Y-氨基丁酸的乳酸菌，發酵樣品中GABA的含量達0.463g/L。Nomura等(J Dairy Sci., 1998,81:1486-1491)從生產奶酪的菌株中分離到一株Lactococcus Iactis 01-7，生產的 奶酷中 GABA 含量達至Ij了 383mg/kg。Yokoyama 等(J of Bioscience and Bioengineering, 2002,1:95-97)利用 Lactobacillus brevis IF0-12005 對酒糟進行發酵，GABA 含量達到 了 10. 18mM。許建軍等(博士學位論文，江南大學，2004年2月)篩選到了高產GABA的 Lactococcus Iactis菌株，25L罐發酵72h，GABA達到了 2. 5g/L。劉清等(氨基酸和生 物資源，2004，1 :40-43)也進行了高產GABA乳酸菌篩選和發酵條件優化，發酵液中GABA 達 3. lg/L。愛宕世高等(食品科學，2001，8，81-85)采用 Lactobacillus ρIantarum 利 用含有米糠抽提液的培養基發酵生產GABA，干粉中含量達到了 5%。Takahashi等(J of Bioscience andBioengineering, 2004,6 :412_418)蹄選至Ij Sacharomyces cerevisiae UT-I的GABA轉氨酶和琥珀酸半醛脫氫酶缺陷突變型菌株GAB7-1和GAB7-2，其發酵液中 GABA濃度分別達到了 0.4mM和0.42mM，較野生株分別提高了 2.0和2.1倍。崔曉俊等(食 品工藝，2005，6 64-69)利用乳酸菌SK005在含9. 5g/L谷氨酸單鈉的培養基中于30°C發酵 2天，GABA產量達5.4g/L。陸兆新等(CN 1710088A)公開了利用唾液鏈球菌嗜熱亞種生產 GABA。梅樂和等(CN 1683545A，CN 1683544A, CN1673351A)公開了控制 pH 發酵生產 γ-氨 基丁酸的方法，其利用短乳桿菌(Lactobacillus brevis)控制pH發酵40_60h，GABA的產量 為30g/L。江波等(CN 1392262)公開了一種食品功能因子Y _氨基丁酸的制備方法，GABA 在發酵液中的濃度達3-5g/L。焦慶才等(CN200410064813. 3)公開了一種Y-氨基丁酸的 酶法轉化制備方法，將Escherichia coli ASl. 505的菌體細胞與含有L-谷氨酸和L-天冬 氨酸混合物的轉化液混合，28-45°C下進行酶促反應，然后用等電點結晶或等電點結晶與離 子交換樹脂相結合的方法分離轉化產物，得到高純度的Y-氨基丁酸和L-天冬氨酸。蔣冬 花等(微生物學雜志，2007，1 :35-39)從酸菜中篩選到2株高產Y -氨基丁酸的乳酸菌，經 條件優化后發酵液中GABA含量可達4g/L。已有的關于大腸桿菌谷氨酸脫羧酶的研究主要是針對酶的結構、功能及表達調控 等方面。已公開的利用大腸桿菌的谷氨酸脫羧酶制備GABA的專利和非專利文獻結果，存在 酶活力不高，反應周期長，反應液中產物濃度低等問題。因此，篩選高酶活菌株實現Y-氨 基丁酸的工業化生產是目前市場所急需。
發明內容
本發明目的在于提供一種高產Y-氨基丁酸的大腸桿菌ZS-07菌株及其生產 Y-氨基丁酸的方法。本發明通過篩選得到一菌株，該菌株經形態特征、生理生化特征、生態特征比對及 16SrDNA序列測序，鑒定為大腸桿菌(拉丁文名稱Escherichia coli)菌株。序列表中序列 1為大腸桿菌(拉丁文名稱E. coli)ZS-07菌株16SrDNA序列；序列2為大腸桿菌菌株(拉 丁文名稱E. coli)ZS-07gadA ；序列3為大腸桿菌菌株(拉丁文名稱E. coli) ZS-07gadB序 列。本發明通過如下原理實現發明目的將本發明篩選得到的大腸桿菌ZS-07菌株或其谷氨酸脫羧酶作用于L-谷氨酸或L-谷氨酸鹽以及含L-谷氨酸或L-谷氨酸鹽的物質， 使L-谷氨酸或L-谷氨酸鹽發生脫羧反應生成Y-氨基丁酸。利用該菌株采用微生物法或 酶法生產Y-氨基丁酸，通過如下多種形式進行1、接種CGMCC No. 3562大腸桿菌ZS-07菌株的斜面培養物于種子培養基中， 35-39°C震蕩培養6-9h制備種子液；在發酵培養基中，加入0-0. lmmol/L磷酸吡哆醛，接 種相當于發酵培養基重量3-12%的種子液；35-41°C通氣培養8-14h，于結束前0. 5_lh降 低pH至3. 5-3. 8，加入L-谷氨酸、L-谷氨酸鹽或DL-谷氨酸、DL-谷氨酸鹽；加酸控制pH 3.2-5.0，35-431繼續震蕩培養0. l_120h，即得含Y-氨基丁酸的發酵液。2、接種CGMCC No. 3562大腸桿菌ZS-07菌株的斜面培養物于種子培養基中， 35-39°C震蕩培養6-9h制備種子液；在發酵培養基中，加入0-0. lmmol/L磷酸吡哆醛，接種 相當于發酵培養基重量3-12%的種子液；35-41°C通氣培養8-14h，于結束前0. 5_lh降低 PH至3. 5-3. 8，收集菌體，加入含L-谷氨酸、L-谷氨酸鹽或DL-谷氨酸、DL-谷氨酸鹽的轉 化液，加入0-2. Ommol/L磷酸吡哆醛，加酸控制pH 3. 2-5. 0，35_43°C震蕩轉化0. l_96h，得 到含Y-氨基丁酸的轉化液。3、利用CGMCC No. 3562大腸桿菌ZS-07菌株培養制得的菌體或由其提取的谷氨 酸脫羧酶通過固定化后，加入含L-谷氨酸、L-谷氨酸鹽或DL-谷氨酸、DL-谷氨酸鹽的轉 化液，加入O-lOmmol/L磷酸吡哆醛，加酸控制pH 3. 2-5. 0，35_43°C反應0. l_120h，得到含 Y-氨基丁酸的轉化液。反應的底物可以是純品DL-谷氨酸、純品L-谷氨酸、純品L-谷氨酸鹽或純品DL 谷氨酸鹽，也可以是谷氨酸生產過程中各環節產生的含有DL谷氨酸或L-谷氨酸的粗品或 結晶母液；加入量為0. 5-450g/L ；加入方法可為一次性添加或分批次添加。上述方法還可以采用減壓操作，加速反應進行，得到含Y-氨基丁酸的轉化液。培養CGMCC No. 3562大腸桿菌ZS-07菌株所用的斜面培養基、種子培養基和發酵 培養基碳源可以采用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、木糖、乳糖、海藻糖、甘油、各類淀粉水解糖或其 混和物，其濃度為l_30g/L。氮源可以采用酵母膏、酵母粉、酵母提取物、玉米漿、蛋白胨、牛 肉膏、豆餅粉、尿素或其混合物，濃度為l_30g/L。本發明的優勢在于利用高滲條件篩選獲得了一株谷氨酸脫羧酶活力高的大腸桿 菌E. coli ZS-07菌株CGMCC No. 3562，酶合成無需誘導，酶活力高(見附圖1、表1)，菌株 耐酸能力強(見附圖2、表2)，耐高濃度的底物和產物。利用其可生產高含量的Y-氨基丁 酸，反應體系簡單，提取工藝可大為簡化，生產成本大幅降低。經上述方法得到的轉化液中 谷氨酸轉化率達到100%，GABA濃度最高可達到315g/L。本發明研究人員給昆明小鼠灌喂 CGMCC No. 3562菌株的培養物(0. 2 X IO11Cfu/只)，未發現小鼠有任何不良反應。因此，利 用該菌株生產Y-氨基丁酸無安全隱患。另外，利用CGMCC No. 3562培養制得的菌體或谷 氨酸脫羧酶催化DL-谷氨酸中的L-氨基酸形成Y-氨基丁酸，經進一步分離Y-氨基丁酸 和D-谷氨酸，可同時獲得了光學純度大于98%的D-谷氨酸。本發明篩選得到的大腸桿菌(拉丁文名稱E. coli) ZS-07菌株，已于2009年12月 31號保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區北辰西路1號 院3號)，保藏編號為CGMCC No. 3562。
圖1不同E. coli菌株合成GABA能力比較；實驗條件LB培養基，L-谷氨酸添加 量為 30g/L ；菌濃 4. 6X10lclcfu/mL，41°C ；圖中一為 ZS-07 菌株 CGMCC No. 3562，一為 DH5 α 菌株，一為BL-21菌株。圖2不同Ε. coli菌株最適ρΗ比較；實驗條件2mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液反應 體系，菌濃 1. SxiO11CfuAiLdlt:振蕩反應 30min ；其中圖 a 為 ZS-07 菌株 CGMCC No. 3562 轉化率隨PH變化曲線(L-Glu添加量為30g/L)；圖b為DH5 α菌株轉化率隨ρΗ變化曲線 (L-谷氨酸添加量為12g/L)；圖c為BL-21菌株轉化率隨ρΗ變化曲線(L-谷氨酸添加量為 12g/L)。
具體實施例方式為對本發明進行更好地說明，舉實施例如下實施例1CGMCC No. 3562E. coli ZS-07菌株經斜面培養基活化后，轉接于種子培養基， PH7.0-7.8，于37°C震蕩培養6-9h后，以3-12%的接種量接種至發酵培養基，ρΗ 7.0-7.8， 370C，220r/min,震蕩培養8_14h后，于結束前0. 5_lh降低ρΗ至3. 5-3. 8，獲得含菌體的發 酵液，4000r/min離心分離收集菌體。以相當于原發酵液體積的1/2倍的水重懸菌體，每 IOOmL菌懸液先加入L-谷氨酸15g，加入磷酸吡哆醛0. lmmol/L，用鹽酸或硫酸控制ρΗ為 3. 5-3. 8，41°C震蕩反應，當無不溶底物存在時，補加底物L-谷氨酸15g/100mL。約反應20h 時，加入磷酸吡哆醛0. lmmol/L，再補加底物L-谷氨酸15g/100mL，補加菌體(由相當于轉 化液體積1/2倍量的發酵液制備)，繼續反應，至底物轉化完全。離心即得到含Y-氨基丁 酸的反應液，轉化率達100%。斜面培養基酵母提取物5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂粉 15g，水IL ；種子培養基酵母提取物5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，葡萄糖lg，水IL ；發酵培養 基酵母提取物 3g，蛋白胨 10g, NaCl 5g，葡萄糖 5g，Na2CO3O. 742g，NaHC037. 812g，水 IL0實施例2CGMCC No. 3562E. coli ZS-07菌株經斜面培養基活化后，轉接于種子培養基，于 37°C震蕩培養6-9h后，以3-12%的接種量接種至含有磷酸吡哆醛(0. 02mmol/L)的發酵 培養基中，PH7. 0-7. 8，37 °C震蕩培養8_14h，于培養結束前0. 5_lh降低ρΗ至3. 5-3. 8，每 IOOmL發酵液加入28g L-谷氨酸，用鹽酸或硫酸控制ρΗ為3. 5-3. 8，繼續震蕩或攪拌至底 物完全轉化，離心即得到含Y-氨基丁酸的反應液，轉化率可達100%。實施例3CGMCC No. 3562E. coli ZS-07菌株經斜面培養基活化后，轉接于種子培養基， PH7. 0-7. 8，于37°C震蕩培養6_9h后，以3_12%的接種量接種至發酵培養基，pH7. 0-7. 8， 37°C，220r/min,震蕩培養8_14h后，于培養結束前0. 5_lh降低ρΗ至3. 5-3. 8，獲得含菌體 的發酵液，4000r/min離心分離收集菌體。以相當于原發酵液體積的1/2倍的ρΗ為3. 5的 醋酸_醋酸鈉緩沖液重懸菌體，每IOOmL菌懸液加入L-谷氨酸鈉5g，用鹽酸或硫酸控制ρΗ 為3. 5-3. 8，41°C震蕩反應至底物完全轉化，離心即得到含Y-氨基丁酸的反應液，轉化率 達100%。GABA純度達到國家規定醫藥級標準。實施例4
CGMCC No. 3562E. coli ZS-07菌株經斜面培養基活化后，轉接于種子培養基， PH7.0-7.8，于37°C震蕩培養6-9h后，以3-12%的接種量接種至發酵培養基，pH 7.0-7.8， 370C，220r/min,震蕩培養8_14h，于結束前0. 5_lh降低pH至3. 5-3. 8，獲得含菌體的發酵 液，4000r/min離心分離收集菌體。加磷酸吡哆醛(0. 05mmol/L)，每IOOmL菌懸液中加入 DL-谷氨酸30g (分2次加入，每次150g/L)，用鹽酸或硫酸控制pH為3. 5-3. 8，41°C震蕩至 反應完全，離心即得到含Y -氨基丁酸和D-谷氨酸的反應液，調整pH為3. 2，溫度4-6°C， 攪拌，使D-谷氨酸結晶析出，用pH 3. 2的水洗滌結晶。含有少量D-谷氨酸和Y-氨基丁 酸的結晶母液進一步通過離子交換樹脂分離。獲得Y-氨基丁酸的同時獲得了 D-谷氨酸。實施例5CGMCC No. 3562E. coli ZS-07菌株經斜面培養基活化后，轉接于種子培養基， PH7.07.8，于37°C震蕩培養6-9h后，以3-12%的接種量接種至發酵培養基，pH 7.0-7.8， 370C，220r/min,震蕩培養8_14h后，于結束前0. 5_lh降低pH至3. 5-3. 8，獲得含菌體的發 酵液，4000r/min離心分離收集菌體。以相當于原發酵液體積的1/2倍的水重懸菌體，加磷 酸吡哆醛(0. 05mmol/L)，每IOOmL菌懸液加入L-谷氨酸粗品25g，用鹽酸/硫酸控制pH為 3. 5-3. 8，40°C震蕩，抽真空減壓反應至底物完全轉化，離心即得到含、-氨基丁酸的反應 液，轉化率達100%。實施例6CGMCC No. 3562E. coli ZS-07菌株經斜面培養基活化后，轉接于種子培養基， PH7.0-7.8，于37°C震蕩培養6-9h后，以3-12%的接種量接種至發酵培養基，pH 7.0-7.8， 370C，220r/min,震蕩培養8_14h后，于結束前0. 5_lh降低pH至3. 5-3. 8，獲得含菌體的發 酵液，4000r/min離心分離收集菌體。用pH 4. 0的醋酸緩沖液重懸，加入2%的海藻酸鈉， 混勻，4°C靜止Ih后用注射器針頭滴加0. IM的CaCl2于溶液中，制備固定化細胞，每升反應 液添加磷酸吡哆醛0. 05mmol, L-谷氨酸或L-谷氨酸鈉100g，控制pH 3. 8和溫度39°C，反 應至底物完全轉化，可得含Y-氨基丁酸的反應液，轉化率最高達100%。E. coli ZS-07菌株利用細胞轉化法合成GABA與有關文獻結果比較見表1表 權利要求
一種高產γ 氨基丁酸的大腸桿菌ZS 07菌株，其特征為該菌株(拉丁文名稱Escherichia coli)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.3562。
2.如權利要求1所述的高產Y-氨基丁酸的大腸桿菌ZS-07菌株，其特征為該菌株 具有如序列1所示的16SrDNA序列。
3.如權利要求1所述的高產Y-氨基丁酸的大腸桿菌ZS-07菌株，其特征為該菌株 具有如序列2、3所示的gadA、gadB序列。
4.一種利用CGMCC No. 3562大腸桿菌ZS-07菌株生產Y -氨基丁酸的方法，其特征為 通過如下步驟實現接種CGMCC No. 3562大腸桿菌ZS-07菌株的斜面培養物于種子培養基 中，35-39°C震蕩培養6-9h制備種子液；在發酵培養基中，加入0-0. lmmol/L磷酸吡哆醛，接 種相當于發酵培養基重量3-12%的種子液；35-41°C通氣培養8-14h，于結束前0. 5_lh降 低pH至3. 5-3. 8，加入L-谷氨酸、L-谷氨酸鹽或DL-谷氨酸、DL-谷氨酸鹽；加酸控制pH 3.2-5.0，35-431繼續震蕩培養0. l_120h，即得含Y-氨基丁酸的發酵液。
5.一種利用CGMCC No. 3562大腸桿菌ZS-07菌株生產Y -氨基丁酸的方法，其特征為 通過如下步驟實現接種CGMCC No. 3562大腸桿菌ZS-07菌株的斜面培養物于種子培養基 中，35-39°C震蕩培養6-9h制備種子液；在發酵培養基中，加入0-0. lmmol/L磷酸吡哆醛，接 種相當于發酵培養基重量3-12%的種子液；35-41°C通氣培養8-14h，于結束前0. 5_lh降低 PH至3. 5-3. 8，收集菌體，加入含L-谷氨酸、L-谷氨酸鹽或DL-谷氨酸、DL-谷氨酸鹽的轉 化液，加入0-2. Ommol/L磷酸吡哆醛，加酸控制pH 3. 2-5. 0，35-43°C震蕩轉化0. l_96h，得 到含Y-氨基丁酸的轉化液。
6.一種利用CGMCC No. 3562大腸桿菌ZS-07菌株生產Y -氨基丁酸的方法，其特征為 通過如下步驟實現利用CGMCC No. 3562大腸桿菌ZS-07菌株培養制得的菌體或由其提取 的谷氨酸脫羧酶通過固定化后，加入含L-谷氨酸、L-谷氨酸鹽或DL-谷氨酸、DL-谷氨酸鹽 的轉化液，加入O-lOmmol/L磷酸吡哆醛，加酸控制pH 3. 2-5. 0，35_43°C反應0. l_120h，得 到含Y-氨基丁酸的轉化液。
7.如權利要求4-6任何一種利用CGMCCNo. 562大腸桿菌ZS-07菌株生產Y -氨基丁 酸的方法，其特征為采用減壓操作，得到含Y-氨基丁酸的轉化液。
8.如權利要求4-6任何一種利用CGMCCNo. 3562大腸桿菌ZS-07菌株生產Y -氨基丁 酸的方法，其特征為反應的底物是純品L-谷氨酸、純品L-谷氨酸鹽或純品DL-谷氨酸、純 品DL谷氨酸鹽，或是谷氨酸生產過程中各環節產生的含有L-谷氨酸或DL谷氨酸的粗品或 結晶母液；加入量為0. 5-450g/L ；加入方法可一次性加入或分批次添加。
全文摘要
本發明公開了一株安全、高產γ-氨基丁酸的大腸桿菌(Escherichia coli) ZS-07菌株以及利用其合成γ-氨基丁酸的方法，屬生物化學領域。該大腸桿菌菌株保藏編號為CGMCC No.3562，利用其含有的谷氨酸脫羧酶，作用于L-谷氨酸、L-谷氨酸鹽或含L-谷氨酸或L谷氨酸鹽的物質，合成γ-氨基丁酸。本發明菌株谷氨酸脫羧酶活力高、耐酸性強，反應條件溫和，副產物少，方法簡單，易于操作，成本低，生產效率高。產品純度高，可用于化工、食品、飼料及醫藥等行業。
文檔編號C12P13/00GK101974455SQ20101029471
公開日2011年2月16日 申請日期2010年9月28日 優先權日2010年9月28日
發明者吳健, 周新欽, 戴桂馥, 李季倫, 王衛富, 王廷, 王春陽, 蔣盛耀, 譚印成, 馬文艷 申請人:鄭州大學